Een protocol om de morfologische veranderingen van Clostridium difficile In reactie op Antibiotische Behandeling

Summary

De werkzaamheid van antibiotica wordt meestal bepaald door het uitvoeren van dodingskinetische studies en het meten van kolonievormende eenheden (CFU's). Door rasterelektronenmicroscopie (SEM) te integreren met deze standaardmethoden, kunnen we de farmacologische effecten van behandeling tussen verschillende antibiotica onderscheiden.

Abstract

Beoordeling van antibiotische werking met nieuwe geneesmiddelontwikkeling gericht op anaërobe bacteriën is moeilijk en technisch veeleisend. Om inzicht te krijgen in mogelijke MOA, kunnen morfologische veranderingen in verband met de blootstelling aan antibiotica worden gedetecteerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Het integreren van SEM imaging met traditionele kill curves kan ons inzicht in drugsactie verbeteren en het drugontwikkelingsproces bevorderen. Om dit uitgangspunt te testen werden dodenkrommen en SEM-studies uitgevoerd met behulp van geneesmiddelen met bekende maar verschillende MOA (vancomycine en metronidazool). C. difficiele cellen (R20291) werden tot 48 uur met of zonder aanwezigheid van antibiotica gegroeid. Gedurende het 48 uur interval werden cellen verzameld op meerdere tijdspunten om de doeltreffendheid van antibiotica te bepalen en voor beeldvorming op de SEM. In overeenstemming met eerdere verslagen had vancomycine en metronidazole significante bactericide activiteit na 24 uur behandeling zoals gemeten door kolonievormende eenheid (CFU) landenting. Met behulp van SEM beeldvorming bleken we dat metronidazol significante effecten op cellengte had (> 50% reductie in cellengte voor elk antibioticum, P <0,05) in vergelijking met controles en vancomycine. Hoewel de fenotypische respons op medicijnbehandeling niet eerder op deze wijze is gedocumenteerd, zijn ze consistent met de MOA van het geneesmiddel, die de veelzijdigheid en betrouwbaarheid van de beeldvorming en metingen en de toepassing van deze techniek voor andere experimentele verbindingen aantoont.

Introduction

Clostridium difficile is een gram positieve , spore-vormende bacterie, die jaarlijks ongeveer 500.000 infecties veroorzaakt in de VS en wordt beschouwd als een dringend ziekteverwekkend patiënt door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), het hoogste risico. ¹ Het afgelopen decennium heeft aanzienlijke drugontwikkeling in antimicrobiële stoffen met activiteit tegen C. difficile gezien . ^{2 , 3} In vitro studies zijn een noodzakelijk onderdeel van het geneesmiddelontwikkelingsproces. ⁴ Traditioneel worden in vitro gevoeligheids- en tijddodenstudies gebruikt om toekomstige dieren en andere in vivo studies te valideren.

Hoewel deze methoden een belangrijke rol spelen bij het evalueren van doden, nemen ze de fenotypische reactie van de cellen niet op de farmacologische behandeling vast. Door scanning elektronenmicroscopie (SEM) op te nemen met standarD doden van kinetische studies, is een meer grondige karakterisering van de antibiotische directe effecten mogelijk. ^{5 , 6 , 7} Hier presenteren wij een methode waarbij SEM gebruikt wordt als middel om de werkzaamheid van antibioticabehandeling te profileren.

Protocol

1. Isolatie van C. difficile uit verschillende milieu- of klinische bronnen

1. Milieuisolaten: Gebruik een voorgesteriliseerd katoenmeter (licht bevochtigd met 0,85% NaCl), snijd het oppervlak van een bezienswaardigheid (vloer, deur, handvat, plank, enz. ). ⁸ Zorg ervoor dat u steriele handschoenen draagt ​​en de doek in een gesteriliseerde buis plaatst nadat u klaar bent.
2. Klinische isolaten (ontlasting): Plaat 10 tot 100 mg klinische ontlastingmonsters op cefoxitine-cycloserine-fructose-agar (CCFA) met een inentingslus en incuberen onder strikte anaërobe omstandigheden gedurende 48 - 72 uur. Bewaar geïsoleerde kolonies van C. difficile voorraad in cryovials bij -80 ° C voor verdere analyses. ^{7 , 9 , 10}
3. Verrijk de zuivelmonsters in de hersenhart infusie (BHI) bouillon met 0,05% natriumtaurocholaat en plaats in een anaërobe kamer bij 37 ° CVoor 5 dagen. Centrifugeer 1 ml van de kweek bij 10.000 xg en resusteer de pellet in 100 μl ethanol.
4. Platte de geresuspendeerde cellen (50 μl) op cycloserinecefoxitine fructose agar (CCFA) platen en incubeer gedurende 40-48 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C. Bewaar geïsoleerde kolonies van C. difficile voorraad in cryovials bij -80 ° C voor verdere analyses.
5. Test verdachte C. difficile kolonies met behulp van het latexagglutineringsreagens of PCR.

2. Culturing C. difficile en Killing Kinetische Procedures

1. Groei gezuiverde milieu- of klinische C. difficile stammen op bloedagarplaten in een anaërobe kamer bij 37 ° C gedurende 48 uur.
2. Neem één geïsoleerde kolonie met een inoculatielus, zet het over in 5 ml BHI-medium in een 15 ml buis en groei gedurende 24 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C.
3. Verdun de pre-culturen 1: 100 tot ongeveer 10 ⁶ kolonievormende eenheidS (CFU) / ml in vers voorverdiend BHIS (BHI plus 5 g / l gist extract en 1% L-cysteïne) aangevuld met 0,1% natriumtaurocholaat en de juiste concentratie antibiotica (T0).
4. Verzamel een 1 ml monster met een pipet op elk tijdstip (T0, T6, T24, T48) en plaat / verspreid een kleine aliquot (100 μL in seriële verdunningen) op een bloedagarplaat. Laat de cellen op 48 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C groeien en tel het resulterende aantal kolonies om CFU te bepalen.

3. Het voorbereiden van monsters voor het scannen van elektronenmicroscopie

1. Verzamel 1 ml cellen van elk tijdstip in microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en wascellen in PBS.
2. Centrifugeer de monsters opnieuw bij 10.000 xg gedurende 10 minuten en wrijf de supernatant af. Re-verdunde cellen in 1 ml 4% paraformaldehyde en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. Centrifugeer de monsters opnieuw gedurende 10 minuten bij 10,000 xg en weggooien supernatant. Was cellen tweemaal met gedestilleerd water en roer in 100 μl gedestilleerd water. Pas volume aan, afhankelijk van de troebelheid van de oplossing.
   OPMERKING: Het maken van meerdere seriële verdunningen is een goed idee.
4. Etiket deksels en voeg 40 μL van het monster erop. Incubeer gedurende 15 minuten in een debiet om de vloeistof te verdampen en laat de cellen aan de deklaag kleven. Als er nog vloeistof aanwezig is, gebruik een ventilator om de vloeistof te verwijderen.
5. Plaats gelabelde dekglazen met cellen in een bureau spuitmachine en tape omlaag. Zet puur goud in de sputtermachine. Zet de machine aan en begin met sputteren bij lage druk (50 mTorr). Coatcellen gedurende 30 s bij 80 mA, die vertaalt naar 20 nm goudcoating.
6. Overdracht gecoate cellen naar de aftast elektronenmicroscoop.

4. Imaging C. difficile cellen op een scanning elektronenmicroscoop

1. Haal de aftastelektronmicroscoop (SEM) goed uit door prDe ventilatieknop op de computersoftware.
2. Bevestig de bekledde deklagen op de metalen trap met behulp van koolstofband. Zodra de SEM is afgevoerd, dient de deur gemakkelijk te openen. Sluit de metalen trap in de SEM-kamer door erin te schroeven.
3. Klik op de POMP knop op de computer software. De SEM zal bruikbaar zijn als het systeem "Vac OK" leest.
4. Klik op de SE-detector onder het detectors tabblad. Zet de balk aan door op de knop die de spanning geeft, te klikken. Start afbeelden bij een lagere spanning (5 kV) alvorens de spanning te verhogen (tot 15 kV). Een afbeelding verschijnt nadat de balk is ingeschakeld.
5. Met behulp van de tracking functie, zoek een gebied op de bekledde coverlips naar de afbeelding. Zoom in de regio en vind staafvormige structuren; Dit zijn clostridium difficile .
6. Zoom in en focus op de afbeelding om het systeem te kalibreren. Dit dient op meerdere werkafstanden te gebeuren: 15, 9 en 5 mm. Beeld op een werkafstand van 5 mm.
7. Schakel de u aanLtra hoge resolutie beeldvormingsmodus en begin astigmatisme te concentreren en optimaliseren.
8. Begin met hoge vergroting te concentreren. Gebruik hiervoor de grove en fijne focus. Pas het astigmatisme ook aan om een ​​duidelijker beeld te krijgen.
   1. Verstel astigmatisme bij hoge vergroting. Om dit te doen, pas de astigmatismewissels aan (ze lijken op de fijne / grove focuswisseling) en controleer het beeld voor de duidelijkheid door digitaal in te zoomen op de computersoftware.
9. Zie de slow scan functie om een ​​hoge kwaliteit afbeelding te verzamelen. Sla de verzamelde afbeelding op als een .TIFF-bestand, dat gebruikt wordt voor analyse. Zorg dat de gegevensbalk geselecteerd is als er tijdens de analyse metingen worden gemeten.
10. Verzamel beelden op verschillende hoeken (tot 52 ° door de hoek direct op de SEM te draaien. Hoekige beelden geven de nadere informatie meer informatie weer.
11. Verander de bundelspanning afhankelijk van de cellen die worden afgebeeld. Houd dit meestal tussen 5 - 15 kV voor alle experimenten.
12. Nadat de beeldvorming is voltooid, zet u de balk uit en verhoog de werkafstand tot 20 mm. De kamer kan dan worden afgezet en het podium kan worden verwijderd. Kopieer alle beelden op een drive voor verdere analyse.

5. Beeldverwerking en analyse

1. Download en installeer de vrij beschikbare software, FIJI (http://fiji.sc), naar de computer.
2. Open het beeldbestand in FIJI.
3. Gebruik de lijnfunctie om de schaalbalk nauwkeurig op te sporen.
4. Klik op het tabblad Analyse in het FIJI-programma en kies uiteindelijk de Select Scale-functie. Er verschijnt een venster dat de instelling van de bekende afstand vereist op basis van de schaalbalk. Verander ook de lengte-eenheid en klik op OK.
5. Nu het programma voor afstand is gekalibreerd, gebruik dan de lijnfunctie om de cellengte te meten. Om de lengte te verkrijgen, gebruik de lijnfunctie om de cel in zijn geheel te traceren. Selecteer het tabblad Analyse opnieuw en klik vervolgens op Maat. De lengte moet ca.Oor in de eerder genoemde eenheden.

Results

Clostridium difficile is een sporenvormende bacterie en daarom is het essentieel om de morfologische verschillen tussen vegetatieve en sporencellen voorafgaand aan elke functionele analyse te bepalen. Figuur 1 toont representatieve afbeeldingen van vegetatieve cellen die werden opgenomen tijdens de exponentiële fase van de groeicurve en de sporencellen. Zoals afgebeeld, zijn vegetatieve cellen lange, gladde, staafvormige structuren, terwijl sporen kleine, ovale ...

Discussion

Het doel van de huidige studie was het creëren van een high-throughput methode voor het isoleren van C. difficile en het testen van antibiotica gevoeligheid met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) als middel om een ​​meer grondige karakterisering van de farmacologische werking van het antibiotica. Met behulp van de hierin beschreven protocollen hebben we aangetoond dat beeldvorming van de fenotypische reactie van de cel op antibiotische behandeling inzicht kan geven in de farmacologische werking van...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
katoengaas	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
50 mL buisjes	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteïne	Alfa Aesar	A10389
gistextract	Criterion	C741
natriumtaurocholaat	Alfa Aesar	A18346
anaerobe kamer	Coy		vinyl anaerobe kamer
cycloserinecefoxitine fructose agar (CCFA) platen	Anaerobe systems	AS-213
bloedagar platen	Hardy diagnostics	A-10
latex agglutinatiereagens	Oxoid	DR1107A	C. diff testkit
microcentrifugebuisjes	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	50-259-98
microscoopglaasjes	J. Melvin freed brand	7525M	75 x 25mm
afzuigkap	Labconco	Class II type A2	bioveiligheidskast
bureausputterapparaat	Denton Vacuum	Desk II
tape	Plastic Core	05072-AB	SPI dubbelzijdig koolstoftape
goud	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375” diameter x.002” dikke goudfolie
scanning elektronenmicroscoop	FEI	XL-30