Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Expressie van exogeen cytokine in patiënt afgeleide Xenografts via injectie met een cytokine-getransduceerde stromcellijn

8.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55384

⸱

10 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschreven is een werkwijze voor het produceren van exogeen cytokine in patiënten afgeleide xenograftmuizen via wekelijkse intraperitoneale injectie van een cytokine-getransduceerde stromale cellijn. Deze methode verruimt het nut van PDX en biedt de mogelijkheid voor transiënte of langdurige exogene cytokine-afgifte in een groot aantal PDX-modellen.

Samenvatting

Patiëntgerelateerde xenograftmuizen (PDX) worden geproduceerd door transplantatie van menselijke cellen in immuun deficiënte muizen. Deze modellen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van de mechanismen van normale en kwaadaardige hematopoiesis en zijn de gouden standaard voor het identificeren van effectieve chemotherapieën voor veel kwaadaardigheden. PDX-modellen zijn mogelijk omdat veel van de cytokines van de muis ook op menselijke cellen optreden. Dit geldt echter niet voor alle cytokinen, waaronder veel die kritiek zijn voor het bestuderen van normale en kwaadaardige hematopoiesis in menselijke cellen. Technieken die muizen ontwerpen om menselijke cytokinen te produceren (transgene en inklapmodellen) vereisen aanzienlijke kosten voordat het nut van het model is aangetoond. Andere technieken zijn arbeidsintensief (injectie van recombinant cytokine of lentivirus) en vereisen in sommige gevallen een hoog niveau van technische expertise (hydrodynamische injectie van DNA). Dit rapport beschrijft een eenvoudige methode voor het genereren van PDX-muizen die exogene humane cy hebbenTokine (TSLP, thymische stromale lymfopoietine) via de wekelijkse intraperitoneale injectie van stroma die zijn getransduceerd om deze cytokine te overexpressie. Gebruik van deze methode verschaft een in vivo bron van continue cytokine productie die fysiologische niveaus van circulerend humaan cytokine in de muis bereikt. Plasmaniveaus van menselijk cytokine kunnen worden gevarieerd op basis van het aantal geïnjecteerde stromalcellen, en de productie van cytokine kan op elk moment in het experiment worden geïnitieerd. Deze methode omvat ook cytokine-negatieve controlemuizen die op dezelfde wijze worden geproduceerd, maar door intraperitoneale injectie van stroma getransduceerd met een controle vector. We hebben eerder aangetoond dat leukemacellen die zijn geoogst uit TSLP-expressie PDX, in vergelijking met controle PDX een genuitdrukkingspatroon meer tonen dan het oorspronkelijke patiëntmonster. Samen vormen de cytokine-producerende en cytokine-negatieve PDX-muizen die door deze methode worden geproduceerd, een model systeem dat we succesvol hebben gebruikt om de studie te bestuderenRol van TSLP bij normale en kwaadaardige hematopoiesis.

Inleiding

Patiëntgerelateerde xenografen (PDX) zijn een krachtig in vivo model voor het bestuderen van de productie van normale en kwaadaardige hematopoietische cellen in een 'native' zoogdieromgeving. Meestal worden PDX geproduceerd door injectie of transplantatie van menselijke cellen in immuun deficiënte muizen. De productie van PDX met behulp van normale humane hematopoietische stamcellen maakt in vivo studies mogelijk van normaal menselijk bloed en immuuncelontwikkeling. PDX geproduceerd uit leukemie of andere kankercellen maakt het mogelijk om oncogene mechanismen te bestuderen en effectieve therapieën te identificeren in het kader van het bereik van genetische landschappen en mutaties die aanwezig zijn in de menselijke populatie. 1 PDX is daarom de huidige gouden standaard voor translatie biomedisch onderzoek om effectieve therapieën te identificeren en een belangrijk instrument om mechanismen van kankerprogressie te begrijpen. PDX-modellen zijn een essentieel instrument om onderzoek naar gezondheidsverschillen in ziekten te voorkomen door specifieke Genetische letsels of een ziekte waarin de variaties van het genetische landschap van een patiënt aanzienlijk kunnen bijdragen tot oncogenese en behandelingsuitkomst.

Muis-menselijke PDX-modellen zijn mogelijk omdat veel muiscytokines hun menselijke analogen adequaat nabootsen bij het activeren van de cytokine-receptoren van menselijke cellen terwijl zij in de muis zijn. Interleukine-7 (IL-7) geeft bijvoorbeeld een kritisch signaal voor humane B-celontwikkeling. 2 In dit geval heeft muis IL-7 voldoende homologie met menselijke IL-7 dat het muse cytokine signaalwegen in humane B-celprecursoren stimuleert. 2 , 3 , 4 Dit is echter niet het geval voor thymische stromale lymfopoietine (TSLP), 5 , 6 die onder andere cytokinen (IL-3, granulocyt-macrofage kolonie stimulerende factor (GM-CSF), stamcelfactor (SCF) ,Ref "> 7 is belangrijk voor de productie van normale en kwaadaardige humane hematopoietische cellen. Wanneer muizen en menselijke cytokinen een lage homologie hebben, laten de muse cytokines hun respectieve receptoren niet op menselijke cellen activeren. Om dit obstakel te overwinnen is een aantal strategieën gebruikt Om expressie van humane cytokinen in PDX-muizen te manipuleren. Deze omvatten injectie van recombinante humane cytokinen, hydrodynamische injectie van DNA, lentivirale expressie, transgene expressie en knockin-genvervanging. 7 Dit rapport beschrijft een methode voor het manipuleren van PDX om menselijk cytokine te produceren via stromale Cytokine-afgifte ( Figuur 1 ).

In de hier getoonde werkwijze worden PDX-muizen ontworpen om het menselijke cytokine, TSLP uit te drukken of om te dienen als cytokine-negatieve controles. TSLP-expressie PDX worden bereikt door wekelijkse intraperitoneale injecties van stromale cellen die zijn getransduceerd om hoge niveaus van menselijke TSLP uit te drukken.Cytokine-negatieve PDX "control" muizen zijn op dezelfde manier ontworpen; Hoewel controle stroma worden getransduceerd met een controle vector. Deze methode behaalt normale fysiologische niveaus van menselijk TSLP in PDX-muizen die geïnjecteerd worden met de TSLP + stroma. Geen detecteerbare TSLP wordt waargenomen in PDX-muizen die de cytokine-negatieve stroma ontvangen. We hebben de menselijke stromal cellijn HS-27A geselecteerd voor onze studies omdat het robuust groeit in de cultuur en een zeer lage cytokineproductie toont die geen proliferatie van geïsoleerde stamcellen in coculturen ondersteunt. 8 Voor menselijke TSLP expressie werden stroma getransducteerd met een geavanceerde generatie zelfinactiverende lentivirale vector afgeleid van een eerder beschreven ruggengraat 9 en omvat het cPPT / cts-element en het post-transcriptie-regulatorisch element van de woodchuck hepatitis (WPRE) om transgene expressie te verhogen. Het menselijke TSLP-gen werd geconstrueerd in deze vector onder de controle van de verlengingsfactor-1(EF-1) alpha promotor om robuuste, constitutieve en lange termijn expressie te bereiken.

De techniek van dit human-cytokine versterkte PDX-model bestaat uit 4 hoofdstappen. Ten eerste worden getransformeerde stroma in vitro uitgebreid en beoordeeld door enzym-gekoppelde immunosorbentassay (ELISA) voor stabiele cytokineproductie op hoog niveau. Ten tweede wordt de activiteit van humaan cytokine geproduceerd door de getransduceerde stromacellen (en het ontbreken van cytokine-activiteit van controle stroma) geverifieerd met behulp van fosfostroomcytometrie. Cellijnen die bekend zijn om te reageren op cytokine van belang (in dit geval, TSLP) worden geïncubeerd met stromale cel supernatant en geanalyseerd voor cytokine geïnduceerde fosforylering. Ten derde worden muizen geïnjecteerd met getransduceerde humane stroma en dan wordt muisplasma per week beoordeeld door ELISA voor niveaus van menselijk cytokine. Vierde humane hematopoietische cellen worden getransplanteerd en de in vivo functionele effecten van het humane cytokine worden geëvalueerd op een bekend doel ( Bijv. Celpopulatie).

figure-introduction-1
Figuur 1: PDX Model dat is ontworpen om exogene humane cytokine in muizen te produceren. ( 1A ) Ontwerp experiment en getransduceerde humane stromale cellen ( 1B ) verkrijgen. Verkrijg menselijke cellen (hematopoietische stamcellen, leukemacellen, enz .) Om PDX (patiënten afgeleide xenograft) muizen te genereren. ( 2A ) Injecteerde gemanipuleerde stroma en ( 2B ) transplantatie menselijke cellen in immuun deficiënte muizen volgens experimentele schema. ( 3A-B ) Monitor cytokine concentraties in het stroma supernatant en het muis plasma door ELISA. ( 4 ) Menselijke cellen van de oogst en analyseer de in vivo functionele effecten van het aanwezige humaan cytokine in de PDX. Klik hier alsjeblieftOm een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Levering van menselijk cytokine via stromacellen biedt zowel voor- en nadelen als vergeleken met andere methoden voor het leveren / produceren van humane cytokinen in PDX-muizen. 7 In vergelijking met injectie van recombinant humaan cytokine is stroma-gemedieerde afgifte over het algemeen minder duur (de kosten van stromale celcultuur zijn minder dan de kosten van recombinant cytokine) en minder arbeidsintensief (één injectie per week versus meerdere injecties per week). De kwestie van korte halveringstijd van de cytokine wordt ook verminderd, aangezien stroma voortdurend de exogene cytokine produceert. Levering van cytokine via hydrodynamische injectie van DNA kan minder duur zijn dan afgifte via stroma. Het is evenwel ook voorbijgaande en kan meer technische vaardigheden vereisen dan de simpele wekelijkse intraperitoneale injectie die nodig is voor stroma-gemedieerde afgifte. Lentivirale genuitdrukking in de muis kan een minder traNsient methode van de levering van cytokine; In onze handen werden echter fysiologische TSLP niveaus niet bereikt. Bovendien is deze methode arbeidsintensief, waarbij de voortdurende productie van lentivirale vector vereist is. Transgene of knock-in muizen bieden stabiele langetermijnuitdrukking van cytokine en kunnen worden ontwikkeld voor weefselspecifieke expressie, die een voordeel kan zijn. Anderzijds vereist de transgene expressie van het humane cytokinegen op de immuun-deficiënte muisachtergrond die nodig is voor PDX-muizen een enorme investering van middelen voordat de waarde van het model is vastgesteld. Bovendien kunnen transgene modellen in het algemeen niet de mogelijkheid bieden om de timing van cytokine-initiatie of niveau van in vivo cytokineproductie te variëren. Deze kunnen worden bereikt met stroma-gemedieerde afgifte door gewoon het tijdstip te wijzigen voor het initiëren van stromale celinjectie of de dosis stromale cellen die geïnjecteerd zijn.

De stromale cel gemedieerde cytokine afgifte methOD gedetailleerde hier werd gebruikt om PDX te ontwikkelen voor het evalueren van de rol van TSLP bij normale humane B-celontwikkeling 4 , 6 en B-cel acute lymfoblastische leukemie met hoge risico's. 6 Deze methode verschaft een alternatieve cytokine-leveringsmethode voor gebruik bij het opwekken van vergelijkbare modellen met andere cytokinen dan TSLP. Dit model kan ook nuttig zijn voor het genereren van voorlopige gegevens die kunnen helpen bepalen of de waarde van een cytokine transgene of cytokine inklapbare PDX-model de aanzienlijke tijd en geld investering zou waard zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Studies zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Loma Linda University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocollen en volgens alle federale richtlijnen.

VOORZICHTIG: PDX en menselijk weefsel moeten worden behandeld in overeenstemming met veiligheidsprocedures om de overdracht van bloedgedragen pathogenen te voorkomen.

1. Cultuur en Uitbreiding van Cytokine-Transduced Stroomcellen

OPMERKING: Telkens wanneer stroma doorgaat, haal het kweek supernatant (1 ml aliquot) op en berg bij -80 ° C voor toekomstige kwantificering van cytokine niveau via ELISA assay.

  1. Bereid R10 kweekmedium en vriesmedium zoals beschreven in de Tafel van Materialen.
  2. Genereer 10 , 11 of geef controle stroma (getransduceerd met lege vector) en cytokine producerende (TSLP +) stroma."> 6 Bewaar in vloeibare stikstof (LN 2 ) tot het gebruik. Doe stromale cellen zoals beschreven 12 op en plak ze in 5 ml R10-medium in afzonderlijke T-25-celkweekflessen. Cultuurcellen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO 2. Dit is post-thaw "passage # 1".
  3. Zodra stroma confluent zijn (24-48 uur), worden de cellen door trypsiniseren gebruikt met 1 x trypsine EDTA (0,25%) en opnieuw plating in een T-150 kweekfles. Dit is post-thaw "passage # 2".
  4. Wanneer stroma confluentie in de T-150 flessen bereikt (3-4 dagen later), passeren de cellen door trypsiniseren. Gebruik deze celsuspensie voor experimentele behoeften.
    1. Celuitbreiding naar meerdere flessen
      1. Verdeel de geoogste cellen tussen drie T-150 flessen en cultuur tot confluent. Herhaal deze stap als stroma uitbreiding nodig is. Typische humane stromale (HS-27A) celtelling bij confluentie in een T-150 fles is ~ 5 x 106.
    2. Cellentorage
      1. Breng de geoogste celsuspensie over op een conische buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten, dek de supernatant af en breng de cellen opnieuw in het vriesmedium. Bevriezen en opslaan in LN 2 ~ 1,5 x 10 6 cellen per injectieflacon.
    3. Voor intra-periotoneale stroma injecties in muizen, ga verder met stap 4.1.

2. ELISA analyseert de productie van vitrocytokine uit getransduceerde stroma

  1. Koop in de handel verkrijgbare ELISA assay kit om de cytokine van belang te detecteren.
  2. Dooi stromale cel supernatant van controle en cytokine producerende (TSLP +) stroma geoogst bij vroege, midden en late passages ( Figuur 2 ).
  3. Bepaal de TSLP-concentratie in supernatantmonsters met behulp van een ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant. 13 Stel deze seriële data samen om de stabiliteit van cytokineproductie tijdens celcultuur te controleren E ( Figuur 2A-B ).
    1. Identificeer en verwijder cytokine producerend stroma met verminderde of suboptimale cytokine expressie, evenals eventuele bijbehorende injectieflacons ( Figuur 2A-B ).
    2. Identificeren en onderhouden van cytokine-producerende stroma die stabiele cytokine concentraties op hoog niveau aantonen. Gebruik deze ontdooien voor experimenten.
  4. Gebruik de ELISA-kit om stroma gedurende de gehele duur van de celcultuur regelmatig te monitoren (ten minste 1 keer tijdens de vroege, midden- en late na-ontdooipassages) om stabiele cytokineproductie te waarborgen of, in het geval van control stroma, de afwezigheid van cytokineproductie .

3. Fosfostroomcytometrie-analyses om de activiteit van cytokine te beoordelen, geproduceerd door Stroma

OPMERKING: Bepaal de supernatant van gemanipuleerde stroma voor het eerste experiment om de relevante bioactiviteit van het stroma-gegenereerde cytokine voor individueel experiment te verifiëren.Ef "> 6 Nadat de gecontroleerde stroma is gevalideerd, is verder testen niet nodig, tenzij stroma geïntroduceerd wordt die met een nieuwe vector zijn geproduceerd.

  1. Koop MUTZ5- en / of MHH-CALL4 leukemie cellijnen (TSLP responsive), 14 recombinant humaan cytokine en antilichamen die zijn goedgekeurd voor gebruik in fosfo-flow cytometrie assays om de juiste downstream fosforylatie doelen te detecteren.
  2. Ontdooide geoogste supernatant van controle en cytokine-expressie stroma.
  3. Plateer de leukemie cellijnen in R20 medium (zie Tabel van Materialen ) bij een concentratie van 0,2 x 106 cellen per putje in een weefselkweekplaat met 96 putjes. Plate 3 putten per conditie om triplicate assays mogelijk te maken. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. Deze keer zorgt voor verlies van fosforylering die zich voordoet tijdens de vroegere kweekomstandigheden.
    OPMERKING: 12 putjes per cellijn leveren triplicate assays voor elke experimentele conditie getoond in stap 3.4.
  4. Na 2 uur in de cultuur, verplaats de cellen uit elke put om 4 ml buizen te scheiden en centrifuge bij 500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Dek de supernatant af.
    1. De cellen opnieuw opschorten in 200 μL voor elk van de volgende experimentele condities (testen in triplicaat uitvoeren): 1) uitsluitend negatieve controle media, 2) positieve controle media met recombinante cytokine bij verzadigende concentratie (s) (TSLP bij 15 ng / Ml, enz .), 3) stroma supernatant van controle stroma en 4) cytokine-stroma supernatant van cytokine producerende stroma.
  5. Incubeer de cellen gedurende de duur gespecificeerd door specifieke commerciële fosfo-analyse ( bijv. 30 min voor fosfor STAT5 in MUTZ5 of MHH-CALL4 in reactie op TSLP).
  6. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C en dekant het supernatant.
  7. Voer fosfostroomcytometrieverf per protocol van de fabrikant uit en verzamel de flowcytometrie data. 15
  8. Analyseer flow cytometrie data. 15
    1. Poort op intacte cellen op basis van voorwaartse (FSC, indicatie van celgrootte) en zijde (SSC, geeft cijferkorreligiteit aan) lichtverdeling.
    2. Bepaal de gemiddelde fluorescerende intensiteit (MFI) van de intacte cellen in elk monster. Vergelijk de gemiddelde MFI verkregen uit de drievoudige waarden van stromale cel supernatant met die van positieve en negatieve media controles.

4. Injectie van Cytokine-Transduced Stroma in Muizen

OPMERKING: Cultuur HS-27A stroma voor minimaal 3 na-dode passages voorafgaand aan injectie in muizen om gezonde cellen en adequate cytokine productie te waarborgen.

  1. Voorbereiding van stroma
    1. Breng de geoogste stromacellesuspensie over op een conische buis en doseer 10 μL voor hemocytometer tellen; Getallencijfers verkrijgen met behulp van trypan blauw. 16 Centrifugeer de resterende ceLl suspensie bij 500 xg gedurende 5 min.
    2. Aspirateer de supernatant uit de gepelleteerde cellen en resusteer de cellen zachtjes in het benodigde volume steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor muisinjectie (afhankelijk van het aantal muizen om te injecteren).
      OPMERKING Typische stromale celconcentratie voor muisinjectie: 0,5 x 10,6 -5 x 106 cellen per muis in 200 μl PBS.
    3. Bewaar de stromale cel suspensie bij 4 ° C (of op ijs) tot direct voor de injectie. Zorg ervoor dat de cel suspensie tenminste bij kamertemperatuur (RT) (~ 25 ° C) voor muizeninjectie is.
  2. Stroomcellen injectie
    1. Desinfecteer de bio-veiligheidskap, monteer materialen voor injecties en plaats de muiskooi erin.
    2. Meng de celsuspensie voorzichtig door inversie voordat u 200 μl in een tuberculinespuit maakt.
    3. Met behulp van standaard intra-peritoneale injectietechnieken, 17Belemmer de muis en geef de 200 μL cel suspensie in de peritoneale holte. Details zijn eerder aangetoond door Machholz et al. 18

5. Serie Bloedinzameling en Plasma Monitoring voor Exogene Menselijke Cytokine in Muizen

  1. Bloedverzameling via staartsnip
    1. Desinfecteer de biosafety kap en assembleer muissteunen, scharen en andere gereedschappen / benodigdheden voor de procedure.
    2. Plaats de muis in een aanhanger en bevestig de buis om de beweging van de muis te minimaliseren.
    3. Desinfecteer de staart en de chirurgische schaar met isopropylalcohol. Breng topical anesthetic cream aan op de staart.
    4. Met behulp van zeer scherpe chirurgische scharen snij ongeveer 0,5 - 1 mm van de punt van de muisstaart af. Verzamel ongeveer 80 μl perifeer bloed met behulp van gehardiniseerde capillaire buizen.
      OPMERKING: Als bloed met deze methode wordt verzameld meer dan zes tiMes, staartverwijdering moet conservatief zijn met inachtneming van de hoeveelheid staart verwijderd. Naarmate de snuitjes de staart vorderen, neemt de diameter toe, het bloeit sneller en de genezing duurt langer.
  2. Plasmascheiding
    1. Breng het bloed door met een bolspuit (om het uit de capillaire buizen te verdrijven) in een gelabelde K2 EDTA microtainer buis; Omkeer 20 keer om coagulatie te voorkomen.
      OPMERKING: Typisch bloedstolling van staartnip is snel. Echter, als de bloeding langer duurt dan ~ 2 minuten, gebruik een styptische potlood / poeder om coagulatie te ondersteunen.
    2. Centrifugeer de bloedinzamelbuizen volgens de instructies van de fabrikant en monteer het plasma voor opslag (-20 ° C) tot de ELISA-test klaar is.
    3. Als gegevens van de muis-humane cel chimerisme nodig zijn uit het bloed van de muis, behandel dan de resterende pellet zoals beschreven in stap 6.3.1. Anders, verwijder de bloedcelpellet.
  3. Gemodificeerde ELISA voor micro-volUmes van muis plasma
    OPMERKING: De ELISA-procedure van de fabrikant is gewijzigd van het aanbevolen 100 μL monster volume naar een volume van 40 μL om de microvolumes van muizen op te vangen. Het is niet mogelijk om de in vivo muisplasma-monsters in triplicaat met deze beperkte volumes uit te voeren. Aan het eind van het experiment wordt 500 μL post-mortem bloed verzameld via hartpicking. Cytokine concentraties geëvalueerd in 100 μL euthanasie plasma worden gebruikt om de 40 μL in vivo data voor elke muis te valideren.
    1. Ontdooide bevroren muis plasma monsters.
    2. Serie-verdunde ELISA-normen en plak ze in drievoud bij 40 μl per putje.
    3. Voeg 40 μl van elk muisplasma monster toe aan de ELISA plaat.
      OPMERKING: als een muismonster minder dan 40 μL is, breng dan het volume tot 40 μL met ELISA-buffer. Noteer dit verdunningsvolume en gebruik het om een ​​verdunningsfactor te berekenen voor elk verdund monster. WanneerAnalyseren van de ELISA-gegevens vermenigvuldigen de verdunde monsterkoncentratie met de verdunningsfactor van het monster om de werkelijke cytokine concentratie in het oorspronkelijke monster te bepalen.
    4. Voltooi ELISA-test volgens de instructies van de fabrikant.

6. Transplantatie van hematopoietische cellen in muizen

  1. Subletale bestraling om beenmerg voor transplantatie voor te stellen
    OPMERKING: De Loma Linda University (LLU) gebruikt een Cobalt-60 stralingsbron. Dieren worden geplaatst in een taartrestrictor die 80 cm van de stralingsbron in een 20 x 20 cm veld geplaatst is en met een 0,5 cm laag Lexan bovenop de restrainer. Blootstellingstijd is berekend om een ​​225 cGy dosis te behalen op basis van de meest recente kalibratie van de bron (momenteel 2-3 minuten voor deze bron).
    1. Sub-lethaal bestraalde muizen (totale lichaamsbestralingsdosis van 225 cGy maximum voor immuun deficiënte muizen).
    2. Transplantatie hematopoietische cellen ~ 24 uur later via </ Em> intraveneuze staartveneuze injectie.
  2. Intraveneuze hematopoietische celtransplantatie
    1. Bereid menselijke cel suspensies voor transplantatie in een volume van 200 μL steriele PBS per muis: CD34 + hematopoietische stamcellen (HSC): 1 x 10 5 tot 5 x 10 5 cellen per muis en leukemie cellijnen / patiëntmonsters: 1 x 10 6 tot 5 x 10 6 cellen per muis.
    2. Bewaar cellen bij 4 ° C (transport op ijs) tot onmiddellijk voor transplantatie. Zorg ervoor dat cellen tenminste bij RT voor transplantatie zijn.
    3. Desinfecteer de bioveiligheidshuis en berei de afzuigruimte voor transplantaatinjecties voor.
    4. Plaats de muis gedurende 5 minuten in de kachel om de staartvenen te verruimen.
    5. Meng de cel suspensie zachtjes en maak 200 μL in een tuberculinespuit. Zet de naald veilig opzij, waar het steriel blijft.
    6. Plaats de muis in een bevestiging en desinfecteer de staart met isopropylalcohol.
    7. Met behulp van standaard intraveneuze injectietechnieken injecteren 17 de menselijke cel suspensie in muisstaart.
      OPMERKING: Inademingen van de taille kan meerdere pogingen doen, vooral voor een beginnende dierenverzorger. Kovacscics en Raper's JoVE video 19 geeft een gedetailleerde demonstratie van deze dieren techniek.
    8. Monitor het herstel van de muis voor ~ 5 min. Noteer bijwerkingen tijdens de injectie ( bijv. Gemorste cellen, grote bloeding, overmatig staarttrauma).
  3. Analyse van humane cel chimerisme in perifere bloed van het muis
    1. Verkrijg de bloedcelpelletjes die in de microtainerbuis achterblijven na plasma-scheiding (stap 5.2.3).
    2. Voor rode bloedcellen (RBC) lysis, resuspendeer de resterende bloedpelletjes in een volume PBS gelijk aan plasma verwijderd (om plasma volume te vervangen) en meng goed (vortex / pipet).
    3. Breng elk opnieuw gesuspendeerd bloedmonster over op een gelabelde 4 ml buisEn voeg vervolgens RBC lysisbuffer toe aan elke buis in een 1: 9-verhouding (900 μL RBC lysisbuffer voor 100 μL opnieuw gesuspendeerd bloed). Incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Centrifuge (5 min, 500 xg) en decant.
    4. Voer tweede RBC lysisbuffer incubatie uit (5 minuten bij RT). Centrifugeer en dekant zoals eerder.
    5. Was de resterende cellen in ~ 1 ml PBS. Centrifugeer en dekant zoals eerder.
    6. Resuspendeer de pellet in een volume PBS geschikt voor standaard flow cytometry staining (dit varieert volgens fabrikant en individuele laboratoriumprotocollen). 20 Gebruik immunofenotyping antilichamen die zijn gecontroleerd voor flow-cyotmeterie om muiscellen (muis CD45 +) en menselijke cellen (menselijke CD45 +) 6 , 21 te identificeren Evenals aanvullende humane leukocytenmarkers die specifiek zijn voor de cellulaire lijn van belang.
      OPMERKING: Het is aan te raden om een ​​klein volume (5 μL-20 μL) van elk muismonster te nemen om "pooled samples" te maken; Gebruiken voor onbeschadigde, levensvatbaarheids- en isotype controlemonsters. Het is de beste praktijk om onbeschadigde en isotype controles voor elke experimentele conditie te hebben.

7. Functionele Evaluatie van In Vivo Cytokine Activiteit

  1. Muis-euthanasie en weefsel oogst
    1. Euthanize muizen via CO 2 versmoring bij aangewezen experimentele tijdstip.
    2. Oogstbloed via cardiale punctie en plasma verzamelen zoals in stappen 5.2.1-5.2.2.
      OPMERKING: Verzamel het bloed voorafgaand aan andere weefsels omdat het direct na de dood coaguleert.
    3. Verwerk het muisbloed, aliquot en bewaar plasma zoals in stap 5.2.2.
      1. Op een later tijdstip beoordelen de exogene cytokine concentratie in plasma verkregen bij euthanasie via ELISA volgens het protocol van de fabrikant. Evalueer en vergelijk exogene cytokineconcentraties in het muisplasma van de seriële in vivoBloedinzameling en de euthanasie plasma monsters (beschreven in rubriek 5.3).
    4. Voeg PBS toe aan het overblijvende bloedmonster om het plasma volume en het proces te vervangen zoals beschreven in stappen 6.3.1 en 6.3.2. Voer onmiddellijk de flowcytometrie-analyses uit, of verwijder cellen in vriesmedium voor LN 2- opslag.
  2. Harvest beenmerg (BM) en milt van PDX muizen en bereiden enkele cel suspensies zoals eerder beschreven. 22
  3. Verkrijg celtellingen voor elk PDX-muisweefselmonster met behulp van 3% azijnzuur met methyleenblauw (lyses celmembranen en RBC's die intacte kernen van levende cellen verlaten) in een 1: 1 verdunning en tellen cellen met behulp van een hemocytometer. Tabelleer totale celtellingen voor beenmerg- en miltmonsters voor elk dier.
  4. Centrifugeer (500 xg, 15 min) cel suspensies en dekant het supernatant. Voer de flow-cytometer-assays van beenmerg en / of miltcellen onmiddellijk of resuspendeer in vriesmedium voor LN 2 opslag.
    OPMERKING: Vries 10 BM-aliquots (voor toekomstige biochemische analyses) en ~ 5 miltquota (voor toekomstige PDX-transplantaties) per muis.
  5. Immunofenotyping om in vivo functionele effecten te identificeren
    1. Bereid één master-mix (MM) van flowcytometrie antilichamen tegen hematopoëtische populatie (en) voor immunofenotype in, die reageert op de cytokine van belang en een tweede MM van isotype controle antilichamen ( Figuur 5 en Tabel van Materialen).
    2. Dooi PDX-weefselquota (37 ° C kraalbad) bereid in stap 7.4.
    3. Was de ontdooide cellen door ze over te brengen naar een conische buis en voeg het minst 3x volume PBS toe. Centrifugeer (500 xg, 5 min) en dekant de supernatant.
    4. Herhaal de wasstap (7.5.3).
    5. Maak pooled aliquots door ~ 10 μL-20 μL cellen uit elk PDX monster te nemen voor de ongekleurde controle, levensvatbaarheidscontrole en de isotype controles (zie stap 6.4.6 noot). Vlek alle monsters, behalve de uNstained controle, met een fixeerbare levensvatbaarheid kleurstof (dode cel markering), incuberen en wassen volgens het protocol van de fabrikant.
    6. Vlek elke PDX-celmonster met fenotyping-MM volgens het standaard flow cytometry staining protocol; Op dezelfde wijze vlek het pooled isotype-controle monster (s) met het isotype-MM. Incubeer alle monsters, wassen met PBS en monsters vastzetten door opnieuw op te schuiven in 1% paraformaldehyde.
    7. Verzamel flowcytometrie data en analyseer gegevens met behulp van een gate strategie die geschikt is voor de celpopulatie (s) van belang ( Figuur 5 ). Een typische gating is als volgt:
      1. Definieer intacte cellen door een FSC- en SSC-poort te tekenen die rommel uitsluit.
      2. Identificeer de levende cellenpopulatie door te gaten op cellen die negatief zijn voor de dode celmerker (dit zijn de "totale levende cellen").
      3. Gebruik subgates in de "totale levende cellen" om de celpopulaties te definiëren met het gewenste immunofenotype (zie Figuur 5).
      4. Verkrijg deFrequentie van subsetcelpopulaties binnen de totale aantal levende cellen uit de flowcytometrie analyse. 6 , 21
    8. Bereken het aantal doelcellen in elk weefsel door de frequentie van de B-cel-subset te vermenigvuldigen, binnen de totale levende cellen (verkregen in stap 7.5.6.4) door de totale levende celtellingen per weefsel verkregen in stap 7.3 (% B-cel subset x " Hemocytometer cel telling ", zie tabel 1 )
    9. Vergelijk de celtellingen van doelcelpopulaties tussen controle PDX-muizen en cytokine-expressie (TSLP +) PDX-muizen om in vivo functionele effecten van het exogene humane cytokine te bepalen ( tabel 1 ).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een overzicht van het model is weergegeven in figuur 1 . Zodra cytokine-producerende (TSLP + stroma) en controle stroma zijn verkregen, worden ze uitgebreid in cultuur. Vóór stroma injectie in muizen wordt stromale cel supernatant beoordeeld door ELISA om cytokine productie te verifiëren ( Figuur 2 ) en fosfo-flow cytometrie (Protocol # 3) wordt gebruikt om de activiteit van de door de stroma geproduceerde cytokine te verifiëren. Supernatant wordt verzam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige, snelle en relatief kosteneffectieve methode voor het ontwerpen van PDX om exogeen humaan cytokine uit te drukken. De hier beschreven strategie is gebaseerd op wekelijkse intraperitoneale injecties van een stromale cellijn die getransducteerd wordt om de menselijke cytokine, TSLP uit te drukken. Voordat de hier beschreven methoden werden uitgevoerd, werden stroma ontwikkeld om hoge niveaus van het cytokine van belang (TSLP) en soortgelijk gecontroleerde controle stroma uit te dru...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, een Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, het Department of Pathology and Human Anatomy, het Department of Basic Sciences, en het Center for Health Disparities and Molecular Medicine aan de Loma Linda University School of Medicine en door een Grant ter Bevordering van Collaboratief en Translationeel Onderzoek van Loma Linda University (KJP). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Wet lab reagents 
T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity,  25cm² culture areaThermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented capCorning Inc. / Fisher353136
T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented capCorning Inc. / Fisher355001
10 mL serologische pipettenFalcon357551
15 mL  polypropyleen conische buisjesFisher05-539-12
5 mL ronde bodem polystyreenbuisjesFalcon352054
50 mL polypropyleen conische buisjesFalcon352098
2,0 mL cryogene flesjes, extern gesnedenCorning Inc. / Fisher4230659
1 mL pipettipsFisher2707509
200 μL pipettips Denville ScientificP3020-CPS
10 μL pipettipsDenville ScientificP-1096-CP
Steriele wegwerpfiltereenheden met SFCA-membraan, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4 BioLegend423001
Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium, 1×Corning cellgro/ Mediatech21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3% azijnzuur met methyleenblauwStemcell Technologies7060
Trypan Blauw Corning25-900-Cl
"Trypsine" 1x 0,25% Trypsine 2,21 mM EDTA in HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949
“R10” cellenkweekmedium, % van totaal volume (maakt 565 mL)--Lab Recept
RPMI, 88,5% (500 mL) Mediatech10-040-CV  
FBS, 9,9% (56 mL) Mediatech35-011-CV
L-Glutamine, 0,99% (5,6 mL) Mediatech25-005-Cl
Penicilline-Streptomycine, 0,50% (2,8 mL) Mediatech30-002-Cl
2-Mercaptoethanol, 0,10% (560 µL) MP190242
“R20” cellenkweekmedium, % van totaal volume (maakt 195 mL)--Lab Recept
     RPMI, 76,84% (150  mL)zie bovenzie boven
     FBS, 20,49% (40 mL)zie bovenzie boven
     2mM L-glutamine, 1,02% (2 mL)zie bovenzie boven
     1 mM Na pyruvate, 1,02% (2 mL )zie bovenzie boven
     Penicilline-Streptomycine,  0,51% (1 mL)zie bovenzie boven
     2-Mercaptoethanol, 0,10% (0,1 M),  0,10% (200 µL)zie bovenzie boven
“Bevriezingsmedium”, % van totaal volume--Lab Recept
“R10” medium, 45%zie "R10" recept-
FBS, 20%zie boven35-011-CV
DMSO, 10%Corning25-950-CQC
D(-)(+)-Trehalose dihydraat, 5%Fisher ScientificBP2687-100
NaamBedrijfCatolog NummerOpmerkingen
Biologische producten 
"HS-27" HS-27A menselijke stroma lijnATCCCRL-2496
"CALL-4" MHH-CALL-4 cellijn, menselijke B-cel precursor leukemieDSMZACC 337
“NSG muizen” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, mannelijk of vrouwelijk, leeftijd 6 – 8 wekenJAX Muizen # 005557
MUTZ-5 cellijn, menselijke B-cel precursor leukemieDSMZACC 490
Recombinant Human TSLP-eiwitR&D Systems1398-TS-010
NaamBedrijfCatolog NummerOpmerkingen
Flow cytometry antilichamen (kloning)*
Anti-muis CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD

Referenties

  1. Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
  2. Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
  3. Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
  4. Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
  5. Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
  6. Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
  7. Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
  8. Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
  9. Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  11. Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
  12. Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
  14. Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
  15. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
  17. JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  19. Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
  20. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  21. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
  23. Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
  24. Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cytokine-expressieinjectie van stromale cellenTSLP-transductieperitoneale injectieflowcytometrieELISA-analysehematopoëtische stamceltransplantatiecytokineniveaus in plasmakweek van stromale cellen
Expressie van exogeen cytokine in patiënt afgeleide Xenografts via injectie met een cytokine-getransduceerde stromcellijn
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.