Absolute kwantificering van Aß 1-42 In CSF met behulp van een Massaspectrometrische Reference Measurement Procedure

Summary

Een referentiemetingsprocedure voor de absolute kwantificering van Aβ_1-42 in menselijk CSF op basis van extractie in vaste fase en vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie wordt beschreven.

Abstract

De ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte onder ouderen en is verantwoordelijk voor 60-80% van alle gevallen van dementie. Momenteel is de diagnose van AD gebaseerd op cognitieve tests en onderzoek van de mentale toestand, maar het peptide amyoïde-beta (Aβ) in hersenvocht (CSF) wordt steeds vaker gebruikt in klinische onderzoeken en omgevingen. Zoals voor de meeste eiwit- en peptide biomarkers, wordt kwantificering uitgevoerd met behulp van op antilichamen gebaseerde technieken, zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Echter, intra- en inter-laboratorium variabelen in deze tests belemmeren het gebruik ervan als diagnostisch marker in de klinische routine.

Een antilichaam-onafhankelijke Referentie Meet Procedure (RMP) werd ontwikkeld op basis van solid-phase extractie (SPE) en vloeistofchromatografie (LC)-tandem massaspectrometrie (MS/MS), waarbij stabiele, isotoop-gelabelde Aβ peptiden werden gebruikt als interne standaarden, waardoor absolute kwantificering mogelijk werd. Een high-resolution quadrupole-orbitrap hybride instrument werd gebruikt voor de metingen. De methode maakt kwantificering mogelijk van CSF Aβ_1-42 tussen 150-4.000 pg/mL.

Introduction

Ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende vorm van dementie en treft ongeveer 35 miljoen mensen wereldwijd ^1. De neuropathologische kenmerken van de ziekte algemeen aangenomen in de kern van de pathogenese van AD te liggen zijn intracellulaire tangles van hypergefosforyleerd tau-eiwit ² en extracellulaire plaques bestaande uit geaggregeerde amyloid-beta (Aß) peptiden ^3. In lijn hiermee heeft de beoordeling van plaque pathologie in vivo door biomarkers onlangs opgenomen in het onderzoek diagnostische criteria voor AD ^4. Voor CSF metingen van AB _1-42, verschillende immunoassays zijn beschikbaar en worden gebruikt in vele klinische laboratoria ^5. De concentratie van Ap _1-42 in CSF is in AD patiënten ongeveer 50% lager dan in het cognitief normale ouderen, als gevolg van de afzetting van het peptide in plaques in de brain ^{6, 7.}

Deze biomarkers zijn voornamelijk geanalyseerd met immunoassays (bijvoorbeeld op antilichaam gebaseerde technieken), maar deze assays worden beïnvloed door matrixeffecten ^8. Het gebruik van immunoassays op verschillende technologische platforms en het gebrek aan standaardisatie assay ^{9, 10} maakt de invoering van globale cut-off concentraties moeilijk ^{11, 12.} Een analytisch gevalideerd RMP zou de uniforme kalibratie van verschillende assay platforms toe te staan, idealiter resulteert in een betere vergelijkbaarheid tussen de analytische platforms en in een betere controle van de factoren die bijdragen aan de totale meting variabiliteit.

De absolute kwantificering van Aß _1-42 met behulp van de ontwikkelde LC-MS / MS methode overwint veel van de kwesties in verband met antilichamen gebaseerde techniques. De methode, vermeld als een RMP door het Gemengd Comité voor Traceerbaarheid in Laboratory Medicine (JCTLM databank identificatienummer C11RMP9), zullen worden gebruikt om de absolute concentratie van Aß _1-42 te bepalen in een Certified Reference Material (CRM) te harmoniseren CSF AB _{1 -42} metingen over technieken en analyse-platforms. De beschreven workflow moet relevant zijn voor de ontwikkeling van kandidaat referentiemethoden voor peptiden en eiwitten in andere gebieden van de geneeskunde.

Protocol

Opmerking: Dit protocol vereist aliquots van ten minste 50 uL, met een concentratie van 50 ug / ml voor elk Aß peptide, als uitgangsmateriaal. De Aß peptiden worden opgelost in 20% acetonitril (ACN) en 4% geconcentreerde ammonia oplossing in gedeïoniseerd water (v / v) en bewaard bij 80 ° C.

Let op: Zie tabel 1 voor informatie over veiligheid.

1. Bereiding van de oplossingen

1. Bereid 100 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammonia oplossing in gedeïoniseerd water (v / v) door het verdunnen van 20 ml ACN en 4 ml geconcentreerde ammoniak (~ 25%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 100 ml met gedeïoniseerd water. Maak dagelijks vers.
2. Bereid 50 ml van 5 M guanidine-hydrochloride door het oplossen van 26,08 g guanidine-hydrochloride in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml. Bewaren bij 20 ° C en maak verse maandelijks.
3. Bereid 200 ml 4% fosforzuur in gedemineraliseerd water (v /v) door het verdunnen van 9,4 ml geconcentreerd fosforzuur (~ 85%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 200 ml met gedeïoniseerd water. Bewaar in de koelkast en maak verse wekelijks.
4. Bereid 50 ml 75% ACN en 10% geconcentreerde ammonia (v / v) in gedeïoniseerd water door het verdunnen 37,5 ml ACN en 5 ml geconcentreerde ammonia (~ 25%) in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 50 ml met gedeïoniseerd water. Maak dagelijks vers.
5. Dooi ten minste 2,5 ml van het menselijk CSF voor de kalibrators, verkregen uit-de geïdentificeerde overgebleven monsters uit routine klinische analyse.
6. Bereid kunstmatige CSF bevattende 150 mM Na, K 3,0 mM, 1,4 mM Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P en 155 mM Cl in gedeïoniseerd water en voeg runderserumalbumine tot een eindconcentratie van 4 mg / ml. Slechts 1 mL nodig per analyse, maar stelt een groot volume, hoeveelheid, en opslag voor later gebruik.

2. Voorbereiding van de Calibrators

1. Bereid 0,5 ml 4 ug / ml ¹5 NAβ _1-42 peptide door toevoeging van 40 ul van 50 ug / ml ¹⁵ NAβ _142-,46 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
2. Bereid 2 ml 100 ng / ml ¹⁵ NAβ _1-42 peptide door toevoeging van 50 pi van de 4 ug / ml ¹⁵ NAβ _142-1,95 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
3. Neem zes kalibrator oplossingen (AF) door mengen van de volumes van elk van de in tabel 2 oplossing. Gebruik 0,5, 1,5 en 2 ml microcentrifugebuizen. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
4. Bereid de uiteindelijke kalibrators (in tweevoud) in 0,5 ml microcentrifugebuizen door het toevoegen van de bijbehorende ijkoplossingen en menselijke CSF volgens tabel 3. Meng op een vortex mixer gedurende 1 min.

3. Voorbereiding van de interne standaard

1. Bereid 2 mL 0,8 ug / mL ¹³ CAβ _1-42 peptide door toevoeging van 32 ul van 50 ug / ml ¹³ CAβ _142-1,968 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
2. Bereid 5 ml 16 ng / ml ¹³ CAβ _1-42 peptide door toevoeging van 0,1 ml 0,8 ug / ml tot 4,9 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.

4. Voorbereiding van de Response Factor Sample

OPMERKING: De responsfactor (RF) bepaling wordt uitgevoerd om de concentratie van het gemerkte eiwit gebruikt voor kalibratie ⁽¹⁵ NAβ _1-42) te bepalen. Dit vereist dat de concentratie van het natieve _1-42 Aß peptide werd bepaald met aminozuuranalyse (AAA). Zo is het volume en de concentratie van natuurlijk Ap-peptide _1-42 aliquotsmoeten de eisen van de AAA voldoen.

1. Bereid 0,5 ml 4 ug / ml natuurlijke (ongemerkt) ^Aß _1-42 door toevoeging van 40 ul van 50 ug / ml natief Aß _1-42 0,46 ml 20% ACN en 4% geconcentreerde ammoniak in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
2. Bereid een 2-mL 40 ng / mL mengsel van natief en ¹⁵ NAβ _1-42 door toevoeging van 20 ul van 4 ug / ml natief Aß _1-42 en 20 pi van 4 ug / mL ¹⁵ NAβ _1-42 tot 1,96 ml 20% ACN en 4% geconcentreerd ammonia in een 2 ml microcentrifugebuis. Mengen op een vortex mixer gedurende 1 minuut.
3. Voeg 20 ul van 40 ng / mL mix 0,38 ml kunstmatige CSF in een 0,5 ml microcentrifugebuis. Bereid duplicaten en mix op een vortex mixer gedurende 1 min.

5. Monstervoorbereiding

OPMERKING: Ontdooi de te meten monsters bij kamertemperatuur op een roller.

1. Voeg 0,18 ml van elke calibrator, responsfactor en onbekende monster (inclusief kwaliteitscontrole [QC] samples, indien gebruikt) tot een 1 mL eiwit 96 diepe putjes, volgens figuur 1 (uitgaande van een volledige plaat wordt gebruikt). Zorg ervoor dat de monsters voegen, of dicht bij, de bodem van de putjes.
2. Voeg 20 ul van interne standaard aan elk putje (dat wil zeggen, kalibratoren, reactie factoren, QCs en onbekenden); is het cruciaal om de druppel op de kant van de bron dicht bij het oppervlak van het monster vrij te dompelen de pipetpunt.
3. Voeg 0,2 ml van 5 M guanidine-waterstofchloride aan elk putje.
4. Het monster plaat op een microplaat schudinrichting en meng de monsters gedurende 45 minuten bij 1100 rpm. De optimale frequentie kunnen verschillen afhankelijk van de instrumentatie. De frequentie en amplitude van de mixer, zodat de oplossingen grondig gemengd en geen druppels interne standaard of CSF ongemengde gelaten aan de zijde van de putjes.
5. Voeg 0,2 ml 4% fosforzuuraan elk putje. Vortex meng kort.

6. Solid Phase Extraction

Opmerking: In alle was-, laad- en elutiestappen, passen de laagst mogelijke vacuüm na het toevoegen van de oplossing en geleidelijk naar behoefte te laden of te elueren de oplossing. Schakel het vacuüm tussen elke laad- en elutiestap.

1. Zet een reservoir tray voor afvalstoffen in het kader van een mixed-mode, kation-uitwisseling, 96-well vaste fase extractie (SPE) plaat in de winning plaat verdeelkamer.
2. Conditioneer de SPE sorptiemiddel door toevoeging van 0,2 ml methanol aan elk putje.
3. Het sorptiemiddel evenwicht door toevoeging van 0,2 ml 4% fosforzuur aan elk putje.
4. Breng alle monsters (ongeveer 0,62 ml in elk putje) uit de diepe-wells plaat aan de SPE plaat. Gebruik een acht-kanaals pipet bij het overbrengen van de monsters van de deep-well plaat om de SPE plaat; Het is niet cruciaal voor de gehele of gelijk volumina van monsters dragen, aangezien de monsters stage bevattenal standaard die zal compenseren voor variaties.
5. Was het sorptiemiddel nadat de monsters door middel van toevoeging van 0,2 ml 4% fosforzuur aan elk putje gepasseerd.
6. Na het wassen oplosmiddel uitgewassen uit het sorptiemiddel, vervangt het reservoir dienblad met een verzameling plaat of tubes.
7. Elueer het monster van het sorptiemiddel met tweemaal toevoegen van 50 ui 75% ACN / 10% geconcentreerde ammonia en merk op dat deze oplossing vereist een zeer laag vacuüm door het sorbens te passen. Vergeet niet om het vacuüm tussen elke toevoeging te schakelen.
   1. OPTIE: Sluit de collectie plaat of tubes en vries ze bij -80 ° C. Haal de afdichting uit de collectie plaat of tubes voordat u verder met stap 6.8.2.
   2. Droog de eluaten met vacuümcentrifugatie (zonder toepassing van warmte); Dit kan van de ene tot enkele uren, afhankelijk van het vacuüm centrifuge.
   3. Verzegel de containers en bevriezen bij -80 ° C.

7. Liquid Chromatografie

1. Bereid mobiele fase A (5% ACN en 0,3% geconcentreerde ammoniak in gedemineraliseerd water [v / v]), B (4% gedemineraliseerd water en 0,1% geconcentreerde ammoniak in ACN [v / v]), en de naald was (50% ACN en 4% geconcentreerd ammoniak in gedemineraliseerd water [v / v]).
   1. Voor 500 ml mobiele fase A, voeg 25 ml ACN en 1,5 ml geconcentreerde ammoniak in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 500 ml met gedeïoniseerd water.
   2. Voor 500 ml mobiele fase B, voeg 500 ul van geconcentreerde ammonia en 25 ml gedeïoniseerd water ACN. Pas het uiteindelijke volume tot 500 ml met ACN.
   3. Bereid 250 ml naald wassen door toevoeging van 120 ml ACN en 10 ml geconcentreerde ammoniak in gedeïoniseerd water. Stel het uiteindelijke volume op 250 ml met gedeïoniseerd water.
   4. Zet de mobiele fasen A en B en naald wasflessen wordt in een bad sonicatie gedurende 20 minuten voor gebruik met het systeem LC
2. Ontbinden elk monster met 25 ul van 20% ACN en 4% concentrated ammoniakoplossing en plaats ze op een schudder gedurende 20 min. Centrifugeer beneden de monsters en plaats ze in de autosampler (houden bij 7 ° C).
3. Injecteer 20 uL monster op een 1 x 250 mm ² polystyreen-divinylbenzeen (omgekeerde fase) monolithische kolom gehandhaafd op 50 ° C.
   1. Gebruik de LC gradiënt in tabel 4 met een debiet van 0,3 ml / min. Doorschakelen de eerste twee en de laatste vijf minuten naar afval (post-kolom) met een omleiding klep om de verontreiniging van de massaspectrometer verminderen.

8. massaspectrometrische analyse

LET OP: Deze parameters werden gebruikt voor een quadrupool-orbitrap hybride massaspectrometer uitgerust met aheated elektrospray ionisatie bron.

1. Stel de parameters voor de ionenbron volgens tabel 5.
2. Stel de MS instrument om de 4+ lading staten van inheemse Aß _1-42 te isoleren (1,129.48 massa-ladingsverhouding [m / z]), ¹⁵ NAβ _1-42 (1,143.00 m / z), en ¹³ CAβ _1-42 (1,179.50 m / z) in de quadrupool massa-analysator met een isolatie breedte van 2,5 m / z.
3. Versnippering van de geïsoleerde peptiden in de botsing cel met een genormaliseerd botsingsenergie (NVU) van 17,0. Dit zou moeten worden afgestemd op elk instrument, zelfs van hetzelfde type (en in het bijzonder als het gebruik van andere soorten instrumenten, zoals een triple quadrupool MS).
4. Noteer het fragment spectra met een resolutie van 17.500, met een automatische versterkingsregeling Doelwit van 2 x 10 ⁵ kosten en een maximale injectietijd van 250 ms.

9. Data Processing

1. Gebruik de som van het product ionen (met een massatolerantie van ± 250 milli gewichtseenheden [mmu]) in tabel 6 de chromatografische gebieden berekeningen voor elke peptide. Merk op dat de types ion en cijfers alleen worden getoond voor inheemse AP _{1-42 product ionen, omdat ze hetzelfde zijn voor zowel ¹⁵ NAβ 1-42 en ¹³ CAβ 1-42.}
2. Bepaal de gemiddelde responsfactor van beide responsfactor monsters door het oppervlak te delen onder de curve (chromatografische piek) van ¹⁵ NAβ _1-42 waarbij het gebied onder de curve van natieve Aß _1-42.
3. Dient de concentratie van de ¹⁵ NAβ _1-42 voor kalibratie met de responsfactor berekend in stap 9.2 vermenigvuldigen.
4. Construeer een ijkcurve door het gebied verhoudingen van ¹⁵ tot ¹³ NAβ _1-42 CAβ _1-42 van de twee kalibrators tegen de concentratie.
5. Bereken de helling en intercept van de ijklijn met behulp van lineaire regressie.
6. Bereken de oppervlakte verhouding van inheemse Aß _1-42 om de interne standaard ⁽¹³ CAβ _1-42) voor unbekende monsters.
7. Extrapoleren concentratie van onbekende monsters uit de ijkcurve door de helling en intercept verkregen in stap 9.5.

Results

De plaat opstelling in figuur 1 wordt gebruikt voor een volledige plaat van monsters. Als er minder onbekende monsters moeten worden geanalyseerd, de tweede kalibrator, RF, en QC sets moet worden geplaatst na de eerste helft van de onbekende monsters.

Zoals blijkt uit figuur 2, de kalibrators dicht bij de regressielijn met lage standaarddeviaties. Deze methode heeft een lager kwantificering va...

Discussion

Voor de beschreven werkwijze, in plaats van een surrogaat matrix gebruikten we de surrogaat analyt benadering ^{13, 14, 15, 16,} die ijking in menselijke CSF maakt. Het surrogaat analyt benadering omvat twee verschillende isotopisch gelabelde standaards. On ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ wordt gebruikt om de kalibratiekromme in menselijk CSF genereren, terwijl andere ⁽¹³ CAβ _1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Buizen gebruikt voor het verzamelen van SPE-eluaat, maar andere verzamelapparaten kunnen worden gebruikt, zoals 96-wells platen.
Micronic Split TPE Capcluster voor 96 individuele buizen	Micronic	MP53026	Kappen voor Micronic-buizen.
Micronic Loborack-96 wit met hoge deksel gebarcodeerd	Micronic	MPW51015BC3	Houder voor Micronic-buizen.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Wordt gebruikt om helemaal tot de bodem van de LoBind deepwell platen (96-wells) te reiken. Andere smalle tips kunnen ook werken.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold voor Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammoniumhydroxide oplossing, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitril, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Fosforzuur 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidinehydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	Met gebundelde Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovien Serum Albumine, gelyofiliseerd poeder, geschikt voor (voor moleculaire biologie), niet-acetyleerd	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Puur, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniform gelabeld	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniform gelabeld	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000