Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van Drosophila Neuromusculaire Junction morfologie

Summary

Twee beeldanalyse algoritmen, "Drosophila NMJ Morfologie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" zijn gemaakt, automatisch kwantificeren negen morfologische kenmerken van de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ).

Abstract

Synaptische morfologie nauw gerelateerd aan synaptische werkzaamheid en vaak morfologische afwijkingen synaps uiteindelijk tot synaptische defecten. De Drosophila larvale neuromusculaire junctie (NMJ), een gevestigde model voor glutamaat synapsen, is uitgebreid bestudeerd voor decennia. Identificatie van mutaties die NMJ morfologische gebreken bleek een repertoire van genen die synaps ontwikkeling en functie te reguleren. Veel van deze werden geïdentificeerd in grootschalige studies die gericht zijn op de kwalitatieve aanpak van morfologische afwijkingen van de Drosophila NMJ detecteren. Een nadeel van kwalitatieve analyses is dat veel subtiele spelers dragen tot NMJ morfologie waarschijnlijk onopgemerkt. Overwegende dat de kwantitatieve analyses zijn nodig om de subtielere morfologische verschillen op te sporen, zoals analyses zijn nog niet vaak uitgevoerd, omdat ze zijn omslachtig. Dit protocol beschrijft uitvoerig twee beeldanalyse algoritmen "Drosophila 'Drosophila NMJ Bouton Morfometrie', verkrijgbaar als Fiji-compatibel macro's, voor de kwantitatieve, nauwkeurige en objectieve morfometrische analyse van de Drosophila NMJ. Deze methodiek is ontwikkeld om NMJ terminals immunolabeled met de meest gebruikte markers analyseren Dlg-1 en . brp Daarnaast zijn ruimere toepassing op andere merkers zoals Hrp CSP en Syt wordt in dit protocol macro's kunnen negen morfologische NMJ eigenschappen bepalen. NMJ gebied NMJ omtrek aantal boutons, NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones in de NMJ terminal.

Introduction

Cognitieve stoornissen zoals verstandelijke beperking, autisme spectrum stoornis en schizofrenie worden vaak gekenmerkt door abnormale synaptische functie ^{1, 2, 3.} Synaps morfologie en functie zijn nauw verweven; morfologische defecten synaptische defecten veroorzaken en, omgekeerd, zullen afwijkende synaptische transmissie beïnvloeden synaptische rijping en morfologie ^{4, 5, 6.}

Een aantal model organismen zijn gebruikt om beter te begrijpen synaps biologie en licht werpen op hoe synaptische wijzigingen van invloed zijn hersenfunctie bij gezondheid en ziekte ^{7, 8, 9.} De Drosophila NMJ is een uitgebreid bestudeerd en gevestigde in vivo model voor glutamaat synapse biologie ^{10, 11.} In de afgelopen decennia is dit model gebruikt voor fysiologische en gen gerichte studies, alsook voor grootschalige genetische screens, teneinde morfologische verschillen tussen NMS detecteren. In het bijzonder naar voren genetische screens veel cruciale regulatoren en de mechanismen die ten grondslag liggen synaps ontwikkeling geïdentificeerd en de functie ^{12, 13, 14, 15, 16.} De meeste van deze schermen gebruikt visuele beoordeling van NMJ terminal morfologie en kwalitatieve detectie van de synaptische afwijkingen of semi-kwantitatieve scoring van enkele morfologische kenmerken. Dientengevolge zijn vrij subtiel synaptische morfologische abnormaliteiten die niet duidelijk voor het blote oog gemakkelijk gemist. Om te kunnen kwantitatieve verschillen en is uitgebreid op te sporenNMJ moet nauwkeurig worden geëvalueerd door een systematische kwantificering van de morfologische parameters van belang. Het meten van NMJ functies handmatig is omslachtig, vooral wanneer er meerdere NMJ kenmerken van rente en / of bij het uitvoeren van grootschalige genetische screenings. Om multiparametrische, high-throughput morfologische analyses ondersteunen en objectieve kwantificatie te bereiken twee macros "Drosophila NMJ Morfologie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" ontwikkeld ^17. Beide macro's worden uitgevoerd in de open source software voor beeldanalyse Fiji ^18, en kan kwantificeren zowel confocale en nonconfocal beelden.

"Drosophila NMJ Morfologie" maatregelen NMJ terminals immunostained de postsynaptische markeurschijf large-1 (Dlg-1) of het presynaptische mierikswortelperoxidase (HRP), co-gelabeld met de actieve zone marker bruchpilot (Brp). Het kwantificeert negen morfologische Parameters (hieronder verder beschreven) NMJ gebied NMJ omtrek aantal boutons, NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones in de synaptische terminal (figuur 1) . Hoewel een algoritme voor het bepalen van het aantal boutons aanwezig is in deze macro, het niet voldoen aan de criteria voor de nauwkeurigheid ^17. Het aantal boutons goed te kunnen beoordelen, is het noodzakelijk om de "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" macro die speciaal is ontworpen om boutons behulp NMJ preparaten immunologisch gekleurd met anti-synaptotagmin (Syt) of anti-cysteïne snaar proteïne (CSP) kwantificeren gebruiken, en co-immunologisch met Brp. De "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" macro meten van de volgende parameters: aantal boutons, NMJ bouton gebied NMJ lengte NMJ langste tak lengte, aantal eilanden, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve Zones (Figuur 2).

Macro's bestaan uit 3 sub-macros: (I) "Convert stapelen" identificeert alle beschikbare beeldbestanden en creëert Z-hyperstacks en maximale intensiteit projecties van beide kanalen. Als output zal deze macro twee nieuwe bestanden per synaps genaamd "stack_image_name" en "flatstack_image_name" te genereren. II) "Definieer ROI" opeenvolgend open alle maximale projectiebeelden "flatstack_image_name" en reiken het verzoek het interessegebied (ROI) waarin de specifieke synaptische terminal plaats aanwezig is handmatig opgeven. Dit werd uitgevoerd om uitsluiting van synapsen verbinden met aangrenzende spieren en / of andere vormen van synaptische terminals (bijvoorbeeld 1 s) die aanwezig kunnen zijn in de beelden ¹¹ toe. (III) "Analyze" geldt volledig geautomatiseerde analyse om alle delen van de beelden binnen de grenzen van de ROI. Als"Results.txt" waar alle numerieke meting geannoteerd en "res_image_name.tif" wanneer de onderliggende segmentatie door de macro worden toegelicht: Door deze stap wordt de gebruiker beide bestanden te plaatsen. Tijdens beeldanalyse drie structuren zijn afgeleid van elk synaptische terminal: de NMJ overzicht, de NMJ skelet en het aantal Brp-positieve actieve zones. De NMJ omtrek wordt gebruikt om de NMJ stippellijn de omtrek te bepalen en een daaropvolgende afscheiding keerpunt biedt het aantal boutons. Uit het skelet worden vijf NMJ kenmerken afgeleid: de totale NMJ lengte, de som van de lengte van het langste pad dat twee eindpunten (langste scheutlengtes), het aantal niet-verbonden compartimenten per NMJ (aangeduid als "eilanden" ), het aantal vertakkingen en het aantal vertakkingspunten (een aftakpunt verbindt drie of meer vertakkingen). Het aantal actieve zones wordt bepaald in de Brp-kanaal door het tellenBRP-positieve vlekken. De geannoteerde NMJ omtrek (gele lijn), de NMJ skelet (blauwe lijn) en het aantal Brp-positieve actieve zones (aangegeven met witte foci) worden in een resultaat beeld en de metingen van de parameters worden bewerkt om een ​​(. txt) uitvoerbestand (figuur 3).

Drosophila NMJ Morfometrie" en 'Drosophila NMJ Bouton Morfometrie' werden voor het eerst beschreven en uitgebreid gevalideerd door Nijhof et al. ^17. Dit handschrift richt zich op de methodologie om NMJ morfologie te analyseren met behulp van de macro's 'Drosophila NMJ Morfometrie' en 'Drosophila NMJ Bouton Morfometrie'. niettemin, voorafgaand aan macro-ondersteunde analyses NMJ ontledingen en immunokleuring uitgevoerd moeten worden. Dit zijn essentiële stappen, en de combinatie van merkers voor immunohistochemie moet geschikt macro analyses worden. Deze stappen worden kort vermeld in sectie 1 van het protocol en richt de gebruiker referenties beschrijven in detail de protocollen voor deze procedures uit te voeren.

Protocol

1. Eisen Voorafgaand aan Beeldverwerking

1. Voeren Drosophila open boek preparaten derde instar dwalen larven (L3), zoals eerder beschreven ^19.
2. Co-immunolabel Drosophila NMJ terminals met een combinatie van twee markers: Dlg-1 of Hrp met Brp voor analyse "Drosophila NMJ Morfologie" en Syt of Csp met Brp voor analyse "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" ^20.
   OPMERKING: Antilichamen van dezelfde soort kan worden gecombineerd door het voorafgaand merken van een met een antilichaam-conjugatiekit zoals Zenon Alexa Labeling Kits ^17.
3. Afbeelding NMJ terminals behulp van een microscoop naar keuze, bijvoorbeeld fluorescentie (met of zonder apotome) of confocale microscopie.
   1. Het verwerven van een 2-kanaals afbeeldingsstapel van de NMJ terminal.
      1. Pas de microscoop instellingen op een wijze dat kanaal 1verwerft NMJ terminal immunologisch met Dlg-1 (of Hrp, Syt CSP) en het kanaal 2 NMJ terminal immunologisch met Brp.
      2. Eventueel analyseren éénkanaals afbeeldingen (synapsen immunologisch met een antilichaam) met de macro's. Afbeelding NMJs immunolabeled op unieke wijze met Dlg-1 of Hrp voor analyse met "Drosophila NMJ Morfometrie" of Syt of Csp voor "Drosophila NMJ Bouton Morfometrie".
         LET OP: Het is niet mogelijk om synapsen immunostained met enige anti-Brp analyseren.
   2. Exporteer de verkregen beelden als individuele' .tiff bestanden. Keren de kanaalvolgorde voorafgaand aan het uitvoeren van de macro zoniet verkregen zoals aangegeven.

2. Software en installatie

1. Download de macro's: "Drosophila NMJ Morfometrie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfometrie" van de volgende website: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21.
2. Beweeg de cursor naar de map "Macro's update 1", en klik op de verschijning optie "view". Een lijst met de inhoud van deze map zal verschijnen. De map bevat de macro's "Drosophila NMJ Morfometrie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfometrie".
   OPMERKING: De macro's zijn compatibel met Fiji-versies 1.4, die ook is voorzien in dezelfde map. De macro kan niet draaien op recente versies. Gelieve gebruik maken van de meegeleverde versie 1.4. Het is onproblematisch om deze versie te starten, zelfs op computers met een meer recent Fiji versie beschikbaar.
3. Klik op "Download all". De inhoud van de map wordt gedownload naar de computer als een zip-bestand. Pak het gedownloade bestand.
4. Kopieer de Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm en Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm bestanden naar Fiji.app/plugins/ directory. Bij het opnieuw opstarten van het programma, zal de macro's verschijnen aan de onderkant van de Pluginsdrop-down menu.

3. Run Sub-macro "Converteren naar Stack" to Z-projecties en Hyperstacks van de NMJ afbeeldingen te maken

1. Start de grafische interface door het selecteren van Plugins in de werkbalk en kies "Drosophila NMJ Morfometrie" in het dropdown-menu.
2. Definieer de "Unique File String" instelling in de grafische interface van de macro's.
   LET OP: De microscoop software maakt gebruik van een identificatie handtekening aan vliegtuigen en kanalen te organiseren bij het opslaan van stapels als afzonderlijke' .tiff bestanden. De ingevoerde unieke bestand tekenreeks instelling nodig heeft om de handtekening toegewezen door de software op het eerste vlak van het eerste kanaal te specificeren (belangrijk: laagste gebied en het kanaalnummer dient te worden aangegeven).
3. Selecteer alleen de sub-macro "Convert te stapelen" en klik op "OK" en selecteer de map waarin de beelden zich bevinden. Als een van de belangrijkste directory met meerdere submappen is geselecteerd, worden alle individuele' tiff-bestanden binnende belangrijkste directory en submap die overeenkomen met de unieke bestandsnaam reeks criteria zal worden verwerkt.
   1. Als de z-stack slechts één kanaal bevat het selectievakje "kanaal slechts 1".
4. Merk op dat twee nieuwe bestanden NMJ afbeelding per standaard genoemd als stack_image_name en flatstack_image_name zal verschijnen. Bewaar alleen deze stack en flatstack voor verdere analyse. De .tiff file-serie kan worden verwijderd op dit punt, het minimaliseren van de benodigde opslagcapaciteit en het vermijden van mogelijke oorzaken van fouten.

4. Run Sub-macro "Definieer ROI" om de NMJ Terminal Interessante Baken

1. Start de grafische interface van de "Drosophila NMJ Morfometrie".
2. Selecteer alleen het selectievakje "Definieer ROI" en druk op "OK" en selecteer de belangrijkste directory waar de beelden recht flatstack_name worden opgeslagen en druk op "Select". De sub-macro "Definieer ROI" automatisch doorzoekt alle submappenbinnen de geselecteerde belangrijkste directory.
3. Als de eerste projectie geopend, selecteert u de "Freehand selecties" tool in de werkbalk. Met behulp van de muis een selectie die uitsluitend bevat de complete NMJ terminal van rente te trekken en klik op "OK" in het venster "Definieer terminal". De macro zal doorgaan met de volgende projectie.
4. Bakenen de volgende ROI en herhaal tot alle ROI's zijn gedefinieerd. De ROI image bestand met de naam "roi_image_name", worden opgeslagen in dezelfde map als de eerder gegenereerde stack en projectie beelden voor elk van de bewerkte beelden. De uitgang van deze sub-macro is een binair beeld van de ROI in witte letters op een zwarte achtergrond.

5. Run Sub-macro "Analyseren" om NMJ Terminal Features kwantificeren

1. Ga naar de werkbalk, selecteer "Plugins" en gebruik:
   "Drosophila _NMJ_Morphometrics" bij de analyse synapsen immunologisch met anti-Dlg-1 of anti-Hrp (kanaal 1) tezamenmet anti-Brp (2 kanalen) of "Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics" bij de analyse synapsen immunologisch met anti-Syt of anti-Csp (kanaal 1) met Brp (kanaal 2).
   1. Wanneer men afbeeldingskanaal stacks te analyseren (de u-profiel Dlg-1 of HRP voor "Drosophila_ NMJ_Morphometrics" of Syt of Csp voor "Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics") het selectievakje "kanaal slechts 1".
2. Pas de schaal correspondeert met de beelden te analyseren. Als een pixel in het beeld correspondeert met 2,5 urn, geven Scale-Pixels = 1, schaal-afstand in um = 2,5. Indien beide instellingen gelaten op 0, de NMJ oppervlakte, omtrek, lengte en langste scheutlengtes wordt uitgedrukt in aantal pixels.

3. Pas indien nodig de standaard analyse instellingen van de macro. Voer aanpassingen alleen als de sub-macro "Analyse" (deze paragraaf met onbevredigende resultaten, en determined beter instellingen in hoofdstuk 6) heeft run geweest.
4. Vink de selectievakjes "Analyse" en "Wacht" en druk op "OK".
   1. Selecteer de "Wacht" in te schakelen bij het uitvoeren van de sub-macro "Analyseer" op 2 kanaal. Anders fouten in actieve zone te tellen kan plaatsvinden vanwege de beperkte capaciteit computer.
5. Als een nieuw venster "Kies een Directory" wordt geopend, selecteert u de map waar de afbeeldingen zich bevinden en druk op "select". De macro zal analyseren van alle beelden die zijn opgeslagen in de belangrijkste directory en, indien van toepassing, de daaropvolgende mappen (met behulp van de drie bestanden van het uitvoeren van de vorige sub-macros: stack_image_name, flatstack_image_name en roi_image_name). De macro-processen elke afbeelding afzonderlijk en achter elkaar. Dit kan enkele minuten per beeld stack te nemen (afhankelijk van de computer capaciteit).
6. Na het uitvoeren van de macro, mee dat er een nieuw beeld bestand met de naam res_image_name voor elk geanalyseerd synaps opgeslagen zullen crea zijnted in de bovenliggende map te openen. De kwantitatieve metingen zullen worden opgeslagen als "results.txt" bestand.
7. Inspecteer alle resultaat afbeeldingen op te sporen en uit te sluiten van foto's met segmentatie fouten. Mogelijke segmentatie fouten worden beschreven in Tabel 3, samen met advies hoe de instellingen aan te passen om deze te omzeilen. Resultaatbeelden dergelijke segmentatie fouten als voorbeelden in figuur 4.
   OPMERKING: Bij het uitvoeren van de macro met de standaardinstellingen waargenomen in de user interface, er was een nauwkeurigheid van ongeveer 95% bij macro assessment werd vergeleken met handmatige evaluatie ^17.

6. Stel de Macro-instellingen om de afbeeldingen

1. Wanneer meer dan 5% van de beelden is segmentatie fouten laten zien, verken de verschillende algoritmes om te bepalen / kies de meest geschikte macro-instellingen voor de beelden.
2. Passen rollende bal straalwaarde
   LET OP: De rollende bal radiusfunctie trekt de achtergrond van het beeld. Deze functie is van cruciaal belang bij het werken met beelden die op fluorescentie microscopen en / of wanneer de beelden hebben een hoge achtergrondruis. Het aftrekken van de achtergrond zal helpen auto-drempelwaarden stappen van de macro om adequate segmentatie van de NMJ terminals te produceren.
   1. Selecteer drie NMJ Z-projecties (flatstack_image_name beelden gegenereerd door sub-macro "Convert to stack") die representatief zijn voor het beeld dataset zijn.
   2. In de werkbalk, selecteer Afbeelding | Kleur | Split kanalen. Twee beelden worden gemaakt, die een kanaal 1 en het andere kanaal 2.
   3. Uitsluitend het beeld die tot 1 open kanaal, corresponderend met Dlg-1, Hrp, Syt of Csp immunokleuring en beeld Brp kanaal ontdoen door het sluiten van het beeld.
   4. Voer het filter "Aftrekken achtergrond" door "Process" in de werkbalk gevolgd door "Aftrekken Background ..." in het dropdown-menu.
   5. Klik op het voorbeeld checkbox in het popup-venster en stel de rollende bal radius op de waarde die het contrast tussen de synaps en de achtergrond toenemen als in het paneel (Figuur 5A).
      OPMERKING: Zie figuur 5 voor een voorbeeld. In Figure5A, delen van de synaps tonen dezelfde grijswaarden als achtergrond, terwijl in figuur 5A hierna 'rolling ball radius' ingesteld op 500 genereert een sterke contrast tussen de synaps en de achtergrond.
   6. Wanneer de juiste waarde voor de rollende bal radius is gedefinieerd, voert u de "Aftrekken achtergrond" algoritme van de geselecteerde Z-projecties met dezelfde rollende bal radius waarde en sla ze op (in welke directory).
      OPMERKING: De rollende bal radius van 8-bits of RGB afbeeldingen moeten tenminste even groot is als de straal van de grootste object in het beeld dat geen deel uitmaakt van het veld voor. 16-bits en 32-bits afbeeldingen de straal worden inversely evenredig met de beeldpuntwaarde bereik ^22.
3. Bepaal de verschillende auto-drempels die gebruikt zullen worden
   1. Open de Z-projecties opgeslagen in de vorige stap (6.2.6) en kies Afbeelding | Aanpassen | AutoThreshold | Probeer ze alle.
   2. Als een binaire thresholded resultaat zal verschijnen met alle verschillende auto-drempel algoritmen, bepalen wat de meest geschikte algoritme voor de beelden.
      1. Bij het uitvoeren van de macro later, wijzigt de drempel in de macro-instellingen dienovereenkomstig.
      2. Gebruik strengere drempelwaarden zoals "RenyiEntrophy" of "momenten" als de NMJ omtrek drempel en meer tolerante drempels zoals "Li" naar de NMJ skelet bepalen en "Huang" actieve zones bepalen. Wanneer beelden zijn zeer scherp met weinig tot geen achtergrond, gebruik "Huang" als" NMJ outline drempel. Anders delen van de synaps zou kunnen missen nabeeld segmentatie.
      3. Zie Figuur 5B een voorbeeld. Geschikte segmentatie van de synaps wordt verkregen met automatische drempels benadrukt door groene vakjes. Voorbeelden van geschikte niet-drempels door rood vakjes (raadpleeg synapsen bij sterke vergroting). In het laatste, ofwel delen van de synaps ontbreken of delen van de achtergrond opgenomen. Zie referentie 23 voor meer informatie.

4. Bepaal de maximale grootte van de kleine deeltjes
   LET OP: Deze functie zal alle deeltjes gedetecteerd door de NMJ omtrek drempel en Skeleton drempel die kleiner zijn dan de gedefinieerde waarde in de "kleine deeltjes instelling" van de analyse zijn uit te sluiten. Deze waarde wordt in pixels. Deze functie dient als een ruisfilter en is zeer nuttig wanneer hoge niet-uniforme achtergrond (zoals kristallen / stof) aanwezig in de verkregen beelden zijn.
   1. Open de Z-projecties opgeslagen in stap 6.2.6. en stelde weegschaal aantal pixels via Analyse detecteren | Set Scale. Gelden de volgende instellingen: afstand pixels = 1, bekende afstand = 1, pixel aspect ratio = 1 eenheid lengte = pixel en druk op "OK". Klik op de "Oval selectie" tool in de werkbalk.
   2. Met behulp van de muis trek een selectie nauw rond enkele deeltjes die aanwezig zijn in de immunokleuring zijn, maar behoren niet tot de NMJ. Druk op Ctrl + m voor een Windows-gebruiker of cmd + m voor Mac-gebruikers. Een resultaat venster geopend, waarin de oppervlakte van het gekozen aantal pixels deeltjes.
   3. Herhaal de vorige stap meerdere malen met verschillende artefacten in de beelden naar de grootste vervuilende deeltje / artefact gebied te bepalen. Dit zal de waarde in de instelling in te stellen bij het uitvoeren van de macro later. Bij het uitvoeren van de instelling "kleine deeltjes Size" als de kleinste deeltjesgrootte waargenomen pus een marge van 25% macro.
   4. Zie Figuur 5D voor een voorbeeld. Het grootste kristal detecterened heeft een oppervlakte van 112 pixels. De instelling "Kleine deeltjes grootte", bij het verwerken van dit beeld met de macro, moet worden ingesteld tot 125 - 150.

5. Bepaal minimum bouton grootte
   LET OP: Deze functie zal alle boutons gedetecteerd door de NMJ omtrek drempel die kleiner zijn dan de gedefinieerde waarde uit de analyse zijn uit te sluiten. Deze waarde wordt in pixels.
   1. Volgt dezelfde stappen zoals beschreven in paragraaf 6.4, maar in dit geval trek een selectie rond het kleinste boutons in de NMJ terminal. Kies het kleinste oppervlakte die overeenkomt met het kleinste Bouton van de gemeten Ones. Dit is de waarde van het minimum Bouton grootte-instelling in te stellen bij het uitvoeren van de macro later.

6. Definieer "Find maxima noise tolerance" waarde
   1. Gebruik de Z-hyperstacks geselecteerd in sectie 6.2.1.
   2. In de werkbalk, selecteer Afbeelding | Kleur | Split kanalen om crea2 te bereiken (voor kanaal 1 en kanaal 2) en houdt het beeld dat overeenkomt met het Brp open goot. Gooi het andere kanaal te sluiten.
   3. Ga naar het tabblad plugins in het pop-up menu, selecteer Process | Maximum (3D), en wanneer de maximum_image_name verschijnt (die kan een paar minuten duren), sluit het oorspronkelijke beeld stack.
   4. Selecteer de maximale ... image_name (het verkregen beeld stack) en kies Plugins | proces | Minimum (3D), sluit de Maximum ... image_name stack.
   5. In de werkbalk, selecteer Process | Vind maxima .... Een nieuw venster "Find maxima ..." wordt geopend. Klik op het selectievakje "Preview punt selectie ..." en vul de "Noise tolerance" doos met de standaard macro-instelling 50. De maxima punten in het beeld als kruisjes aangegeven.
      1. Verhoog de "Noise tolerance" prijs als de waarneming van een overmaat geannoteerde actieve zones, dus kruisingen die niet bovenop actieve zones die infocus op de gekozen stapel vliegtuig of onjuiste actieve zones die worden gedetecteerd op de achtergrond.
         1. Aan de andere kant, als observeren van onvolledig actieve zones geannoteerde, dwz actieve zones in focus niet wordt bestempeld herkend, verminderen de "Noise tolerance" waarde. Blijf proberen verschillende waarden volgen van deze procedure tot de kruisen op de juiste wijze actieve zones etikettering in focus. Vul het "Find maxima noise tolerance" met deze waarde.
         2. Zie figuur 5C een voorbeeld. Te veel actieve zones worden gedetecteerd. In figuur 5C' alleen de actieve zones in focus gedetecteerd.
   6. Voer de sub-macro "Analyseer" in de representatieve beelden geselecteerd in stap 5.1, met de in de alle voorgaande stappen instellingen.
7. Passen Brp-puncta onder- en bovengrens
   1. Merk op dat een nieuw bestand zal verschijnen nadat u de macro overeenkomstig stap 6,6, genaamd 2_active_zone_stack_image_name. In dit beeld stapel de werkzame zones van de "Find maxima" -functie gedetecteerd worden aangegeven met witte stippen in elk vlak.
   2. Open dit bestand door te slepen en het in de werkbalk en kies Afbeelding | stapel | Zproject | Projectie type = Sum plakjes. Een projectie van de 2_active_zone_stack_image_name wordt verkregen.
   3. Selecteer Afbeelding | Aanpassen | Drempel. Een nieuw venster "Threshold" wordt geopend. Schuif de bovenste balk met een drempelwaarde, waar alle gewenste brandpunten / Brp-positieve vlekken worden gevisualiseerd in het rood te kiezen.
      OPMERKING: Als de drempel te laag is ingesteld, zal een overmaat aan actieve zones worden geteld. Indien te hoog, zal een fractie van de werkzame zones worden gemist.
      1. Zie figuur 5E voor een voorbeeld. Als drempel wordt ingesteld op 400, zijn de meeste van de actieve zones (gesymboliseerd als 1 pixel foci) niet in de segmentatie, omdat ze niet in het rood (figuur 5E). Als drempelwaarde wordt ingesteld op een waarde van 50 de werkzame zones zijn rood (figuur 5E).
   4. Definieer deze waarde minimumdrempel. Laat "Upper puncta drempel" op de maximale waarde.
   5. Voer de sub-macro "Analyseer" in de representatieve beelden met de in alle voorgaande stappen van deze sectie instellingen. Kritisch evalueren van het resulterende beeld bestanden en zorg ervoor dat de segmentatie naar behoren wordt gedaan. Indien dit niet het geval passen de instellingen voor de aard van de segmentatie fouten (figuur 4, tabel 3).

Results

De tekst bestand met resultaten zal verschijnen in de belangrijkste directory. Het vat alle gemeten parameters per beeld. De resultaten zijn gekoppeld aan de bestandsnaam en de parameters worden vervolgens in de in de tabellen 1 en 2 samengevat orde.

Res_image_name is een drie-afbeeldingsstapel. Het eerste beeld wijst de omtrek en skelet van de NMJ terminal bepaald door de macro basis van kanaal 1 (immunokleuring Dlg-1, Hrp, Syt of CSP). Het tweede beeld is een kopie van de eerste afbeelding en toont bovendien de geïdentificeerde Brp-positieve vlekken die worden gedetecteerd in kanaal 2 zoals schematisch foci. De derde beeld geeft de maximale projectie van het tweede kanaal met geïdentificeerde Brp-positieve foci.

De NMJ outline drempel is vertegenwoordigd in gele afbeelding van de macro-uitgang resultaat in. NMJ gebied, Perimeter en het aantal boutons zijn afgeleid van deze drempel.

De NMJ skelet drempel is vertegenwoordigd in blauw toe aan het macro-uitgang resultaat in. NMJ lengte langste tak lengte, aantal vertakkingen, vertakkingspunten en eilanden zijn afgeleid van deze drempel.

De NMJ Active zones drempel is niet vertegenwoordigd imago van de macro-uitgang resultaat in. Deze drempel bepaalt het gebied waar de Brp-positieve foci zou kunnen worden waarmee de macro. Het is bedoeld om een ​​NMJ gebied dat is iets groter dan die gedefinieerd door de NMJ omtrek drempel te creëren. Wanneer een drempel te restrictief is geselecteerd, kan Brp-positieve foci zich aan de rand van de synaps te sluiten. Wanneer de drempel te tolerant, kan achtergrondruis meegeteld Brp-positieve vlekken (figuren 1-2).

om validate de prestaties van de "Drosophila NMJ Morfologie" macro drie mutante voorwaarden die reeds werden beschreven synaptische defecten in verschillende NMJ parameters aanwezig getest. Elke verwonding werd gedetecteerd door een andere afbeelding segmentatieprocedure uitgevoerd door de macro (NMJ schets, skelet of actieve zones, respectievelijk ^17). Na gericht op de drie genen van belang door induceerbare RNAi en het uitvoeren van dissecties en NMJ immunokleuring van L3 larven, werd de macro uit te voeren. De verkregen NMJ morfologische metingen werden vervolgens paarsgewijs (RNAi versus de controle) vergeleken onder toepassing van een t-test. In alle drie gevallen werden statistische verschillen gevonden tussen de mutanten en controles van invloed zijn parameters die in overeenstemming zijn met de eerder gerapporteerde morfologische gebreken. Dit bevestigt dat de macro's zijn inderdaad in staat om eerder beschreven defecten adequaat te identificeren in het Drosophila NMJ.

Ankyrin 2 (Ank2, CG42734) mutanten bekend synaptische morfologie gebreken, waaronder gefuseerde boutons en kleinere NMJs tonen. Deze defecten werden waargenomen voor Ank2 mutanten ^{24, 25} en ²⁶ Ank2 knockdown vliegt. NMJ klemmen van pan-neuronale Ank2- RNAi knockdown vliegen (w, UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi Ank2 KK107238; elav-Gal4 / +) vertoonden significant kleiner NMJ gebied (gemiddelde = 339,25 ^pm2; t-test p = 2,18 x 10 ^-8) en omtrek (gemiddelde = 238,24 urn; t-test p = 1,82 x 10 ^-3), vergeleken met de genetische achtergrond controle dataset (w, UAS-Dicer-2 / UAS-KK60100; elav-Gal4 / + ) (gemiddelde = 451,95 urn ² en gemiddelde = 288,62 urn respectievelijk) na het draaien "Drosophila NMJ Morfologie" (figuren 6A en 4B).

De GTPase Rab3 (CG7576) is vereist voor een goede bruchpilot distributie en RUP mutant presenteert met een significant verminderd aantal actieve zones ^27. Een significante afname van het aantal actieve zones waargenomen bij het meten Brp-positieve foci door de "Drosophila NMJ Morfologie" macro in NMJ klemmen van pan-neuronale Rab3 knockdown vliegen (w, UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi KK100787; elav -Gal4). Het gemiddelde aantal actieve zones per NMJ terminal Rab3 -RNAi was 138 in tegenstelling tot 290 gedetecteerd in de controlegroep dataset (/ +) t-test p = 4,43 x 10 ^-29) (Figuren 6A en 4C).

Highwire (hiw, CG32592) is een belangrijke regulator van NMJ groei; mutaties in hiw gen leiden tot overgroeien en uitgebreide vertakking van de NMJ klemmen ^28. Meten NMJ klemmen van pan-neuronale Hiw -RNAi knockdown leiding (w, UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi-GD36085; elav-Gal4 / +) met "Drosophila NMJ Morfologie", significante verschillen waargenomen in het skelet afgeleide parameters: lengte (gemiddelde = 147,36 urn; controlegemiddelde = 122,07 urn; t -test p = 7,31 x 10 ^-7), langste taklengte (gemiddelde = 122,19 urn; controlegemiddelde = 105,65 urn; t-test p = 4,62 x 10 ^-4) aantal vertakkingen (gemiddelde = 7,69; controle gemiddelde = 5,74; t-test p = 2,52 x 10 ^-2) en het aantal vertakkingspunten (gemiddelde = 2,73; controle gemiddelde = 1,79, t-test p = 3,31 x 10 ^-2). Al deze parameters significant verhoogd (120-180%) vergeleken met de genetische achtergrond controles (w, UAS-Dicer-2 / UAS-GD60000; elav-Gal4 / +) (Figuren 6A en 4D).

Figuur 1: Drosophila _NMJ_Morphometrics Maatregelen 9 Parameters van de Drosophila NMJ. Links staan ​​Dlg-1 en Brp immunologisch NMJ terminals, afgebeeld op een fluorescentiemicroscoop met apotome. Aan de rechterkant zijn resultaat beelden na het uitvoeren van "Drosophila NMJ Morfometrie". Parameters oppervlakte, omtrek en boutons worden vertegenwoordigd door de macro-geannoteerde geel kader aangegeven. Parameters lengte, de langste tak lengte (LBL), takken, vertakking punten, en de eilanden worden door de macro-geannoteerde blauw overzicht. BRP-immunologisch foci (actieve zones) worden voorgesteld door de macro als witte vlekken in de resultaatbeelden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Drosophila NMJ Bouton Morfologie Maatregelen 8 parameters van de Drosophila NMJ. Aan de linkerzijdezijn Syt-1 en Brp immunologisch NMJ terminal afgebeeld op een fluorescentiemicroscoop met apotome. Aan de rechterkant zijn resultaat beelden na het uitvoeren van "Drosophila NMJ Bouton Morfometrie". Parameters boutons en bouton gebied worden vertegenwoordigd door de macro-geannoteerde geel kader. Parameters lengte, de langste tak lengte (LBL), takken, vertakking punten, en de eilanden worden door de macro-geannoteerde blauw overzicht. BRP-immunologisch foci (actieve zones) worden voorgesteld door de macro als witte vlekken in de resultaatbeelden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: stroomdiagram dat Drosophila NMJ Morfometrie en Drosophila NMJ Bouton Morfometrie Macro's. De eerste sub-macro "Convert to stack" creëert uitsteeksels en hyperstacks van de afgebeelde NMJs. De tweede sub-macro 'Definieer ROI' moet handmatig invoeren definiëren van de locatie van de NMJ eindstandige plaats. Sub-macro drie, 'analyseren', het geheel NMJ parameters. Een text bestand met de kwantitatieve waarden en een beeldresultaat file die de parameter afbakening zijn gemaakt om de evaluatie van de macro-prestaties van de gebruiker te helpen. Wanneer de beelden werden onder verschillende omstandigheden, het macro-instellingen moeten worden getest en aangepast om een nauwkeurige analyse te waarborgen. klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Voorbeelden van Ongepast Macro Segmentatie resultaten. Resultaat beelden na het uitvoeren van "Drosophila NMJ Morphometrics" of 'Drosophila NMJ Bouton Morfologie'. Delen van de synaptische terminal niet in de gele lijnen (A). Delen van de achtergrond zijn in de synaptische terminal door de gele lijnen (B). Blue skelet strekt zich voorbij de synaptische terminal. (C - D) Te veel actieve zones worden gedetecteerd (E - E '). Sommige actieve zones onopgemerkt blijven door de analyse (G - G'). actieve zones worden gedetecteerd buiten de synaps (F) Onjuist bouton segmentatie. (Alleen van toepassing bij het uitvoeren Drosophila NMJ Bouton Morfologie), boutons gemist (H) of te veel boutons gedetecteerd door de segmentatie (I). Deeltjes dergelijke kristallen of stof die deel uitmaken van de achtergrond worden in de segmentatie (J) . Informatie hoe u de instellingen om deze fouten te voorkomen wijzigen, worden in Tabel 3 . Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Voorbeelden van Macro-instellingen te wijzigen en de gevolgen daarvan voor Beeld segmentatie. (A) Trek achtergrond voorbeeld van een Dlg-1 immunologisch synaps, afgebeeld op een fluorescentiemicroscoop met apotome, wanneer "rolling ball radius" is ingesteld op 20 (A) of 500 (A). (B) Output beelden verkregen na het uitvoeren van Image | Aanpassen | Auto-drempel | Probeer de afbeelding illustreert segmentatie verkregen door de 16 verschillende auto-drempel algoritmen. (C) "Find Maxima" voorvertoning bij het opzetten van "Noise tolerance" bij 50 (C) en 500 (C'); actieve zones die worden gedetecteerd door de segmentatie worden gemerkt met een kruisje. (D) Meting van de "kleine deeltjes" in het beeld ontstaan achtergrond van een synaps immunolabeled met anti-Hrp, afgebeeld op een confocale microscoop. (E) "Sum slices" projectie verkregen uit de 2_active_zone_stack_ima-ge_name. De drempel wordt vastgesteld op 400 (E) en 50 (E'). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: Macro beoordeling en kwantificering van NMJs op Muscle 4. (A) resultaatbeelden na het lopen "Drosophila NMJ Morfologie" macro on Dlg-1 en Brp immunologisch NMJ terminals. Parameters oppervlakte, omtrek en boutons worden vertegenwoordigd door de macro-geannoteerde geel kader. Parameters lengte, de langste tak lengte (LBL), takken, vertakking punten, en de eilanden worden door de macro-geannoteerde blauw overzicht. BRP-immunologisch foci (actieve zones) worden voorgesteld door de macro als witte vlekken in de resultaatbeelden. De schaalbalk geeft 20 pm. (B) Ankyrin2 RNAi knockdown vertonen een kleiner NMJ oppervlakte en omtrek ten opzichte van genetische achtergrond controles. (C) Rab3 knockdown leidde tot NMS met een lager aantal Brp-positieve actieve zones tegenover genetische achtergrond controles. (D) Highwire knockdown resulteerde in langere, hogere langste tak lang, vertakt en met meer vertakkingspunten per NMJ terminals tegenover genetische achtergrondcontrole NMS. Fout balken geven de SEM, ** p <0,01, tweezijdig T-test. Klik hijopnieuw om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Parameter	NMJ structuur	Uitleg
Area (pm2)	NMJ outline	Het gebied van de volledige gelabelde NMJ
Perimeter (pm)	NMJ outline	De omtrek behoren tot het gebied
#Boutons	NMJ outline	Het aantal synaptische boutons ( 'parels aan een snoer') van de NMJ
Lengte (pm)	Skelet	De totale lengte van de volledige NMJ aansluitpunt
Langste taklengte (pm)	Skelet	De som van de lengte van het langste pad dat twee eindpunten van de NMJ
#Takes	Skelet	Het totale aantal vertakkingen
#Branching punten	Skelet	Het aantal vertakkingspunten (meerdere vestigingen kan ontlenen aan een aftakpunt)
#Islands	Skelet	Het aantal niet-verbonden Dlg1-positieve synaptische compartimenten (of andere vlekken)
#Active zones	BRP-positieve vlekken	Het aantal actieve zones, gebaseerd op Brp kleuring

Tabel 1: NMJ Parameters Gemeten door "Drosophila NMJ Morfometrie". De NMJ parameters gemeten door de "Drosophila NMJ Morfometrie" macro zal verschijnen als een lijst in het verkregen tekstbestand, naar aanleiding van de in deze tabel beschreven volgorde. Deze tabel is overgenomen uit Nijhof et al. ¹⁷

Parameter	NMJ structuur	Uitleg
Boutons	NMJ outline	Het aantal synaptische boutons ( 'parels aan een snoer') van de NMJ
Bouton gebied	NMJ outline	De totale oppervlakte van alle boutons
Lengte (pm)	Skelet	De totale lengte van de volledige NMJ aansluitpunt
Langste taklengte (pm)	Skelet	De som van de lengte van het langste pad dat twee eindpunten van de NMJ
#Branches	Skelet	Het totale aantal vertakkingen
#Branching punten	Skelet	the aantal vertakkingspunten (meerdere vestigingen kan ontlenen aan een aftakpunt)
#Islands	Skelet	Het aantal niet-verbonden Dlg1-positieve synaptische compartimenten (of andere vlekken)
#Active zones	BRP-positieve vlekken	Het aantal actieve zones, gebaseerd op Brp kleuring

Tabel 2: NMJ parameters gemeten door "Drosophila NMJ Bouton Morfometrie". De NMJ parameters gemeten door de "Drosophila _Bouton_NMJ_Morphometrics" macro zal verschijnen als een lijst in het verkregen tekstbestand, naar aanleiding van de in deze tabel beschreven volgorde. Deze tabel is overgenomen uit Nijhof et al. ¹⁷

Segmentatie	Geconstateerde fouten	Voorbeeld	vereiste aanpassingen
NMJ Ruimte en perimeter (Vertegenwoordigd door gele de afbeelding van resultaat in)	Delen van de synaptische terminal zijn ofwel niet opgenomen in de gele lijnen of delen van de achtergrond is opgenomen in de synaptische terminal geschetst in het geel.	Figuur 5A-B	Aanpassen 'Rolling Ball Radius' value. Zie paragraaf 6.1.	Aanpassen 'NMJ outline drempel'. Zie paragraaf 6.2.
NMJ lengte parameters (vertegenwoordigers blauwe skelet lijnbeeld de resultaten)	Skelet blauwe lijn ofwel uitstrekt voorbij is of niet aanwezig is langs de gehele synaptische terminal.	Figuur 5C-D	Aanpassen 'Rolling Ball Radius' value. Zie paragraaf 6.1.	Aanpassen 'NMJ outline drempel'. Zie paragraaf 6.2.
BRP-positieve puncta (Vertegenwoordigd door stippen beeld resultaten in)	Te veel actieve zones worden gedetecteerd.	Figuur 5E-E'	Verlaag de 'Zoek maxima noise tolerance' waarde. Zie paragraaf 6.5.
BRP-positieve puncta (Vertegenwoordigd door stippen beeld resultaten in)	Actieve zones worden gemist door de analyse.	Figuur 5G-G'	Verhoging van de 'Zoek maxima noise tolerance' waarde. Zie paragraaf 6.5.	Verlaag 'Brp-puncta onderdrempel. Zie paragraaf 6.6.
BRP-positieve puncta (Vertegenwoordigd door stippen beeld resultaten in)	Actieve zone artefacten worden gedetecteerd buiten het synaptische terminal.	figuur 5F	Gedeelte Aanpassen 'Active Zone drempel' 6.2.	Verhoging 'Brp-puncta onderdrempel. Zie paragraaf 6.6.
kleine deeltjes	Deeltjes zoals een kristallen of stof die deel uitmaken van de achtergrond lijken te worden opgenomen in de segmentatie.	figuur 5J	Selecteer het vakje 'Verwijder kleine deeltjes'. Zie paragraaf 6.3.	Bepaal kleine deeltjes maximale grootte. Zie paragraaf 6.3.
Bouton segmentatie	Onjuiste bouton segmentatie (Alleen van toepassing op Drosophila NMJ Bouton Morfometrie, gebruik geen Drosophila NMJ Morfometrie voor bouton segmentatie).	Figuur 5H-I	Aanpassen 'NMJ outline drempel'. Zie paragraaf 6.1.	Bepaal 'minimum Bouton size'. Zie paragraaf 6.4.

Tabel 3: Problemen oplossen voor de verschillende soorten van fouten in Image segmentatie die kunnen worden geproduceerd door de Macro's. Deze tabel beschrijft de verschillende soortenimage segmentatie fouten geproduceerd door de macro's. Deze kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd in de resultaten afbeeldingen. Voorbeelden van elk type fout wordt weergegeven in figuur 4. In de "aanpassingen" sectie van de tabel, worden de instellingen die moeten worden aangepast gemarkeerd en de gebruiker wordt verwezen naar de kritische sub-stap van hoofdstuk 6, waarin wordt beschreven hoe u deze instellingen aan te passen.

Discussion

"Drosophila NMJ Morfometrie" en "Drosophila NMJ bouton Morfometrie" zijn krachtige instrumenten voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de evaluatie van synaps morfologie. Handmatige evaluatie van NMJ parameters omslachtig; wordt geschat dat de macro's een ervaren onderzoeker zou besparen tot 15 min / NMJ besteed aan handmatige afbeelding segmentatie. Met 1-2 tientallen synapsen geëvalueerd per aandoening of genotype, vat dit al snel tot aanzienlijke hoeveelheden opgeslagen tijd, zelfs in kleinschalige studies. Bij het uitvoeren van grote schermen, de versterking van het gebruik van high throughput analyse, in vergelijking met handmatige beoordeling en kwantificering, kan enorm zijn. Naast de toegenomen doorvoer macro's bieden gemakkelijk objectieve analyse; ze sluiten persoonlijke vooroordelen die anders verblind experimenten en interpersoonlijke verschillen die optreden wanneer meerdere onderzoekers die betrokken zijn bij de analyse vereisen. Ten slotte is de macro's zorgen voor een gevoelig en nauwkeurig eenALYSE NMJ kenmerken, waardoor de identificatie van synaptische regulatoren die leiden plaats subtieler dramatische NMJ gebreken en tot nu toe gebleven ondergewaardeerd door het oog van de onderzoeker. Gedetailleerde informatie over de validatie procedures en de algoritmes gebruikt in de macro's zijn te vinden in de publicatie Nijhof et al. ^17.

De functionaliteit van de macro's is gevalideerd om adequaat te meten morfologische kenmerken van Drosophila melanogaster NMJs bij spier 4. Vervolgens werd aangetoond dat de macro's waren ook geschikt voor synapsen naar andere spieren te analyseren in dit organisme. Het is waarschijnlijk dat de macro kan ook worden gebruikt om morfologische parameters van NMJ met gelijke opbouw in andere soorten, met inbegrip van andere soorten Drosophila en andere insecten te meten. Zelfs NMJs heel ver in de evolutie, bijvoorbeeld NMJs van muizen, tonen een vrij gelijkaardig structurele conformatie ²⁹. De macro's zijn niet getest op NMJ preparaten uit andere soorten, maar potentiële gebruikers worden aangemoedigd om de macro's te testen voor dergelijke doeleinden.

Het is zeer belangrijk dat de gebruiker de verschillende auto-drempels en algoritmes verkent te definiëren / kies de meest geschikte macro-instellingen voor de beelden. Met deze instellingen wordt een nauwkeurigheid van ongeveer 95% bereikt wanneer macro assessment werd vergeleken met handmatige beoordeling. de macro-instellingen aan te passen aan de juiste segment 100% van de beelden kan een zeer moeizaam of zelfs onmogelijk procedure. Daarom wordt de uitsluiting van de beelden niet goed gesegmenteerd aanbevolen als hun aantallen lager zijn dan 5%. Blijkbaar, als de kwaliteit van de beelden is laag, de macro's zullen hogere verhoudingen van onbevredigende segmentatie te genereren. Lage kwaliteit beelden zullen op dezelfde manier beïnvloeden handmatige evaluatie en kan daarom niet worden gekoppeld aan de prestaties van de macro's. Toch de macro's zijn nogal robuust als ze zijn ontworpen voor hetTussen gegenereerd op een hoog gehalte microscoop (een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop die beeldvorming van grote aantallen monsters mogelijk maakt) ^17.

Een kritisch punt is dat de gebruiker visueel inspecteert alle resultaat beelden gegenereerd door de macro's. Dit zal toelaten op te sporen en uit te sluiten van foto's met onbevredigende segmentatie. In hoofdstuk 6 van dit protocol, wordt de gebruiker geleid hoe u de instellingen voor het correct beeld segmentatie aan te passen bij het uitvoeren van de sub-macro "Analyseren". Om snel vertrouwd te maken met de eisen van de macro's en hoe de macro-instellingen een map met de naam "Examples_adjusting macro-instellingen" aan te passen is opgenomen in de macro repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Dertien submappen, elk met voorbeelden beelden verkregen op verschillende platforms microscoop (hoog gehalte / confocale / fluorescentie microscopen) en verschillende immunokleuring, voorzien. Een PDF getiteld “Voorbeelden gids” is opgenomen in dezelfdemap waar die nodig zijn voor elk voorbeeld instellingen worden voorzien, samen met een tekstdocument het verstrekken van de verwachte resultaten en de resultaten images.

De macro's zijn ontworpen om afbeeldingen die zijn opgeslagen te verwerken als .tiff gescheiden bestanden, toch sommige gebruikers misschien hebben hun foto's in een ander formaat opgeslagen. De volgende website https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a ²¹ bevat een map met de naam "Drosophila NMJ" waar drie voorbeeld-bestanden (Voorbeeld 1-3) en het document "Voorbeelden Guide" met gedetailleerde instructies hoe beelden in de macro importeren zo niet als .tiff gescheiden bestanden die zijn opgeslagen kan ook worden gevonden in dezelfde map.

Together, "Drosophila NMJ Morfometrie" en "Drosophila NMJ bouton Morfometrie" macro's te kwantificeren tien verschillende NMJ kenmerken: NMJ gebied, NMJ perimeter, aantal boutons, NMJ Bouton gebied, NMJ lengte, NMJ langste tak lengte, het aantal islaNDS, aantal vertakkingen, het aantal vertakkingspunten en het aantal actieve zones. Dit zorgt voor een groot voordeel ten opzichte van tot nu toe beschikbare tools die slechts één of enkele synaptische functies ^{30, 31} kunnen beoordelen. Multiparametrische kwantitatieve analyse draagt een groot potentieel voor nieuwe ontdekkingen, bijvoorbeeld om nieuwe regulatoren die een tot vele aspecten van de synaps biologie controle te identificeren. Het biedt ook de vereiste resolutie van genen die precies coregulate dezelfde of overlappende NMJ kenmerken en dus zal rijden op gemeenschappelijke moleculaire pathways bepalen. Tenslotte opent de mogelijkheid om te onderzoeken hoe verschillende synaptische parameters correleren met elkaar onverstoorde staat ¹⁷ en welke genen zorgen deze gecoördineerde morfometrische correlaties.

Bij elkaar genomen, dit protocol laat zien hoe u de twee macro's gebruiken "Drosophila NMJ Morfometrie" en"Drosophila NMJ Bouton Morfologie", die objectief en gevoelige kwantificatie van tien morfologische NMJ functies uitvoeren in een high-throughput manier.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Material	Company	Catalog number	Comments
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Material	Company	Catalog number	Comments
Software
FIJI