Methodenartikel

De bereiding van niet-menselijke primaten Brain Tissue voor Pre-embedding immunohistochemie en elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/55397

⸱

3 april 2017

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier geven we een eenvoudige, goedkope en tijdbesparende protocol chemisch fixeren primaten hersenweefsel met acroleïne fixatief, waardoor langdurig bewaren die compatibel zijn met pre-inbedding immunohistochemie voor transmissie elektronenmicroscopie is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks alle technologische vooruitgang in het licht microscopie niveau, elektronenmicroscopie blijft het enige instrument in de neurowetenschappen te onderzoeken en te karakteriseren ultrastructurele en morfologische gegevens van neuronen, zoals synaptische contacten. Goede conservering van hersenweefsel voor elektronenmicroscopie kan worden verkregen door rigoureuze cryo-fixatie methoden, maar deze technieken zijn vrij duur en beperken het gebruik van immunokleuring, wat cruciaal is voor de verbinding van geïdentificeerde neuronale systemen begrijpen. Vries-substitutie werkwijzen ontwikkeld om de combinatie van cryo-fixatie met immunokleuring mogelijk. Echter, de reproduceerbaarheid van deze methodologische benaderingen meestal gebaseerd op dure bevriezing apparaten. Bovendien, het bereiken van betrouwbare resultaten met deze techniek is zeer tijdrovend en skill-uitdagend. Vandaar dat de traditionele chemisch vaste hersenen, met name acroleïne fixatief, blijft een tijd-efficiënte en goedkope methode om elektronen combinerenmicroscopie met immunohistochemie. Hier verschaffen wij een betrouwbare experimentele protocol gebruik van chemische fixatie acroleïne die leidt tot het behoud van primaten hersenweefsel en is compatibel met pre-inbedding immunohistochemie en transmissie elektronen microscopisch onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Licht microscopie, inclusief confocale en twee-foton microscopie, heeft zich bewezen als een efficiënt instrument voor het bestuderen van in vivo neuronale processen, onder andere 1, 2 zijn. Hoewel de typische ruimtelijke resolutie in het lichtmicroscopische (LM) niveau ongeveer 200 nm, recente technologische ontwikkelingen met verschillende lichtbronnen, zoals extreme ultraviolet en zachte röntgenstraling microscopie, zijn aanzienlijk gestegen het verkrijgen van een nagenoeg 10 nm ruimtelijke resolutie 3 , 4, 5. Andere technologische vooruitgang in de beeldvorming omvatten gecombineerde magnetische resonantie met histologie en een nieuwe werkwijze voor het meten van de dikte van de myelineschede in vivo, een parameter die traditioneel meetbare pas ter Elektronenmicroscopie (EM) niveau 6, 7. although deze voorschotten op de LM niveau bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van het leven processen, een gedetailleerde weergave en karakterisering van structuren, zoals synaptische contacten, kan alleen worden bereikt met EM, dat een resolutie die 0,5 nm kan bereiken biedt. Echter, observatie op de EM niveau vraagt ​​de monsters doden en veranderd te zijn in sommige opzichten, met chemische fixatieven en uitdroging processen, met het oog op de cytoarchitecture behouden. Aldus onderzoeken biologische monsters met hoge resolutie kan een uitdaging zijn door schade straling van de elektronenstraal laag contrast, structurele afwijkingen van membranen, of zelfs de aanwezigheid van artefacten die na dehydratatie en inbedden epoxy 8, 9, 10 kan optreden.

Behoud specimens in hun natieve vorm structurele analyse kan worden bereikt door "Cryo EM verglaasd afdelingen" of CEMOVIS, een snijden benaderinggaat snel invriezen en verankeren het monster in glasachtige ijs en onderzoeken van de gedeelten onder de EM bij een cryogene temperatuur 11, 12. Deze procedure maakt het mogelijk voor het onderzoek van monsters, terwijl ze nog steeds solide en volledig gehydrateerd, zodat het niet langer artefacten veroorzaakt door uitdroging verwerkt 13. Deze werkwijze brengt extra inrichtingen voor cryo-ultramicrotomie, evenals extra apparatuur op de standaard EM, teneinde deze waarneming bij zeer lage temperaturen, hetgeen aanzienlijke meerkosten genereren mogelijk. Bovendien, de CEMOVIS benadering sluit het gebruik van immunokleuring technieken, omdat antilichamen gewoonlijk worden geïncubeerd bij KT. Als alternatief is het mogelijk ultrastructurele analyse immunohistochemische procedures te combineren door een vries-substitutiebenadering, waarbij cryo-vaste preparaten langzaam ontdooid terwijl ondergedompeld in cryo-beschermende chemicaliën en zijn Then ingebed in gespecialiseerde harsen, zoals Lowicryls. Post-inbedding immuunlabeling kan vervolgens worden uitgevoerd op dergelijk materiaal 12. Echter, vries-substitutie en cryo-fixatie technieken zijn tijdrovend. Ze vereisen de installatie van extra apparatuur en moeten nog monsters worden blootgesteld aan organische oplosmiddelen en chemische fixatief dat cytoarchitecture kan veranderen, ondanks het gebruik van een lage temperatuur 14, 15. Vandaar dat ondanks alle technologische vooruitgang zowel op LM en EM niveau chemische fixatie van hersenweefsel, met name acroleïne, blijft een goedkope en tijdbesparende werkwijze voor immunohistochemie combineren met EM 16.

In de afgelopen decennia zijn veel pogingen gedaan om een ​​mengsel van aldehyden die de beste weefsel behoud te bieden te vinden. Voor de jaren 1960, de enige chemische fixeermiddel dat aanvaardbare resultaten voor EM gaf was osmiumtetroxide. Echter, osmiumtetroxide is zeer giftig en duur, zich verzet tegen het gebruik door het vaatstelsel naar organen zoals de hersenen vast. Acroleïne werd geïntroduceerd in de late jaren 1950 als betrouwbare methode voor dierlijk weefsel behoud geschikt voor EM waarneming van cellulaire structuren 17. Penetreert het weefsel dieper en sneller reageert dan andere aldehyden gebruikt worden voor fixatie door onderdompeling en zorgt voor een goede conservering van cytoplasmatische componenten met minimale krimp van het weefsel 17. Een dergelijk kenmerk geeft acroleïne fixatie een duidelijk voordeel boven andere aldehyden bij gebruik in vers weefsel, doordat een nauwkeurigere lokalisatie van levende moleculaire verbindingen, zoals enzymen en andere eiwitten 18. Inderdaad, het is gevalideerd door de jaren als een eenvoudige, efficiënte en goedkope werkwijze voor fixatie voor visualisatie op EM niveau in vele soorten, waaronder amfibieën en knaagdieren, zoals het efficiënt StabiliZes peptiden en eiwitten, antigeniciteit behouden en verschaft relatief intact ultrastructuur bij gebruik in combinatie met een ander aldehyde fixeermiddel 16, 18, 19, 20, 21. Protocollen voor acroleïne fixatie in knaagdieren zijn sindsdien gestandaardiseerd en veel gebruikt, met name door Pickel groep dual immunokleuring inrichting voor EM 16, 22. Enkele groepen acroleïne fixatie gebruikt in hersenen van primaten niet-humaan weefsel 23. Echter, voor zover wij weten, is er slechts één gepubliceerde protocol efficiënter beschrijven chemische fixatie met acroleïne bij niet-menselijke primaten die compatibel is met EM immunokleuring 24 is.

In dit artikel geven we een gemakkelijke en betrouwbare methode om efficiënt chemisch fixeren non-humeen primaat hersenen met acroleïne, waardoor een potentieel langdurige conservering met pre-inbedding immunokleuring en transmissie EM onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: Alle protocollen waarbij dieren werden door het Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval goedgekeurd en werden gemaakt in overeenstemming met de Canadian Council on Animal Care's Guide to de zorg en het gebruik van proefdieren (Ed. 2). De hier beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor volwassen dieren van ongeveer 800 g. De volumina fixeermiddel moet worden aangepast aan de grootte van het dier.

1. Bereiding van oplossingen voor transcardiale perfusie

  1. Bereid 1 liter 50 mM natriumfosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met de volgende stappen. Bereid de oplossing ten hoogste 24 uur voor perfusie en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
    1. Meet 800 ml gedestilleerd water in een bekerglas van 1 liter. Voeg 5,87 g watervrij dibasisch natriumfosfaat (Na2 HPO 4), 1,20 g monobasisch monohydraat natriumfosfaat (NaH 2 PO 4 · H2O) en 9 gnatriumchloride (NaCl). Roer om op te lossen.
    2. Breng de pH op 7,4 door geleidelijke toevoeging van 5 N NaOH. Voeg gedestilleerd water tot een totaal volume van 1 L. bereiken
      WAARSCHUWING: NaOH is een corrosieve chemische verbinding. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's;. Labjas, handschoenen, veiligheidsbril, etc).
  2. Bereid 2 l 4% paraformaldehyde (PFA) volgens de volgende stappen. Deze oplossing moet worden bereid maximaal 24 uur voor de operatie en bewaard bij 4 ° C tot gebruik.
    1. Meet 1,5 liter gedestilleerd water in een 2 liter bekerglas. Voeg 23,48 g watervrij dibasisch natriumfosfaat (Na2 HPO 4) en 4,80 g monobasisch monohydraat natriumfosfaat (NaH 2 PO 4 · H2O). Roer om op te lossen. Voeg gedestilleerd water tot een totaal volume van 2 L. bereiken
    2. Verwarm de oplossing onder een ontluchting kap totdat de temperatuur ongeveer 45 bereikt - 55 ° C. Niet verwarmen tot meer dan 60 ° C.
    3. Voeg geleidelijk 80 g PFA aan de oplossing en geroerd tot volledig opgelost (ongeveer 30-60 min). Houd bewaken van de temperatuur om het onder 60 ° C te houden.
      LET OP: PFA is zeer volatiel in zijn poedervorm. Het is zeer giftig bij contact met de ogen en huid en is gevaarlijk in geval van inademen of inslikken. Slijtage PPE en voorzichtig gebruiken onder een ontluchting kap.
    4. Koel de oplossing af tot 4 ° C en filtreer. Bewaren bij 4 ° C.
  3. Bereid 1 liter 3% acroleïne in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) volgens de volgende stappen. De PB oplossing moet worden bereid maximaal 24 uur voor perfusie.
    LET OP: Acroleine is zeer giftig bij inademing en kan direct schade veroorzaken. Het is ook corrosief en zeer giftig bij opname door de huid. Het is kankerverwekkend en mutageen. Draag geschikte PBM en gebruik ontluchting onder een kap.
    1. Meet 800 ml gedestilleerd water. Voeg 8,66 g watervrij dibasisch natriumfosfaat (Na2 HPO 4) en 5,38 g monobasisch monohydraat natriumfosfaat (NaH 2 PO 4 · H2O). Roer tot alle zouten op te lossen. Voeg gedestilleerd water tot een totaal volume van 1 L. bereiken Bewaar de oplossing bij 4 ° C.
    2. Voor de operatie, overdracht 900 ml van de oplossing PB een 1 liter glazen kolf en voeg 30,94 ml 97% acroleïne-oplossing onder een ontluchting kap. Voeg PB oplossing tot een totaal volume van 1 liter en roer te bereiken. Filtreer de oplossing en houdt deze bij 4 ° C.

2. transcardiale perfusie en Brain Dissection

  1. Houd oplossingen op ijs gedurende de gehele chirurgische procedure. Bereid de pomp door het plaatsen van de buis in de eerste oplossing te gebruiken (PBS, 50 mM) en draaien van de pomp totdat er geen lucht in de slang. Voor het transcardiale perfusie van een makaak, gebruikt een 21 G naald en stel de uitstroom bij ongeveer 80 ml / min.
  2. Verdoven van het dier met een intramusculaire injectie van een mengseltuur van ketamine (20 mg / kg), xylazine (4 mg / kg) en acepromazine (0,5 mg / kg). Handhaaf het dier onder isofluraan (3%) sedatie.
  3. Bevestig poten van het dier naar een ontluchting tafel.
  4. Met een scalpel, verwijder de huid tot aan de oksels. Snijd de buikspieren. Gebruik zware chirurgische schaar aan de ribben lateraal gesneden door zorgvuldig het vermijden van de vitale organen.
  5. Snijd de membraan met chirurgische schaar en verhogen de ribbenkast naar het hart bloot te leggen. Zodra het membraan wordt gesneden, ga dan snel, omdat het hart stopt met kloppen binnen enkele minuten.
  6. Verwijder het pericardium met een scalpel en de naald in het linker ventrikel. Met een scalpel voorzichtig een kleine uitsnijding naar rechts atrium. Snel start de pomp bij 72 mL / min en houdt de naald op zijn plaats. Indien mogelijk, kantelt het dier teneinde de kop hebben op een lager niveau dan het hart.
    LET OP: Wees voorzichtig de interventriculaire septum niet te doorboren bij het inbrengen van de naald.
    1. rinse het bloed met ongeveer 300 ml PBS totdat de longen wit en geen bloed komt uit het rechter atrium.
  7. Stop de pomp snel overdracht van de slang / de buis 3% acroleïne-oplossing en start de pomp opnieuw. Verhoog geleidelijk de pompsnelheid 80 ml / min als de hartslag is gestopt. Perfuseren ongeveer 500 ml van acroleïne-oplossing.
  8. Stop de pomp snel overdracht van de slang op de 4% PFA-oplossing en start de pomp opnieuw. Deze stap vereist ongeveer 1 L PFA.
    OPMERKING: De bevestiging is voltooid wanneer de voorpoten rigide en de nek stijf.
  9. Snijd de kop en zorgvuldig ontleden de hersenen uit de schedel. Zorg ervoor dat de hersenen niet beschadigt met de chirurgische instrumenten. De perfusie is optimaal wanneer de hersenen bleek (geen spoor van bloed) en rigide (figuur 1A).
  10. Dompel de intacte hersenen in 4% PFA gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  11. Serieel stuurde de hersenen met een vibratome koeling (4 ° C)in het gewenste vlak in 50 urn dikke secties en verzamelen in PBS (0,1 M) (Figuur 1B).
    Opmerking: Deze stap kan op verschillende wijze, afhankelijk van het gewenste protocol worden uitgevoerd. Halve bollen kunnen worden gescheiden vóór het uitsnijden of bewaard gehele Vibratome. Als de hersenen is te groot voor de vibratome platform, kan het worden gesneden in kleinere blokken. Na deze stap kunnen gedeelten worden opgeslagen gedurende een lange tijdsperiode bij -30 ° C in een antivries oplossing van 40% PB (50 mmol), 30% glycerol en 30% ethyleenglycol.

3. Pre-inbedding immunohistochemie (Figuur 1C)

  1. Bereid een 4 liter voorraadoplossing van Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, 50 mM, pH 7,6) als volgt.
    1. Meet 2L gedestilleerd water in een 4 liter beker, voeg 24,23 g trihydroxymethyl aminomethaan (THAM; C4-H 11 NO 3) en roer om op te lossen.
    2. Breng de pH op 7,6 met ongeveer 148 ml 1 N HCl. Het zuur moet worden toegevoegd CautiOp vermijden bereiken onder pH 7,6. Het totale volume moet 4 L.
      WAARSCHUWING: HCl zeer corrosief. Draag de juiste PBM.
  2. Selecteer secties (uit stap 2.11) met het van belang zijnde te worden verwerkt voor immunohistochemie EM.
  3. Was de vrij zwevende gedeelten 3x in PBS (0,1 M, pH 7,4) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur aan de antivriesoplossing spoelen.
  4. Bereid een 0,5% oplossing van NaBH4 in PBS verdund.
    1. Weeg 0,05 g NaBH4 en verdund in 10 ml PBS. Niet bedekken. Bereid deze oplossing vlak voor gebruik.
  5. Incubeer de secties in de vers bereide NaBH4 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Wiegen. Niet bedekken.
  6. Was 3x in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, schommelen krachtig tot geen van het reactiegas blijft.
  7. Bereid een blokkeeroplossing EM met 2% geschikte normaal serum en 0,5% visgelatine koud verdund in PBS.
    OPMERKING: De hoeveelheid should worden berekend om verzadigd worden de volgende drie stappen. Gebruik een serum uit dezelfde diersoort gastheer het secundaire antilichaam. Vermijd het gebruik van antigen retrieval methoden of toevoeging van kleine hoeveelheden van Triton (de penetratie van antilichamen te verhogen), omdat deze methoden aanzienlijk de kwaliteit van het weefsel in gevaar brengen.
  8. Incubeer de secties in de blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wiegen.
  9. Bereid primaire antilichaam verdund in blokkeeroplossing.
    Opmerking: De concentratie van het primaire antilichaam doorgaans gelijk LM immunohistochemie, maar overwegen om proeven met verschillende antilichaamconcentraties voren, zoals sommige primaire antilichamen niet werken met acroleïne. Zo is het mogelijk om een ​​combinatie van glutaaraldehyde gebruikt (0,1-2%) en 4% PFA transcardiale perfusie en vergelijkbare resultaten te verkrijgen. Optimaliseren van de incubatietijd en temperatuur ook.
  10. Incubeer de secties primaire antilichaamoplossingnacht bij kamertemperatuur onder rustig schommelen. Een eerder geteste incubatietijd en temperatuur.
  11. Was de secties 3x in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder rustig schommelen.
  12. Maak een 1: 1000 oplossing van gebiotinyleerd secundair antilichaam verdund in blokkeeroplossing.
    Opmerking: Het secundaire antilichaam moet worden opgewekt tegen de gastheersoort gebruikt om het primaire antilichaam te vormen.
  13. Incubeer de secties secundaire antilichaamoplossing gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Wiegen.
  14. Bereid een oplossing van avidine-biotine-peroxidase (ABC) ten minste 60 minuten voor het einde van de tweede antilichaam incubatie.
    1. Gebruik een gekalibreerde pipet 8,80 ul / ml oplossingen A en B te meten en te verdunnen in PBS.
    2. Rots licht gedurende ten minste 60 minuten bij kamertemperatuur met een totale binding tussen avidine en biotine moleculen mogelijk.
  15. Na de incubatie in secundaire antilichaamoplossing was 3x in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  16. Incubeer de secties in het ABC zodatOplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur. Wiegen.
  17. Was eenmaal in PBS en tweemaal in TBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder rustig schommelen.
  18. Bereid een verse oplossing van 0,05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) met 0,005% H2 O2 verdund in TBS.
    1. Weeg 12,5 mg DAB en verdund in 25 ml koude TBS. Beschermen tegen licht.
      LET OP: De DAB poeder is zeer vluchtig en schadelijk bij inademing. Het is kankerverwekkend en teratogeen. Zo moeten zwangere of zogende vrouwen niet dit product te manipuleren, zelfs indien verdund. Gebruik een N95 masker bij het manipuleren en slijtage PPE.
    2. Filtreer de oplossing en voeg 4,5 pl 30% H 2O 2 vlak voor gebruik.
  19. Incubeer secties in DAB oplossing 3-7 minuten bij kamertemperatuur. Wiegen.
    OPMERKING: De bruine neerslag mag niet te donker zijn om een ​​hoog niveau kleuring van de ondergrond te voorkomen. De incubatietijd moet dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd.
  20. Stop de reactie door snel tweemaal wassenin koude TBS, daarna tweemaal gedurende 10 minuten in koude TBS bij kamertemperatuur, gevolgd door tweemaal gedurende 10 min in PB, met een lichte schommelen.
    Opmerking: Het gebruik van PB (en niet PBS) is kritisch om alle sporen van NaCl te verwijderen, aangezien het zou reageren met osmium en vormen kristallen.

4. Osmification and Embedding voor Electron Microscopic Observation

  1. Bereid een oplossing van 1% osmiumtetroxide (OsO4) verdund in PB. Beschermen tegen licht.
    LET OP: Osmium is zeer giftig en mag niet in contact komen met de huid, ogen of mond en mag niet worden ingeademd. Het kan leiden tot de dood als ze worden ingeslikt. Het mag alleen worden gebruikt onder een ontluchting kap en met geschikte PBM.
  2. Incubeer de secties OsO4 oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder de motorkap ontluchting (zonder roeren) en bedek ze met aluminiumfolie om ze te beschermen tegen licht. Volledig plat de secties voorafgaand aan het toevoegen van de OsO4 oplossing.
    LET OP: De secties worden erg donker en rigid en moet worden gemanipuleerd met zorg na deze stap.
  3. Bereid waterafstotende epoxyhars tijdens de osmification.
    1. Voeg geschikte hoeveelheden van elke component van het epoxyharsmengsel (20 g epoxyhars, 20 g hardingsmiddel, 0,6 g versneller en 0,4 g weekmaker) tot een grote plastic beker. Roer met een houten stok of plastic pipet tot een homogene bruine kleur wordt verkregen.
      LET OP: Het is cruciaal om de juiste verhouding van elke component te gebruiken.
    2. Transfer gelijke hoeveelheden aluminium cups van geschikte afmetingen, afhankelijk van het aantal delen te verwerken. Laat het rusten.
  4. Was de osmificated secties 3x in PB 10 min bij kamertemperatuur onder lage snelheid schommelen.
  5. Uitdrogen de secties in de volgende reeks van gegradeerde ethanol gedurende 2 minuten elk 2 maal in 35% ethanol; 1 maal elk in 50, 70, 80, 90, en 95% ethanol; en 3x in 100% ethanol.
  6. Breng de secties om glazen flesjes aan de dehydrati voltooienbetreffende proces incuberen van de secties 3 keer gedurende 2 minuten in propyleenoxide.
    VOORZICHTIG: Propyleenoxide is een zeer vluchtig en toxische organische oplosmiddelen. Het kan ernstige schade aan de ogen en huid veroorzaken in geval van contact of indien ingeademd of ingeslikt. Het is geclassificeerd als een graad 2 kankerverwekkende stof. Het mag alleen worden gebruikt onder een ontluchting kap en PPE. Het is ook zeer brandbaar en moet uit de buurt van een warmtebron worden gehouden.
    OPMERKING: Voorafgaand aan deze stap moet delen zorgvuldig overgebracht in glazen flesjes, aangezien propyleenoxide een organisch oplosmiddel en onverenigbaar met kunststof. Op dit punt, secties zijn erg kwetsbaar en moeten worden gemanipuleerd met zorg. Secties kan ook worden overgebracht in glazen flesjes voorafgaand aan stap 4.5.
  7. Overdracht secties zorgvuldig, een voor een, in aluminium bekers en contact met lucht zoveel mogelijk te vermijden. Vlak insluiten de secties vooraf gemengde waterafstotend epoxyhars en incubeer ze een nacht onder Venting kap bij kamertemperatuur.
    LET OP: Bij deze stap, de secties zijn volledig uitgedroogd en zeer fragiel en moeten worden gemanipuleerd met zorg.
  8. Gebruik van minerale olie, bereid glasplaatjes met vet bekleed met ingevet plastic dekglaasjes.
  9. Zachter het hars door incubatie aluminium cups bij 60 ° C gedurende 12-15 minuten bij de meeste. plat zorgvuldig de secties in de ingevette kant van het glaasje. Plaats de ingevette dekglaasje en voorzichtig duwen de resterende lucht.
  10. Incubeer de objectglaasjes bij 60 ° C gedurende 48 uur.
    Opmerking: Het is cruciaal om ten hoogste 48 uur incubatietijd, de hars te hard wordt.
  11. Verwijder het plastic dekglaasje.

5. Monstervoorbereiding voor Ultradunne Sectioning en observatie met behulp van een Transmission Electron Microscope

  1. Gebruik een verrekijker naar de regio van belang te vinden en snijd een klein vierkant stukje van ongeveer 1 mm 2 met een scalpel.
  2. Vijl het uiteinde van een blok hars en lijm de Quadrangular piece op (afbeelding 1C). Laat de lijm te drogen gedurende ten minste 1 uur of gedurende een nacht voorafgaand aan het snijden.
  3. Met behulp van een ultramicrotoom, snijd het vierkante stuk in 80 urn dikke secties (figuur 1D).
    1. Plaats de hars blok in een ultramicrotoom dek in de verticale positie, met een scherp scheermes, geleidelijke afbouw weerszijden van de hars blok een trapezium met gladde wanden vormen.
    2. Zet het dek in zijn horizontale stand en draai het blok tot de langste zijde van het trapezium naar beneden wijst.
    3. Gebruik een diamant ontbramingsgereedschap of een glas mes op het oppervlak van de vierhoekige stuk trimmen. Stel de ultramicrotoom tot 300 urn dikke secties gesneden in 1 mm / s. Pas het mes verticaal evenwijdig aan het vierhoekige deel en een zeer kleine horizontale hoek van ongeveer 1 ° weergegeven.
      OPMERKING: Deze hoek kan de gebruiker het weefsel benaderen nagenoeg evenwijdig aan het oppervlak van de bvergrendelen wanneer immunologisch elementen eerder zullen vinden. Bij gebruik van deze parameters met de diamant ontbramingsgereedschap, de hars wordt een glanzende witte kleur. Wanneer het weefsel wordt gesneden, verandert of paars groenachtige kleur.
    4. Met een dun 45 ° diamantmes voorzien van een boot gevuld met gedestilleerd water tot 80 urn dikke secties gesneden, glad secties door het over hen met een stuk absorberend papier gestort in xyleen en verzamel seriële secties in formvar beklede nikkel slot roosters of naakte 150 mesh koper roosters (figuur 1E).
  4. Plaats de roosters in een raster opbergdoos.
  5. Vlekken op de netten loodcitraat.
    1. Met een 5 ml spuit en een 0,2 urn spuitfilter met 1 bereid: 1 oplossing van gefiltreerd loodcitraat voorraadoplossing gefiltreerd en gedestilleerd water. Beschermen tegen licht.
      LET OP: De voorraad oplossing van lood citraat moet elke maand vers worden gedaan om de vorming van vaste DEPOS voorkomenhaar. Zie het materiaal blad voor de voorraad recept. Bovendien, als vele series van roosters moeten worden gekleurd, wijzigt de verdunde oplossing als het melkachtig wordt.
    2. Plaats elk rooster op een daling van de verdunde oplossing, waarbij het deel in contact met de oplossing. Incubeer gedurende 3 min.
    3. Met kleine pincet om het net te houden, en spoel in twee bekers met gedestilleerd water.
    4. Verwijder overtollig water door zachtjes met absorberend papier. Bewaar de roosters in een raster doos. Wacht 30 minuten alvorens de secties van transmissie elektronenmicroscopie (TEM Figuur 1F).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze paragraaf presenteren we representatieve resultaten die werden verkregen na de opmerkingen bij de transmissie EM niveau van immunogekleurd primaten hersenweefsel chemisch gefixeerd met een mengsel van 3% acroleïne en 4% PFA. We bereikten goede conservering van de ultrastructuur, zoals aangegeven door de betrekkelijk intacte myelineschede en nette visualisatie van dubbelmembranen (figuur 2A). Synaptische contacten met neuronale elementen van de micro-omgeving, kun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel presenteren we een betrouwbaar protocol voor transcardiale perfusie van niet-humane primaten en pre-inbedding immunohistochemie geschikt voor EM modelexamen. Hoewel typische cryo-EM, zoals CEMOVIS, een goede conservering van de hersenen ultrastructuur, maar beperkt ook het gebruik van immunohistochemie 12. Andere technieken, zoals cryo-substitutie en Tokuyaso techniek laat na inbedding immunohistochemie, maar deze technieken zijn duur als gevolg van extra apparatuur nodig tijdens h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC, 401.848-2.011 naar MP). MP kreeg een carrière onderscheiding van het Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE was de ontvanger van een doctoraatsbeurs van FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Wij danken Marie-Josée Wallman voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O)EM ScienceSX0710-1
Sodium chloride (NaCl)Fisher scientificS271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl EMDHX0603-31 N verdunning. Product is corrosief. Gebruik met geschikte bescherming.
NaOHEMDSX0590-15 N verdunning. Product is corrosief. Gebruik met geschikte bescherming.
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP61484% verdunning. Product is zeer vluchtig in poedervorm en zeer giftig. Gebruik met voorzichtigheid onder een afzuigkap met geschikte bescherming.
Acrolein (90%)Sigma1102213% verdunning. Product is zeer giftig. Gebruik onder een afzuigkap met geschikte bescherming.
Autopsy afzuigtafelMopecCE400
Elektronische perfusiepompcole parmermasterflex L/S 7523-90
Naald (perfusie)terumo NN-1838R18 G 11/2
Naaldterumo NN-2713R21 G 1/2
Ketamine20 mg/kg
Xylazine4 mg/kg
Acepromazine0,5 mg/kg
Scalpel
ScalpelmesjesFeather           lance201011           J9913No.22 voor chirurgie en No. 11 voor EM
Chirurgische schaar
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200SCalibreer de mes voor elk gebruik, wanneer het apparaat het toelaat
Vibratome mesGilletteGIN 642107
GlycerolFisher scientificG33-430% verdunning
EthyleenglycolFisher scientificE178-430% verdunning
Natriumborohydride (NaBH4)SigmaS-9125
Normaal paardenserum (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-1212% verdunning
Koude-visgelatineAurion900.0330,5% verdunning. Origineel product is geconcentreerd bij 40%
Primair antilichaam, SERTSanta Cruz biotechnologySC-14581/500 verdunning
Primair antilichaam, ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25 verdunning
Primair antilichaam, THImmunoStar229411/1.000 verdunning
Biotinyleerd secundair antilichaam, geitVector laboratoriesBA-95001/1.000 verdunning
Biotinyleerd secundair antilichaam, muisVector laboratoriesBA-20001/1.000 verdunning
Vectastain elite ABC-kitVector laboratoriesPK61008,8 µL/mL van A en B elk
3,3'-diaminobenzidine (DAB)SigmaD56370,05% verdunning. Product is zeer vluchtig in poedervorm en giftig. Gooi geen afval in de gootsteen.
Peroxide (H2O2) 30%Fisher scientificH-3230,005% verdunning
Osmiumtetraoxide (OsO4)Electron microscopic science2% 19152
4% 19150
Originele oplossing kan 2 of 4% zijn. Let op welke wordt gebruikt om de uiteindelijke 1% verdunning te berekenen. Product is erg gevoelig voor licht. Osmium is zeer giftig. Gebruik alleen onder een afzuigkap met geschikte bescherming.
Durcupan waterafstotende epoxyharsSigmaA: M epoxyhars (44611)
B: verharder 964 (44612)
C: versneller 960 (DY 060) (44613)
D: weekmaker (44614) 		Polymeriseren 48 uur bij 58 °C voordat het in het afval wordt gegooid.
Alumium bekersElectron microscopic science70048-01
Ethanolcommercial alcohols1019CVerdunnen in gedistilleerd water met geschikte concentratie
PropyleenoxideElectron microscopic science20401Organische oplosmiddel. Zeer vluchtig en giftig. Gebruik onder een afzuigkap.
Niet-gecoate middelgrote glazen plaatjesbrain research laboratories3875-FRVet de oppervlakte in met minerale olie
Kunststoffolie (Aclar inbeddingsfolie)Electron microscopic science50425-25Vet de oppervlakte in met minerale olie
UltramicrotoomLeica UC7EM UC7
Diamant trimgereedschap (ultratrim)Diatome UT 1081Kan alternatief een glasmes gebruiken
Ultra 45° Diatome Diamant mesDiatome MC13437uitgerust met een boot
XyleenFisher scientificX5SK-4
150-mesh koperroostersElectron microscopic scienceG150-cu
rooster-doosElectron microscopic science71138Kan tot 100 roosters bewaren
NatriumcitraatAnachemia81983
LodzijnSigma

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Acrole nefixatieweefselcoupenantilichaaminkubatieDAB kleuringosmiumtetroxideinbedding in epoxyharsultramicrotomie

Gerelateerde artikelen