Gelijktijdige Evaluatie van Cerebrale hemodynamiek en Light Scattering Eigenschappen van de In Vivo Rat Brain behulp Multispectral Diffuse reflectie Imaging

Summary

De gelijktijdige evaluatie van cerebrale hemodynamica en de lichtverstrooiende eigenschappen van in vivo rattenhersenweefsel wordt aangetoond met conventionele multispectrale diffuse reflectie-afbeeldingssysteem.

Abstract

De gelijktijdige evaluatie van cerebrale hemodynamica en de lichtverstrooiende eigenschappen van in vivo rattenhersenweefsel wordt gedemonstreerd met behulp van een conventioneel multispectraal diffuus reflectie-beeldvormingssysteem. Dit systeem is opgebouwd uit een breedband wit lichtbron, een gemotoriseerde filterwiel met een reeks smalband interferentiefilters, een lichtgeleider, een verzamellens, een videozoomlens en een monochromatische charged-coupled device (CCD) camera. Een ellipsvormig craniumvenster wordt gemaakt in het schedelbot van een rat onder isofluraane-anesthesie om in vivo multispectraal diffuus reflectiebeelden van het corticale oppervlak vast te leggen. Regulering van de fractie van geïnspireerde zuurstof met behulp van een gasmengselapparaat maakt de inductie van verschillende ademhalingstoestanden mogelijk, zoals normoxie, hyperoxie en anoxie. Een Monte Carlo simulatie-gebaseerde meervoudige regressieanalyse voor de gemeten multispectraal diffuus reflectiebeelden bij negen golflengten (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 en 760 nm) wordt vervolgens uitgevoerd om de tweedimensionale kaarten van hemodynamica en de lichtverstrooiende eigenschappen van de in vivo rat hersenen te visualiseren.

Introduction

Multispectrale diffuse reflectie beeldvorming is de meest gebruikelijke techniek voor het verkrijgen van een ruimtelijke kaart van intrinsieke optische signalen (IOSs) in corticale weefsel. IOSs waargenomen in de in vivo hersenen worden vooral toegeschreven aan drie fenomenen: variaties in lichtabsorptie en verstrooiing eigenschappen als gevolg corticale hemodynamica, variatie van de absorptie afhankelijk van de reductie of oxidatie van cytochromen in mitochondria en variaties in lichtverspreidingeigenschappen geïnduceerd door morfologische veranderingen ^1.

Licht in het zichtbare (VIS) tot nabij-infrarood (NIR) spectrum effectief geabsorbeerd en verstrooid door biologisch weefsel. Het diffuse reflectiespectrum van de in vivo hersenen wordt gekenmerkt door absorptie en verstrooiing spectra. De gereduceerde verstrooiing coëfficiënten _ps 'hersenweefsel in het golflengtegebied resultaat VIS-NIR naar een monotone verstrooiing spectrum exhibiting lagere magnitude bij langere golflengten. De gereduceerde verstrooiingscoëfficiënt spectrum μ _s '(λ) kan worden gebracht met de vorm van de machtswet functie ^{2, 3} en μ _s' (λ) = a x λ ^-b. De verstrooiing b is gerelateerd aan de omvang van biologische verspreiders in levend weefsel ^{2, 3.} Morfologische veranderingen in het weefsel en afname van de levensvatbaarheid van levend corticale weefsel kan de omvang van de biologische verstrooiers ^{4, 5, 6, 7, 8, 9} beïnvloeden.

Een optisch systeem voor multispectrale diffuse reflectie beeldvorming kan eenvoudig worden opgebouwd uit een gloeilamp livechten bron, eenvoudige optische componenten en een monochromatische geladen gekoppelde inrichting (CCD). Daarom zijn diverse algoritmen en optische systemen multispectrale diffuse reflectie beeldvorming gebruikt voor corticale hemodynamica en / of weefselmorfologie ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18} te evalueren.

De werkwijze beschreven in dit artikel wordt gebruikt om zowel de hemodynamica en lichtverstrooiende eigenschappen van rat cerebrale weefsel in vivo toepassing van een gebruikelijke multispectrale diffuse reflectie-afbeeldingssysteem visualiseren. De voordelen van deze werkwijze boven alternatieve technieken de mogelijkheid tijdruimtelijke veranderingen in zowel cerebrale hemodynamiek en corticaal weefsel evaluerenmorfologie, evenals de toepasselijkheid ervan op verschillende hersendisfunctie diermodellen. Daarom zal de methode die geschikt is voor het onderzoek van traumatisch hersenletsel, epilepsie, beroerte en ischemie.

Protocol

Dierverzorging, voorbereiding, en experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Comité van Tokyo University of Agriculture and Technology Animal Research. Voor deze methode wordt de rat gehuisvest in een gecontroleerd milieu (24 ° C, 12 uur licht / donkercyclus) met voedsel en water beschikbaar ad libitum.

1. Bouw van een conventionele Multispectral Diffuse reflectie Imaging System

1. Mount negen smalbandige interferentiefilters met centrale golflengten van 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 en 760 nm om het filter gaten van de gemotoriseerde filterwiel.
2. Construct een multispectrale beeldvorming onder toepassing van een breedband witte lichtbron, een gemotoriseerd filterwiel met alle hierboven uiteengezette smalbandige interferentiefilters, een lichtgeleider, een collectorlens, een video zoomlens en een monochromatische CCD-camera. De indeling van optische componenten getoond in figuur 2, kan worden aangeduid voois constructie procedure.
   OPMERKING: De belichtingshoek bij benadering 45 ° ten opzichte van het monsteroppervlak.
3. Schakel de halogeenlamp lichtbron naar het oppervlak van het monster verlicht door een interferentiefilter, de lichtgeleider, en de collectorlens.
4. Open de besturingssoftware van de CCD-camera.

2. Bereiding van dieren

LET OP: In dit protocol, werd de rat niet gebruikt worden voor de toekomstige experimenten en het werd onmiddellijk opgeofferd na de metingen van multispectrale beelden.

1. Verbind de inlaatpoort van een inductie kamer naar de uitlaatpoort van een anesthesie machine met een buis. Verbind de uitlaatpoort van de aanzuigkamer de inlaatpoort van de anesthesie machine met een tweede buis.
2. Plaats de rat in de inductie kamer en induceren anesthesie met 5,0% isofluraan. Handhaaf anesthesie op een diepte zodanig dat de rat niet reageert tot teen knijpt. Lower tot 2,0% isofluraan behulp van een draaiknop op het anesthesieapparatuur.
3. Bevestig de rat hoofd in een stereotactisch frame. Bevestig een mondstuk voor anesthesie aan de stereotactische frame.
4. Verbind de inlaatpoort van het mondstuk naar de uitlaatpoort van de anesthesie machine met een buis. Verbind de uitlaatopening van het mondstuk aan de inlaatpoort van de anesthesie machine met een buis.
5. Scheer het hoofd gebied voorbij de aspirant-incisie site met behulp van tondeuses, totdat het huidoppervlak verschijnt.
6. Voeg een longitudinale incisie van ongeveer 20 mm langs de middellijn van de kop met een chirurgisch scalpel (figuur 1 (a)) en bloot onderhuids bindweefsel (Figuur 1 (b)).
7. Verwijder het onderhuids bindweefsel met een scherp curette of een tang en trek aan beide zijden van het hoofd naar het schedelbot (figuur 1 (c)) bloot te leggen.
8. Graaf een ellipsvormige sloot aan het schedelbot in de craniale SuturEs (coronale hechting, sagittale hechting en lambdoid hechting) met behulp van een high-speed boor ( Figuur 1 (d) ).
9. Langzaam en homogeen uitgraven het schedelbeen in de sloot met behulp van de high-speed boor.
10. Druk lichtjes op het oppervlak van de verdunde schedel met de punt van de pincer om de botdikte en kracht te schatten nadat een cerebraal bloedvat verschijnt. Als het verdunde schedelgebied gemakkelijk verdrukt, beëindigt u de vermindering van het schedelbeen met de hogesnelheidsboren.
11. Snijd de ellipsvormige grenslijn van de verdunde schedel af met behulp van de punt van de pincer of kleine chirurgische schaar.
12. Verwijder de verdunde schedel vanaf het hersenoppervlak langzaam en zachtjes met behulp van de pincer.
13. Baden het kranevenster zachtjes met fysiologische zoutoplossing en bedek het met een transparante glazen plaat ongeveer 0,1 mm dik.

3. Regelen van de fractie van geïnspireerde zuurstof

OPMERKING: De ademhalings conditie kan worden veranderd door het regelen van de fractie ingeademde zuurstof _(FiO2).

1. Met behulp van een buis, sluit de eerste poort van een Y-vormige buis connector (connector 1) met de eerste poort van een Y-vormige buis connector (connector 2).
2. Verbind de inlaatpoort van het mondstuk met de tweede poort van de buisverbinding 1.
3. Met behulp van een buis, sluit de derde poort van de buis connector 1 een zuurstofconcentratie beeldscherminrichting.
4. Van een buis, sluit de tweede poort van buisconnector 2 naar de uitlaatpoort van een anesthesiemachine.
5. Met behulp van een buis, sluit de derde poort van de buis connector 2 aan de uitlaatpoort van een gasmengsel inrichting.
6. Sluit één inlaatpoort van het gasmengsel inrichting een hogedruk 95% O _{2-5% CO2} gascilinder via een buis.
7. Het andere inlaatpoort van het gasmengsel inrichting een hogedruk 95% N _{2-5% CO2} gascilinder via een buis.
8. Verander de gasstromen oF O ₂ en N ₂ met behulp van de draaiknoppen op de gasmengselinrichting.
9. Controleer en regel de FiO ₂ met behulp van het zuurstofconcentratiemonitor.

4. Verkrijging van de multispectrale diffuse reflectiebeelden

1. Verkrijging van referentiebeelden
   OPMERKING: De optische componenten die in dit experiment worden gebruikt, zoals de lichtbron, de optische vezel en detectoren hebben hun eigen spectrale eigenschappen. Daarom moet de intensiteit van het licht dat door deze componenten wordt doorgegeven als een referentiebeeld worden opgenomen. Het referentiebeeld is een afbeelding die is gemaakt met een standaard witte diffuser met het licht van de lichtbron.
   1. Zet de standaard witte diffuser op het podium horizontaal.
   2. Focus de camera lens op het oppervlak van de witte diffuser door de zoomring op het vat te draaien.
   3. Pas de integratietijd van de camera aan door de juiste waarde uit dekeuzelijst van integratietijden in de besturingssoftware van de camera zodat de grootste hoeveelheid licht van een signaal dat ongeveer 75% van de maximale tellingen produceert. Tijdens het bekijken van het histogram van beeldpuntwaarden, stel de integratietijd tot het signaal intensiteit ongeveer 75% van de maximale tellingen.
   4. Selecteer de "save" in het menu bestand naar een afbeelding op te slaan in een bestand.
   5. Vervang het filter plaats door draaien van het filterwiel.
   6. Opslaan van een beeld op andere golflengten volgens de hierboven beschreven werkwijze. De bestandsnaam moet het monster en de gebruikte golflengte (bv, W500, W520, W540 ... W760) te identificeren.
2. Overname van voorbeeldfoto's
   Opmerking: Beelden van diffuus gereflecteerd licht intensiteit van de blootgestelde hersenen van de rat om negen golflengten worden opgevangen en opgeslagen op de harde schijf van een personal computer met behulp van dezelfde overname omstandigheden.
   1. Plaats voorzichtig de rin op het podium en langzaam passen podiumniveau zodat de camera kan concentreren op het oppervlak van de rattenhersenen.
   2. Selecteer de "save" in het menu bestand naar een afbeelding op te slaan in een bestand.
   3. Vervang het filter plaats door draaien van het filterwiel.
   4. Opslaan van een beeld op andere golflengten volgens de hierboven beschreven werkwijze. De bestandsnaam moet het monster en de golflengte (bijvoorbeeld R500, R520, R540 ... R760) te identificeren.
3. Overname van donkere beelden
   OPMERKING: De CCD-camera kan een lichtintensiteit in reactie op een elektrisch signaal. Er is echter een aantal kleine productie als gevolg van ruis in de elektrische circuits en detectoren, zelfs als licht gaat niet in op de detector; Dit wordt genoemd: donker huidige lawaai. Voor het nauwkeurig meten van de spectrale intensiteit van het licht, moet de donkerstroom component worden opgenomen als een donkere afbeelding en daarna afgetrokken van het gemeten signaal. Het beeld donker is een afbeelding te nemenn de lichtweg geblokkeerd.
   1. Schakel de halogeenlamp lichtbron.
   2. Blokkeert het lichtpad naar de CCD camera onder toepassing van een afschermplaat.
   3. Selecteer de "save" in het menu bestand naar een afbeelding op te slaan in een bestand. De bestandsnaam moet het monster (bijv Dark) te identificeren.

5. Het visualiseren van het hemoglobinegehalte en de lichtverstrooiing Parameter

LET OP: Een reeks van multispectrale diffuse reflectie beelden wordt opgeslagen op de harde schijf van een personal computer en geanalyseerd offline. Meervoudige regressieanalyse geholpen door een Monte Carlo simulatie ¹⁹ van de multispectrale diffuse reflectie afbeeldingen negen golflengten (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 en 760 nm) wordt vervolgens uitgevoerd om de tweedimensionale visualiseren kaarten van zuurstofrijk hemoglobinegehalte, deoxygenated hemoglobinegehalte, totale hemoglobine concentratie, regionale cerebrale zuurstofverzadiging, en scattering macht. De gedetailleerde algoritme is gepubliceerd in de literatuur ^{17, 18.}

1. Trek dark zowel het monster beeld bij elke golflengte van het referentiebeeld en naar.
2. Normaliseren voorbeeldopname het referentiebeeld door bij elke golflengte λ. Behandel de genormaliseerde afbeelding als de diffuse beeld reflectie R.
3. Bereken de absorptie (of optische dichtheid) Een beeld door het nemen van de logaritme van het omgekeerde van de diffuse reflectie R beeld bij elke golflengte λ:
   (1)
4. Genereer een driedimensionale matrix door het stapelen van de absorptie beelden in de volgorde van hun golflengte, waarbij de x - y vlak toont de structurele informatie verkregen voor de hersenen oppervlak en de z-as toont de spectrale gegevens.
5. Perform een meervoudige regressieanalyse het absorptiespectrum A (λ) bij elke xy coördinaat.
6. Met het absorptiespectrum A (λ) als afhankelijke variabele en de molaire extinctiecoëfficiënt spectra van geoxygeneerd hemoglobine ε _HbO (λ) en gedeoxygeneerd hemoglobine ε _HbR (λ) als onafhankelijke variabelen stap 5.5 (gepubliceerde waarden voor ε _HbO (λ) en ε _HbR (λ) worden gegeven in tabel 1).
7. Controleer de tweedimensionale kaarten (beelden) van de drie verschillende regressiecoëfficiënten een _HBO, een _HbR, en een _0.
8. Genereer een driedimensionale matrix door het stapelen van de beelden van de meervoudige regressie coëfficiënten in de volgorde _HBO, een _HBr en _0, waarbij de x - y vliegtuig toont de structurele informatie die voor het hersenoppervlak wordt verkregen en de z- axis toont de meervoudige regressiecoëfficiënten.
9. Bereken de zuurstofgehechte hemoglobine concentratie C _HbO , de gedeoxydeerde hemoglobine concentratie C _HbR en de verstrooiingsvermogen b uit de set van meerdere regressie coëfficiënten een _HbO , een _HbR en een ₀ op elke xy coördinaat met behulp van de volgende empirische formules (hij waarden van β _{HbO , i} , P _{HbR , i} , en P _{0, i} ( i = 0,1,2,3) zijn _verschaft in tabel 2 ):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Controleer de tweedimensionale kaarten (beelden) van de zuurstof hemoglobinegehalte C _HBO, de deoxygenated hemoglobinegehalte C _HbR en de verstrooiing b.
11. Bereken een tweedimensionale kaart van de totale hemoglobineconcentratie C _HBT door het optellen C _HBO en C _HbR bij elke x - y-coördinaat.
12. Bereken een tweedimensionale kaart van de regionale cerebrale zuurstofsaturatie RSO ₂ Door het delen van de geoxygeneerde hemoglobineconcentratie C _HbO de totale hemoglobineconcentratie C _HBT bij elke x - y-coördinaat.

Results

Representatieve spectrale beelden van diffuse reflectie verkregen uit in vivo rattenhersenen zijn weergegeven in figuur 3. De beelden 500, 520, 540, 560, 570 en 580 nm duidelijk zichtbaar een dicht netwerk van bloedvaten in de cerebrale cortex. De verslechtering van het contrast tussen de bloedvaten en het omliggende weefsel waargenomen in de beelden 600, 730 en 760 nm weerspiegelt de lagere lichtabsorptie door hemoglobine bij langere en NIR golflengten.

Discussion

De meest kritische stap in dit protocol is de verwijdering van de verdunde schedel regio craniale venster maken; Dit moet zorgvuldig worden uitgevoerd om onverwachte bloeden te voorkomen. Deze stap is belangrijk voor het verkrijgen van hoge kwaliteit multispectrale diffuse reflectie beelden met een hoge nauwkeurigheid. Het gebruik van een stereomicroscoop wordt aanbevolen voor de chirurgische procedure, indien mogelijk. Kleine stukjes van gelatine spons zijn nuttig voor hemostase.

Het optisc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
150-W halogeen-lamp lichtbron	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan	LA-150SAE
Lichtgeleider	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan	LGC1-5L1000
Verzamellens	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan	SH-F16
Interferentiefilters l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65088
Interferentiefilters l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65093
Interferentiefilters l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65096
Interferentiefilters l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67766
Interferentiefilters l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67767
Interferentiefilters l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65646
Interferentiefilters l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65102
Interferentiefilters l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#65115
Interferentiefilters l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	#67777
Gemotoriseerde filterwiel	Andover Corporation, NH, USA	FW-MOT-12.5
8-bit monochromatische CCD-camera	THE IMAGINGSOURCE, Germany	DMK21BU618.H
Video zoomlens	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan	VZMTM300i
Spectralon wit standaard met 99% diffuse reflectie	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	SRS-99-020