Method Article

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

May 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een toenemende vraag naar vele biologische monsters analyseren voor de ziekte van begrip en het ontdekken van biomarkers. Kwantitatieve proteomics strategieën waarmee gelijktijdige meting van meerdere monsters zijn wijdverspreid en experimentele kosten en tijd sterk verminderen. Ons laboratorium ontwikkelde een techniek genaamd gecombineerde precursor isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT), welk monster multiplexen van traditionele isotopische labeling of isobare tagging benadering verbetert. Global cPILOT kan worden toegepast op monsters afkomstig uit cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen of hele organismen en geeft informatie over de relatieve abundanties eiwit in verschillende monstercondities. cPILOT werkt door 1) het gebruik van lage pH buffer condities selectief dimethylate peptide N-termini en 2) met behulp van hoge pH buffer omstandigheden primaire aminen lysineresiduen labelen met commercieel verkrijgbare reagentia isobare (zie Tabel Materialen / Reagentia). De mate vansample multiplexen verkrijgbaar is afhankelijk van het aantal gebruikte etiketten precursor en isobare tagging reagens. Hier presenteren we een 12-plex analyse die lichte en zware dimethylering gecombineerd met zes-plex isobare reagentia om 12 monsters van muizenweefsels analyseren één analyse. Verbeterde multiplexing is nuttig voor experimentele tijd en kosten en nog belangrijker verminderen, waardoor vergelijking tussen verschillende monstercondities (biologische replicaten, ziektestadium, drugs, genotypen, of longitudinale tijdstippen) met minder experimentele vertekeningen en fouten. In dit werk wordt de globale cPILOT aanpak waarbij de hersenen, het hart en de lever weefsels door biologische replica's te analyseren vanuit een ziekte van Alzheimer muismodel en wild-type controles. Global cPILOT kan worden toegepast op andere biologische processen te bestuderen en ingericht om sample multiplexen stijgen tot meer dan 20 monsters.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomics gaat vaak gepaard met de analyse van vele monsters gebruikt om ziekteprocessen beter te begrijpen, enzymkinetiek, post-translationele modificaties, als reactie op prikkels uit de omgeving, als reactie op therapeutische behandelingen, de ontdekking van biomarkers of drug mechanismen. Kwantitatieve werkwijzen kunnen worden toegepast voor verschillen in relatieve eiwitniveaus in de monsters te meten en kan labelvrije blijkt of isotopische labeling (metabolische, chemisch of enzymatisch). Stabiele isotopen methoden zijn gegroeid in populariteit omdat ze laten veel monsters tegelijkertijd te analyseren en zijn geschikt voor monsters uit verschillende cellen, we....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: De muizen werden gekocht van een onafhankelijke, non-profit instelling biomedisch onderzoek en ondergebracht in de afdeling Laboratory Animal Resources aan de Universiteit van Pittsburgh. Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Pittsburgh.

1. Eiwit extractie en het genereren van peptiden voor Chemisch-tagging

  1. Extract eiwit uit weefsels, cellen of lichaamsvloeistoffen.
    1. Homogeniseer 60-90 mg weefsel (bijvoorbeeld hersenen, hart en lever) in fosfaatbuffer zoutoplossing (1 x PBS) met 8 M ureum (500 uL....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT gebruikt op amine gebaseerde chemie label peptiden aan de N-terminus en lysine- resten chemisch en verbetert monster multiplexing mogelijkheden. Figuur 2 toont representatieve MS-gegevens die worden verkregen uit een 12-plex cPILOT analyse van hersenen, hart en leverweefsel van een Alzheimer muismodel en wildtype controles. Zoals getoond in tabel 1, zijn twee biologische repliceert voor de ziekte en wildtype muizen Alzheimer in deze 12-plex analys.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT voorziet in de gelijktijdige meting van meer dan 12 unieke monsters. Om succesvol tagging zowel de N-terminus en lysine resten van peptiden te verzekeren, is het noodzakelijk om de juiste pH voor elke set reacties en om de dimethylering eerste reactie uit te voeren voor peptide labeling. Selectieve dimethylatie op de N-terminus wordt uitgevoerd door een pH op ~ 2,5 (± 0,2). Dit wordt bereikt door het benutten van de verschillen van de pKa van de aminogroepen van lysine en N-terminus. Bij pH 2,5, lysine inactief i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de Universiteit van Pittsburgh Start-up fondsen en NIH, NIGMS R01 subsidie ​​(GM 117.191-01) naar RASR.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Water - MS GradeFisher ScientificW6-44 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS GradeFisher ScientificA955-44 L quantity is not necessary
Acetic AcidJ.T. Baker9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Ammonium formateAcros Organics208-753-9
Formic AcidFluka Analytical94318-250ML-F
BCA protein assay kitPierce Thermo Fisher Scientific23227
UreaBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Iodoacetamide (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CysteineSigma Aldrich, Chemistry168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreasSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13CSigma Aldrich, Chemistry596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemistry190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kitProtea BioSciencesSP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) bufferSigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Hydroxylamine hydrochlorideSigma Aldrich, Chemistry255580-100G
Standard vortex mixerFisher Scientific2215365any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridgesWaters186000383These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port modelSigma Aldrich57265A 12 port model is also sufficient
Speed-vacThermo ScientificSPD1010any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamberThermo Scientific2825/2826Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosamplerSciex-This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass SpectrometerThermo Scientific-This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balanceMettler ToledoAL54
Stir plateVWR12365-382Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 bufferFisher Scientific06-664-261Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 bufferFisher Scientific06-664-260Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific05-408-129Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific04-408-120Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter unitsEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 unitsThermo Scientific69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)BrukerPM5/61100/000This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)BrukerPM5/61200/000This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

cPILOTIsobaric TaggingDimethylation LabelingSample MultiplexingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Related Articles