Methodenartikel

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

1 mei 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een toenemende vraag naar vele biologische monsters analyseren voor de ziekte van begrip en het ontdekken van biomarkers. Kwantitatieve proteomics strategieën waarmee gelijktijdige meting van meerdere monsters zijn wijdverspreid en experimentele kosten en tijd sterk verminderen. Ons laboratorium ontwikkelde een techniek genaamd gecombineerde precursor isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT), welk monster multiplexen van traditionele isotopische labeling of isobare tagging benadering verbetert. Global cPILOT kan worden toegepast op monsters afkomstig uit cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen of hele organismen en geeft informatie over de relatieve abundanties eiwit in verschillende monstercondities. cPILOT werkt door 1) het gebruik van lage pH buffer condities selectief dimethylate peptide N-termini en 2) met behulp van hoge pH buffer omstandigheden primaire aminen lysineresiduen labelen met commercieel verkrijgbare reagentia isobare (zie Tabel Materialen / Reagentia). De mate vansample multiplexen verkrijgbaar is afhankelijk van het aantal gebruikte etiketten precursor en isobare tagging reagens. Hier presenteren we een 12-plex analyse die lichte en zware dimethylering gecombineerd met zes-plex isobare reagentia om 12 monsters van muizenweefsels analyseren één analyse. Verbeterde multiplexing is nuttig voor experimentele tijd en kosten en nog belangrijker verminderen, waardoor vergelijking tussen verschillende monstercondities (biologische replicaten, ziektestadium, drugs, genotypen, of longitudinale tijdstippen) met minder experimentele vertekeningen en fouten. In dit werk wordt de globale cPILOT aanpak waarbij de hersenen, het hart en de lever weefsels door biologische replica's te analyseren vanuit een ziekte van Alzheimer muismodel en wild-type controles. Global cPILOT kan worden toegepast op andere biologische processen te bestuderen en ingericht om sample multiplexen stijgen tot meer dan 20 monsters.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomics gaat vaak gepaard met de analyse van vele monsters gebruikt om ziekteprocessen beter te begrijpen, enzymkinetiek, post-translationele modificaties, als reactie op prikkels uit de omgeving, als reactie op therapeutische behandelingen, de ontdekking van biomarkers of drug mechanismen. Kwantitatieve werkwijzen kunnen worden toegepast voor verschillen in relatieve eiwitniveaus in de monsters te meten en kan labelvrije blijkt of isotopische labeling (metabolische, chemisch of enzymatisch). Stabiele isotopen methoden zijn gegroeid in populariteit omdat ze laten veel monsters tegelijkertijd te analyseren en zijn geschikt voor monsters uit verschillende cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen of hele organismen. Isotopen werkwijzen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 toename experimentele doorvoerterwijl het verminderen van acquisitie tijd, kosten en experimentele fout. Deze methoden gebruiken precursor massaspectra relatieve abundanties van eiwitten uit peptidepieken meten. Daarentegen isobare tagging reagentia 8, 9, 10 genereren reporter ionen die ofwel gedetecteerd in MS / MS en MS3 spectra en 11 deze pieken worden gebruikt voor het rapporteren van de relatieve abundanties van eiwitten.

De huidige stand van de techniek in proteomics multiplexing ofwel een 10-plex 12 of 12-plex isobare tag analyse 13. Verbeterde monster multiplexing (dwz> 10 monsters) methoden ontwikkeld door ons laboratorium voor weefsels 14, 15, 16, 17 en anderen voor de analyse van cellen 18 sup>, 19, 20, 21 weefsels of gerichte peptiden 22. We ontwikkelden een verbeterde multiplexing techniek genaamd gecombineerd voorloper isotopische labeling met isobare tagging (cPILOT). Global cPILOT is nuttig om informatie over de relatieve concentraties van eiwitten in verschillende monstercondities (≥12) 14. Figuur 1 toont een algemene werkstroom cPILOT. Tryptische of Lys-C peptiden selectief gelabeld aan de N-terminus met behulp dimethylering lage pH 2 en lysineresten met 6-plex reagentia met behulp van hoge pH. Deze strategie verdubbelt het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd isobare reagentia die helpt om experimentele kosten en bovendien verminderen, vermindert experimentele werk en tijd.

cPILOT is flexibel als we andere methoden hebben ontwikkeld om oxidatieve post-translationele modi te bestuderencaties, waaronder 3-nitrotyrosine gemodificeerde eiwitten 14 en cysteïne bevattende peptiden met S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. We hebben ook een aminozuur selectieve aanpak, cysteïne cPILOT (cyscPILOT) 17. MS3 verkrijgen met een top-ion 11 of selectief y 1 -ion werkwijze 15 kan helpen verminderen reporter ion interferentie en verbetering kwantitatieve nauwkeurigheid van cPILOT. Het gebruik van MS3 in het verwerven werkwijze vereist een hoge-resolutie welks orbitrap massa-analysator hoewel lage resolutie iontrap instrumenten mogelijk ook 24.

Eerder heeft cPILOT is gebruikt om de lever eiwitten 16 studeren aan de ziekte van muismodel van Alzheimer. Hier beschrijven we hoe de wereldwijde cPILOT analyses uit te voeren met behulp van de hersenen, hart en homogenaten lever naar de rol van de randapparatuur, te bestuderenry bij de ziekte van Alzheimer. Dit experiment omvat biologische replicatie. Vanwege de veelzijdigheid van cPILOT, kunnen geïnteresseerde gebruikers van de techniek gebruiken om andere weefsels te studeren voor een scala aan biologische problemen en systemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: De muizen werden gekocht van een onafhankelijke, non-profit instelling biomedisch onderzoek en ondergebracht in de afdeling Laboratory Animal Resources aan de Universiteit van Pittsburgh. Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Pittsburgh.

1. Eiwit extractie en het genereren van peptiden voor Chemisch-tagging

  1. Extract eiwit uit weefsels, cellen of lichaamsvloeistoffen.
    1. Homogeniseer 60-90 mg weefsel (bijvoorbeeld hersenen, hart en lever) in fosfaatbuffer zoutoplossing (1 x PBS) met 8 M ureum (500 uL) met een mechanische homogenisator. Protease of fosfatase remmers kan aan de buffer worden toegevoegd indien nodig. In dit project werden ze niet gebruikt. Gebruik de volgende parameters voor de homogenisator: lyseren matrix A kralen, 4 m / s, 20 s. Hartweefsel kan tot 9 cycli van homogeniseren vereisen.
      OPMERKING: Protease of fosfatase inhibitor en kan aan de buffer worden toegevoegd indien nodig. Ze werden niet gebruikt in deze studie.
      1. Verwijderen weefsel homogenaat uit de lyserende buis overbrengen naar een micro-centrifugebuis. Spoel lyseren buizen met 100-500 pi PBS met 8 M ureum en voeg de spoeloplossing met weefsel homogenaat.
    2. Centrifugeer de gehomogeniseerde weefsels (9447 x g, 4 ° C, 15 minuten) en verzamel de bovenstaande vloeistof.
  2. Bepaal de eiwitconcentratie onder gebruikmaking van een bicinchoninezuur (BCA) assay volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Verdere verdunning met buffer kan nodig zijn als de eiwitconcentratie te hoog. De resulterende concentraties van monsters van deze weefsels waren tussen 6-13 ug / ul.
    1. Facultatief: voeg een interne kwaliteitscontrole standaard (bijvoorbeeld runder a caseïne of andere exogene eiwit) met een verhouding van 1 gg standaard: 100 ug eiwitmonster.
jove_title "> 2. steekproefspijsvertering

  1. Voeg 100 g (100 x 10 -6 g) eiwit van elk monster afzonderlijk gelabelde micro-centrifugebuizen. De omvang is afhankelijk van de eiwitconcentratie (zie stap 1.2).
  2. Voeg dithiothreitol (DTT) (40: 1 reagens molverhouding monster) aan elk monster. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. De berekening van de molverhouding is gebaseerd van de eiwitmassa van runderserumalbumine (BSA), dat 66,5 x 10 3 g / mol.
  3. Voeg joodaceetamide (IAM) (80: 1 reagens molverhouding monster) aan elk monster. Incubeer op ijs in het donker gedurende 2 uur. Deze reactie wordt uitgevoerd op ijs gedurende 2 uur nevenreacties te voorkomen.
  4. Add L-cysteïne (40: 1 reagens molverhouding monster) aan elk monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  5. Voeg 20 mM Tris-buffer met 10 mM CaCl2 (pH 8,2) ureum verdunnen tot een eindconcentratie van 2 M.
  6. Add L-1-tosylamido 2-fenylethyl chloormethylketon (TPCK) behandeld trypsine (50: 1 substraat molverhouding enzyme) aan elk monster en incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
  7. Schrik de eiwitvertering van flash-bevriezen van het monster in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot verdere verwerking.

3. Voorbeeld Ontzouten

  1. Opnieuw zuur de monsters door toevoeging van mierenzuur (FA). Voeg genoeg FA tot een uiteindelijke concentratie van 0,1% te verkrijgen. Als monsters die oorspronkelijk bij -80 ° C, ontdooien monsters op ijs alvorens opnieuw verzuring.
  2. De zout-peptiden middels C18 hydrofiel lipofiel evenwicht (HLB) 10 mg patronen zoals eerder beschreven 16.
  3. De monsters door vacuüm centrifugeren (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) tot een volume van ~ 10 pi.

4. dimethylering Labeling (N-termini)

  1. Reconstitueren peptiden in 1% azijnzuur (0,25 ug / ul) opgelost in hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) of nano-zuivere kwaliteit water. Verwijderen 50 μ, G portie van een nieuwe micro- centrifugebuis (1,5 ml) en bewaar de rest bij -80 ° C.
  2. Voeg ul van 60 mM (4%) CH of O (v 20% gew /) respectievelijk 8 2 O (37% gew / v) 60 mM (4%) 13 CD 2 de monsters voor merken met lichte of zware dimethylering, . Typisch wordt 4 pl reagens per 25 ug peptiden (stappen 4.2, 4.3, 4.6) toegevoegd.
  3. Voeg 8 pi 24 mM NaBH3CN of 24 mM NaBD CH3CN het gelabeld met lichte of zware dimethylering respectievelijk monsters.
  4. Vortex en schudden op een buis schudder 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Blus de reactie door toevoeging van 16 gl 1% ammoniak (~ / v 28-30% v) gedurende 5 minuten. Typisch wordt 8 pl reagens per 25 ug peptiden toegevoegd.
  6. Opnieuw zuur de reactiemengsels door toevoeging van 8 pi 5% FA (98% v / v).
  7. Combineer de lichte en zware dimethyl peptiden (figuur 1) tot een totaal van zes monsters genereren. Zie tabel 1 voor een beschrijving van het monster tagging en pooling gebruikt voor deze studie.
  8. Voeren ontzouten monster volgens de stappen 3.2 en 3.3.

5. Isobaric Tagging (Lys resten)

  1. Reconstitueren 100 ug gedimethyleerd peptiden (1 ug / ul) in 100 mM tri-ethyl ammoniumbicarbonaat (TEAB) -buffer (pH ~ 8,5).
  2. Bereid isobare reagentia, zoals vermeld in het protocol van de fabrikant (zie tabel of Materials / reagentia).
  3. Voeg oplosbaar isobare reagentia (41 pl) peptiden en vortex voor ~ 10 s. Schud de monsters op een micro-centrifugebuis schudder 1 uur. Blus de reactie met 8 pi hydroxylamine (10% w / v) en incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. de zes gelabelde monsters te bundelen tot een enkel mengsel en ontzouten (Stappen 3,1-3,3) en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik.
    LET OP: Voor het verbeteren van proteoom dekking en diepte, een multi-dimensionale scheiding strategie wordt gesuggereerdzoals sterke kationuitwisseling (SCX).

6. Sterk Kationenuitwisselings

  1. Voer SCX volgens het protocol van de fabrikant (zie Materials Table).
    1. Bereid ~ 1 ml ammoniumformaat oplossing (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM en 500 mM) met 10% acetonitril (ACN), 0,1% FA (pH 3).
    2. Verwijder de rode dop van de bovenkant van de pipetpunt en tik de pipetpunt met verpakking slurry zodat het verpakkingsmateriaal is naar de bodem van de pipetpunt.
      LET OP: Kritiek: Gooi de pipetpunt tot het einde van het protocol.
    3. Plaats de centrifuge adapter op de bovenkant van een micro-centrifugebuis (2 ml) en zet de pipetpunt binnen.
    4. Voeg 150 ul van SCX reconstitutie buffer om pipet tips.
    5. Centrifugeer de pipetpunten gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur (4.000 xg). Herhaal deze stap nog twee keer en het afval weggooien.
    6. Los de peptides in 150 pl buffer SCX reconstitutie. Waarborgen dat de pH 3.
    7. peptiden toe te voegen aan de pipet tips, centrifuge (zie 6.1.5), en houden de eluens.
    8. Breng de filter en pipet naar een nieuwe micro- centrifugebuis (2 ml) en voeg 150 ul van 20 mM ammoniumformaat oplossing. Centrifugeer gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur (4.000 xg) en houdt het elutiemiddel.
    9. Herhaal stap 6.1.8 nog zeven malen waarbij opeenvolgende concentraties (dat wil zeggen 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM en 500 mM) ammoniumformiaat.
  2. Breng de acht SCX fracties micro-centrifugebuizen (1,5 mL) en concentreer ze door centrifugale verdamping (zie stap 3.3).

7. vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) en MS3

  1. Reconstitueren de peptiden in massaspectrometrie kwaliteit water met 0,1% FA, filter, en plaats in een autosampler flesje. Filter peptiden als follows:
    1. Voeg gereconstitueerd peptiden aan een micro-centrifugebuis die een 0,65 urn filter (zie Materialen tabel).
    2. Centrifugeer peptiden bij 12.000 xg gedurende 1 minuut. Filter verwijderen, verwijderen, toevoegen gefiltreerd peptiden in een autosampler flesje.
  2. Bereid de mobiele fase buffers als volgt: 3% (v / v) ACN met 0,1% FA (A) en 100% ACN met 0,1% FA (B).
  3. Injecteren 6 pi van elke fractie SCX monster op een val kolom gepakt tot 2 cm met C18 materiaal (5 urn, 200 A poriegrootte).
    OPMERKING: Sample schoonmaak op de val is als volgt: 3 min, 0% B; 3 pl / min met een 2D vloeistofchromatografiesysteem (zie Materialen tabel).
  4. Voer de analytische scheidingswerkwijze. Een 75 um ID x 13,2 cm laser uitgetrokken uiteinde fused silica capillaire kolom gepakt met C18 materiaal (5 urn, 100 A). De gradiënt: 0-5 minuten, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
  5. Voer de gegevensverwerving voor de massaspectrometer terwijl de analytische scheidingswerkwijze wordt uitgevoerd.
    Opmerking: De parameters voor de MS survey scan zijn: 400-1,600 m / z 60.000 resolutie, automatische versterkingsbesturing (AGC) targeten 1 x 10 6 ionen, maximale injectietijd van 500 ms. Parameters voor CID-MS / MS zijn: Top 07/01 of 14/08 Top data afhankelijke acquisitie (DDA), 3 m / z isolatie breedte 500 minimumsignaal, 35% genormaliseerd botsingsenergie (NCE), 0,25 q activering , 10 ms activeringstijd, 3 x 10 4 AGC 50 ms maximale injectietijd. Parameters voor HCD-MS3 zijn: 200 minimumsignaal, 4 m / z isolatie width, 60% NCE, 0,1 activeringstijd, 3 x 10 5 AGC 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS selectiereeks , exclusief niet-gefragmenteerde ouder ion.
  6. Voer elke analyse in duplo Voor de bovenste 1-7 en 8-14 top loopt.
    Opmerking: Voor monsters lopen op een nieuwer model van een instrument dat een orbitrap of tribride massaspectrometer wordt DDA parameters variëren en kan worden geoptimaliseerd om MS / MS en MS3 scans omvatten. Bovendien wordt voor tribride instrumenten, synchrone precursor selectie (SPS) -MS 3 worden toegepast.

8. Data Analysis 16

  1. Zoeken in de RAW-bestanden met behulp van eiwit analyse software tegen een geschikte database, zoals muis Uniprot.
    LET OP: Het is belangrijk om twee workflows voor elk RAW-bestand aan te maken om te zoeken voor lichte en zware digemethyleerde peptiden.
  2. Zoek de RAW bestanden met de volgende parameters: trypsine met twee gemiste splitsingen, peptide massabereik 300-6,000 Da, 15 ppm ouder massatolerantie, 1 Da fragmentatie tolerantie. Statische wijzigingen: licht dimethylering (28,031, peptide N-terminus) of heavy dimethylering (36,076 Da, peptide N-terminus), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
    Opmerking: soms zware digemethyleerde piek ~ 7 Da (35,069 Da, peptide N-terminus) tussen het licht digemethyleerd piek en derhalve moeten in de zoektocht workflow voor zware digemethyleerde peptiden worden opgenomen. Dynamische modificaties: oxidatie (15,995 Da, M), 6-plex isobare tag (229,163 Da, K). Onder een lokken databankonderzoek valse discovery basisrente (bijvoorbeeld 1 en 5%) en een kwantificering knooppunt te zoeken naar de reporter ionenintensiteiten van isobare labels.
  3. Statistieken
    1. gegevensuitvoer in een elektronisch spreadsheetprogramma om eiwitreportermolecuul ion waarden normaliseren. Voor elk eiwit, verdeel ofwel de mediaan reporter ionverhoudingen of ruwe reporter ionintensiteiten de mediaanratio van de interne standaard of ruwe reporter ionintensiteiten van de interne standaard, respectievelijk. Gebruik de juiste statistische software zoals een elektronische spreadsheet-programma, Perseus, of R om significante veranderingen bij steekproef voorwaarden vast te stellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT gebruikt op amine gebaseerde chemie label peptiden aan de N-terminus en lysine- resten chemisch en verbetert monster multiplexing mogelijkheden. Figuur 2 toont representatieve MS-gegevens die worden verkregen uit een 12-plex cPILOT analyse van hersenen, hart en leverweefsel van een Alzheimer muismodel en wildtype controles. Zoals getoond in tabel 1, zijn twee biologische repliceert voor de ziekte en wildtype muizen Alzheimer in deze 12-plex analys...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT voorziet in de gelijktijdige meting van meer dan 12 unieke monsters. Om succesvol tagging zowel de N-terminus en lysine resten van peptiden te verzekeren, is het noodzakelijk om de juiste pH voor elke set reacties en om de dimethylering eerste reactie uit te voeren voor peptide labeling. Selectieve dimethylatie op de N-terminus wordt uitgevoerd door een pH op ~ 2,5 (± 0,2). Dit wordt bereikt door het benutten van de verschillen van de pKa van de aminogroepen van lysine en N-terminus. Bij pH 2,5, lysine inactief i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de Universiteit van Pittsburgh Start-up fondsen en NIH, NIGMS R01 subsidie ​​(GM 117.191-01) naar RASR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Water - MS GradeFisher ScientificW6-44 L hoeveelheid is niet noodzakelijk
Acetonitrile - MS GradeFisher ScientificA955-44 L hoeveelheid is niet noodzakelijk
Acetic AcidJ.T. Baker9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Ammonium formateAcros Organics208-753-9
Formic AcidFluka Analytical94318-250ML-F
BCA protein assay kitPierce Thermo Fisher Scientific23227
UreaBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Iodoacetamide (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CysteineSigma Aldrich, Chemistry168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreasSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13CSigma Aldrich, Chemistry596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemistry190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kitProtea BioSciencesSP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) bufferSigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Hydroxylamine hydrochlorideSigma Aldrich, Chemistry255580-100G
Standard vortex mixerFisher Scientific2215365elke mixer kan worden gebruikt
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridgesWaters186000383Dit zijn C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port modelSigma Aldrich57265Een 12 poorts model is ook voldoende
Speed-vacThermo ScientificSPD1010elke merk van speed vac is voldoende
Water bath chamberThermo Scientific2825/2826Elke merk van een waterbad met gecontroleerde temperaturen is voldoende.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosamplerSciex-Dit model is niet langer beschikbaar. Elke nano LC met een autosampler is voldoende.
LTQ Orbitrap Velos Mass SpectrometerThermo Scientific-Dit model is niet langer beschikbaar. Andere hoge resolutie instrumenten (bijv. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, of Orbitrap Fusion Lumos) kunnen worden gebruikt.
Protein software (bijv. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balanceMettler ToledoAL54
Stir plateVWR12365-382Elke merk van roerplaten is voldoende
pH meter (Tris compatiable)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Elke merk van een pH meter is voldoende
pH 10 bufferFisher Scientific06-664-261Elke merk pH buffer 10 is voldoende
pH 7 bufferFisher Scientific06-664-260Elke merk pH buffer 7 is voldoende
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific05-408-129Elke merk van 1.5 mL eppendorf tubes is voldoende
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific04-408-120Elke merk van 0.6 mL eppendorf tubes is voldoende
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter unitsEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 unitsThermo Scientific69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)BrukerPM5/61100/000Dit item is niet langer verkrijgbaar bij Bruker. Alternatief vulmateriaal met vermelde specificaties zal voldoende zijn
C18 packing material (5 µm, 200 Å)BrukerPM5/61200/000Dit item is niet langer verkrijgbaar bij Bruker. Alternatief vulmateriaal met vermelde specificaties zal voldoende zijn

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2(2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dimethylation LabelingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Gerelateerde artikelen