Methodenartikel

Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen

DOI:

10.3791/55410

⸱

23 maart 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier laten we zien hoe dendritische routering van Drosophila merg neuronen in de kolommen en lagen te analyseren. De werkstroom een ​​dual-beeldvorming techniek om de beeldkwaliteit en computerhulpmiddelen voor opsporing, registratie dendritische assen aan de hand kolommatrix en voor de analyse van dendritische structuren in 3D te verbeteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In veel regio's van het centrale zenuwstelsel, zoals de vlieg optische lobben en de vertebraat cortex worden synaptische circuits georganiseerd in lagen en kolommen hersenen bedrading tijdens de ontwikkeling en informatiesystemen ontwikkeld in dieren te vergemakkelijken. Postsynaptische neuronen uitgebreide dendrieten in type-specifieke patronen in bepaalde lagen om synaps met de juiste presynaptische terminals. De fly merg neuropil bestaat uit 10 lagen en ongeveer 750 kolommen; elke kolom wordt geïnnerveerd door dendrieten van meer dan 38 soorten merg neuronen, die overeenkomen met de axonale terminals van ongeveer 7 soorten afferentia in een type-specifieke manier. Dit rapport beschrijft de procedures voor het imago en de dendrieten van merg neuronen te analyseren. De workflow bestaat uit drie onderdelen: (i) de dual-view beeldvorming sectie combineert twee confocale image stacks verzameld op orthogonale oriëntaties een hoge resolutie 3D-beeld van dendrieten in; (Ii) de dendrite opsporing en registratie sectie sporen dendritischepriëlen in 3D en registreert dendritische sporen met de referentie-kolom-array; (Iii) de dendritische analyse deel wordt dendritische patronen ten opzichte van kolommen en lagen, waaronder laagspecifieke beëindiging en vlakke projectierichting van dendritische spillen afleidt ramingen van dendritische vertakking en beëindiging frequenties. De protocollen maken gebruik van aangepaste plugins gebouwd op het open-source MIPAV (Medical Imaging verwerking, analyse en visualisatie) platform en aangepaste gereedschapskisten in de matrix laboratorium taal. Samen vormen deze protocollen een volledige workflow de dendritische routering van Drosophila medulla neuronen in lagen en kolommen analyseren, om celtypen te identificeren, en om defecten in mutanten bepalen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens de ontwikkeling neuronen uitgebreide dendrieten in complex maar stereotype vertakte patronen synapsen met hun presynaptische partners. Dendritische vertakking patronen correleert met neuronale identiteit en functies. De locaties van dendritische priëlen bepalen het type presynaptische inputs die zij ontvangen, terwijl de dendritische vertakking complexiteit en veld maten regelt de input nummer. Zo dendritische morfologische eigenschappen zijn cruciaal determinanten van synaptische connectiviteit en neuronale berekening. In veel regio's van complexe hersenen, zoals de vlieg optische kwabben en gewervelde netvlies worden synaptische circuits georganiseerd in lagen en kolommen informatieverwerking 1, 2 vergemakkelijken. In dergelijke kolom en laag organisatie presynaptische neuronen van een afzonderlijke modaliteit project axonen te eindigen bij een bepaalde laag (zogenaamde layer-specifieke targeting) en een ordelijke tweedimensionale matrix vormen (zogenaamde called topografische kaart), terwijl de postsynaptische neuronen uit te breiden dendrieten van de juiste afmetingen in bepaalde lagen om presynaptische ingangen van de juiste soorten en aantallen ontvangen. Terwijl axonale targeting lagen en kolommen is goed bestudeerd 3, 4, is veel minder bekend over hoe dendrieten worden naar specifieke lagen en vergroten de juiste maat receptieve velden synaptische verbindingen met de juiste partners presynaptische 5 vormen. De moeilijkheid van de beeldvorming en kwantificeren van dendritische richten naar lagen en kolommen heeft de studie van de dendritische ontwikkeling in zuilvormige en gelamineerde hersenstructuren belemmerd.

Drosophila merg neuronen zijn een ideaal model voor het bestuderen van dendritische routing en circuit assemblage in de kolommen en lagen. De fly merg neuropil is georganiseerd als een 3D rooster van 10 lagen en ongeveer 750 kolommen. Elke kolom wordt geprikkeld door een set afferentia, waaronder photoreceptors R7 / R8 en lamina neuronen L1 - L5, waarvan de axonen terminals vormen topografische kaarten in een laag-specifieke wijze 6. Ongeveer 38 soorten merg neuronen zijn aanwezig in elke kolom merg en uitgebreide dendrieten in specifieke lagen en met de juiste veld maten om input te ontvangen van deze afferenten 7. De synaptische circuits in de medulla werden gereconstrueerd op het elektronenmicroscopische niveau; Zo zijn de synaptische samenwerking gevestigde 7, 8. Bovendien genetische hulpmiddelen voor etikettering verschillende soorten neuronen medulla zijn 9, 10, 11. Bij de behandeling van drie soorten transmedulla (Tm) neuronen (Tm2, Tm9 en TM20), hebben we eerder geïdentificeerd twee cel-type-specifieke dendritische attributen: (i) Tm neuronen projecteren dendrieten in zowel de voorste of achterste richting (vlakke projectie richting), afhankelijk van het type cel en (ii) dendrieten van neuronen medulla beëindigen specifieke medulla lagen in een celtype-specifieke wijze (laagspecifieke beëindiging) 12. Planar projectierichting en laagspecifieke beëindiging voldoende om deze drie soorten Tm neuronen differentiëren, terwijl mutaties die Tm reacties op laag en kolom signalen verstoren invloed verschillende aspecten van deze kenmerken.

Hier presenteren we een complete workflow voor de behandeling van dendritische patroonvorming van Drosophila medulla neuronen in lagen en kolommen (figuur 1). Ten eerste tonen we een dual-beeldvorming methode, die aangepaste software gebruikt twee confocale beeld combineren stapels van hoge kwaliteit isotrope beelden genereren. Deze methode vereist slechts conventionele confocale microscopie om beelden van hoge kwaliteit die het mogelijk maken voor een betrouwbare tracering van dendritische filialen te genereren, zonder toevlucht te nemen tot super-resolutie microscopie, zoals eens STED (gestimuleerde emissie uitputting) of structurele verlichting. Ten tweede presenteren we een methode voor het opsporen dendritische assen en voor het registreren van de resulterende neurieten sporen een referentie kolommatrix. Ten derde, tonen we de computationele werkwijzen voor extraheren van informatie over het vlakke projectierichting en laagspecifieke beëindiging van dendrieten, en voor het afleiden schattingen dendritische vertakking en beëindiging frequenties. Samen zijn deze methoden is het mogelijk voor de karakterisering van dendritische patronen in 3D, de indeling van celtypen op basis van dendritische morfologie, en de identificatie van mogelijke gebreken in mutanten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Het protocol bevat drie secties: dual-view imaging (secties 1-3), dendritische tracing en registratie (secties 4-6), en dendritische analyse (secties 7-9) (figuur 1). De codes en voorbeeld bestanden worden in Tabel of Materials / Equipment.

1. Dual-Image Acquisition

LET OP: Deze stap is bedoeld om twee beeld stapels van het neuron van belang te verwerven in twee orthogonale (horizontaal en frontaal) oriëntaties.

  1. Bereid fly hersenen die dun bevatten gelabelde neuronen medulla (~ 10 cellen / brein kwab) met een membraan GFP merker (mCD8GFP), zoals eerder beschreven 12. Vlekken de hersenen met konijn anti-GFP (voor medulla neuron dendrieten) en muis mAb24B10 (voor fotoreceptor axons), primaire antilichamen en fluorescerende secundaire antilichamen (Alexa 488 anti-konijn en Alexa 568 anti-muizenantilichamen), zoals eerder beschreven13. Schakel de hersenen in 70% glycerol in 1x PBS.
  2. Aan de hersenen in het horizontale oriëntatie mount (figuren 2A, B), breng het glycerol vrijgemaakt fly hersenen een 20 ul druppel antifade montage medium in het midden van een dia.
  3. Bevestig kleine stukjes klei op de 4 hoeken van het dekglaasje om te voorkomen dat het dekglaasje van het breken van de hersenen monster tijdens de montage.
    OPMERKING: De klei pleisters schokdempende het dekglaasje voorkomen breken het monster. Elke klei pleister moet ongeveer 1 mm in diameter.
  4. Onder een microscoop ontleden, de positie van de hersenen in het ventrale-up positie en plaats de dekglaasje op de top naar de hersenen te beveiligen. Met het convexe dorsale oppervlak van de hersenen als een plaats toe aan de oriëntatie van de hersenmonster (Figuur 2A) te identificeren.
  5. Het verkrijgen van de eerste afbeelding stapel (horizontale mening) met een confocale microscoop. Met een hoge-NA objectieflens (zoals een 63x NA 1,3 glycerol of olie-immersie objective lens) en 2.5x digitale zoom (de pixelgrootte is 0,105 micrometer per pixel; middeling nummer 2). Verwerven dan 180 optische secties (512 x 512 pixels) aan de medulla neuropil met een stapgrootte van 0,2 urn omvatten.
  6. Monteer de hersenen, zoals beschreven in de stappen 1,3-1,4, maar richt de hersenen in de anterior-up positie (vooraanzicht).
  7. Het verwerven van de tweede afbeelding stapel (vooraanzicht) van hetzelfde neuron, zoals beschreven in stap 1.5.
    LET OP: Het vinden van hetzelfde neuron kan een uitdaging zijn als er tal van neuronen gelabeld in de optische kwab. Om dezelfde neuronen te identificeren uit beide richtingen, kunnen lagere vergroting image stacks van beide visies nodig (bijvoorbeeld gebruik maken van een zoom van 0,7, en een stapgrootte van 0,45 pm tot image stacks lage resolutie te verwerven). Als de afbeelding groter is dan 512 x 512, moet het beeld worden bijgesneden tot 512 x 512 voordat imago combinatie, en de pixelgrootte zou moeten houden op 0,105 micrometer per pixel, terwijl het afbeelden van het grote veld. Signaalverliesis een potentieel probleem voor deep tissue. Als het signaal zwak is, de ventrale beeld hersenhelft. Om fotobleken te verminderen tijdens het scannen, gebruik maken van een zo laag laservermogen mogelijk te maken. Gebruik de range indicator om te controleren of overbelichting voor het verwerven van het stacks. Indien mogelijk, gebruik van een confocale microscoop uitgerust met GaAsP detectoren.
  8. Identificeer en noteer de locatie van het neuron van belang met betrekking tot het merg neuropil (rechts / links [R / L] en de dorsale / ventrale [D / V]). Controleer of het monster tijdens beeldacquisitie bewogen door het onderzoeken van het beeld stack.
    LET OP: Sample bewegen is vaak het gevolg van onjuiste bevestiging. Als monster beweging optreedt, kan het beeld stack niet worden gebruikt voor de registratie en moet worden weggegooid. Re-mount het monster en het verwerven van beeld stacks van dezelfde neuron.

2. Afbeelding Deconvolutie

LET OP: De deconvolutie stap maakt gebruik van beeld deconvolutie software om de verkregen beelden die worden afgebroken door vervagen herstellenen lawaai. Hoewel deze stap is optioneel, verbetert aanzienlijk de beeldkwaliteit. Het wordt aanbevolen om deconvolved beeld stacks voor beeldregistratie en de combinatie te gebruiken in hoofdstuk 3.

  1. Start het deconvolutie programma in de interactieve modus. Laad de afbeelding stapel (in LSM of specifieke microscopische formaat) door te kiezen voor Menu: File / Open (of Ctrl-o) in het hoofdvenster.
  2. Klik hier voor de geladen afbeelding stapel te selecteren en kies Menu: Ops om het beeld operatie te openen. Gebruik de standaard Classic Maximum Likelihood Estimation (cmle) algoritme.
  3. In de afbeelding operatie venster, klikt u op het tabblad "Parameters". Voer de juiste parameters voor de lens onderdompeling medium, inbedding medium, en numerieke lensopening (bijvoorbeeld olie, glycerine, enz.) (Bv, immersie olie, enz.) (NA, hier 1,3 werd gebruikt). Controleer de resterende parameters om ervoor te zorgen dat ze correct weerspiegelen de beeldvorming omstandigheden. Klik op het tabblad "Zet alle geverifieerd" te finAlizé de parameterinstellingen.
  4. In de afbeelding operatie venster, klikt u op het tabblad "Operation". Een uitvoerbestemming toe te wijzen (bijvoorbeeld c). Voer de juiste nummers in "Signal / Noise per kanaal" (bijvoorbeeld "12 12 12 12" is een goed uitgangspunt, terwijl de standaardinstelling is "20 20 20 20"). Gebruik standaardinstellingen voor de overige parameters.
  5. Klik op het tabblad "Commando uitvoeren" om te beginnen deconvolueren de afbeelding stapel; Dit proces duurt maximaal tientallen minuten in beslag, afhankelijk van de computer.
  6. In het hoofdvenster, klik en selecteer de deconvolved afbeelding stapel. Kies Menu: Opslaan als om de deconvolved afbeelding op te slaan in het beeld ICS-bestandsformaat (.ics en .ids).
    LET OP: Elk beeld stapel heeft twee bestanden: het bestand ics bevat de header-informatie en het bestand ids bevat het ruwe beeldinformatie.
    1. De naam van de afbeelding stapel dossiers volgens de beeldvorming richting (bijvoorbeeld de naam van de horizontale-view beeld skopspijkers H.ids en H.ics en de frontale-view beeld De stapel F.ids en F.ics).

3. Dual-view Beeldcombinatie

Opmerking: Deze stap combineert twee beeld stapels met hoge resolutie 3D-beelden met behulp van de MIPAV software te genereren.

  1. Het genereren van matrices voor het combinatie.
    1. Start het MIPAV programma. Laad de H en F image stacks door Menu te kiezen: Bestand image / Open (A) van de schijf (of Ctrl-f) /H.ids en F.ids; het venster toont twee beelden.
    2. Selecteer imago van de H door te klikken op de afbeelding en kies Menu: Utilities / Conversie Gereedschap / RGB / Grays; het venster zal GrayG, GrayB en GrayR beelden tonen.
    3. Sluit GrayR en GrayB, alleen houden GrayG op het raam.
    4. Selecteer imago van de F door te klikken op de afbeelding en kies Menu: Utilities / Conversie Gereedschap / RGB / Grays. Het venster wordt GrayG1, GrayB1 en GrayR1 beelden tonen.
    5. Sluit GrayR1 en GrayB1 en blijf alleen GrayG1 op het raam. Bij deze stap alleen GrAYG en GrayG1 zijn op het raam.
    6. Selecteer de GrayG (hoogtepunt), kiest u Menu: Algorithms / Registratie / Geoptimaliseerd Automatische beeldregistratie; de "Geoptimaliseerde Automatic Image Registratie 3D" dialoogvenster verschijnt.
      1. In de Input Options, verander de "Graden van de vrijheid" van default "Affine-12" naar "Specifieke herschalen-9." In "rotaties," -toets in -105 tot 105 in de "Rotation angle sampling range" (standaard: -30 tot 30 graden), 10 in de "Grof hoek increment" (standaard: 15 graden), en 3 in het "Fijn angle increment "(standaard: 6 graden).
    7. Klik op OK; de eerste Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" zullen worden gegenereerd en opgeslagen in de map afbeelding. Sluit alle vensters imago van de en ga verder met de volgende stap; deze stap ten minste 15 minuten duren.
    8. Laad de H en F image stacks door te kiezen voor Menu: File image / Open (A) van de schijf (of Ctrl-f) /H.ids en F.ids, zoals in stap 3.1.1.
    9. Selecteer imago van de H door te klikken op de afbeelding en kies Menu: Utilities / Conversie Gereedschap / RGB / grijs; de "RGB-> Gray" dialoogvenster verschijnt. Klik op OK; het venster toont "HGray" beelden. Houd HGray en sluit imago van de H.
    10. Herhaal stap 3.1.9 voor het de F; de "FGray" beelden verschijnt op het venster. Houd FGray en sluit imago van de F; alleen HGray en FGray zal worden overgelaten op het raam.
    11. Selecteer de afbeelding HGray (markeren) en ga naar Menu: Algorithms / Transformatie gereedschap / Transform. De "Transform / Resample Image" dialoogvenster verschijnt. Klik op het tabblad "Resample" en verander de resample de grootte van de "HGray" tot "FGray". Klik vervolgens op de tab "Transform" en load "GrayG_To_GrayG1.mtx" door het selecteren van de "Lees matrix van het bestand." Klik op OK; het venster beeld HGray_transform tonen. Sluit de HGray afbeelding, zodat alleen HGray_transform en FGray worden achtergelaten op het raam.
    12. Selecteer de "HGray_transform & #34; image (markeren) en ga naar Menu: Algorithms / Registratie / Geoptimaliseerd Automatische beeldregistratie. De "Optimized Automatic Image Registratie 3D" dialoogvenster verschijnt. In "rotaties," -toets in -5 tot 5 in de "Rotation angle sampling range" (standaard: -30 tot 30 graden), 3 in de "Grof hoek increment" (standaard: 15 graden), en 1 in het "Fijn angle increment "(standaard: 6 graden). Klik op OK.
      LET OP: De Affine Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) zullen worden gegenereerd en opgeslagen in de map afbeelding en het beeld "HGray_Transform_register" zal op het scherm worden getoond. Deze stap zal minstens 40 minuten duren.
    13. De afbeelding te sluiten "HGray_transform"; Alleen "HGray_Transform_register" en "FGray" moet worden overgelaten aan het raam.
    14. Selecteer de "HGray_Transform_register" image (highlight) en ga naar Menu: Algorithms / Registratie / B-Spline automatische registratie 2D / 3D. De "B-Spline Automatic Registration-3D intensiteit "dialoogvenster verschijnt. Kies" Least Squares "in de Cost-functie (de standaard is Correlatie Ratio).
      1. Klik op 'Voer twee-pass-registratie ". In de sectie Pass 1, toets 2 in "Gradient Descent Minimaliseer Step Size (sample units)" (de standaard is 1) en toets 10 in "Maximum aantal iteraties:" (de standaard is 10). In de sectie Pass 2, toets 1 in "Gradient Descent Minimaliseer Step Size (sample units)" (de standaard is 0.5) en toets 2 in "Maximum aantal iteraties:" (de standaard is 10).
        LET OP: De NLT matrix, "HGray_transform_register.nlt," zal worden opgeslagen in de map afbeelding en het beeld "HGray_transform_register_registered" zal op het scherm worden getoond. Deze stap zal minstens 5 minuten duren.
    15. Sluit alle beelden op het raam.
  2. Het genereren van het referentiebeeld voor het combinatie.
    LET OP: Deze stap is bedoeld om GENERaten een geregistreerd beeld horizontaal voor combinatie.
    1. image F belasting H en stapels door te kiezen voor Menu: File / Open afbeelding (A) van de schijf (of Ctrl-f) /H.ids en F.ids; twee beelden worden weergegeven op het raam.
    2. Selecteer imago van de H (highlight) en ga naar Menu: Algorithms / Transformatie gereedschap / Transform; de "Transform / Resample Image" dialoogvenster verschijnt. Klik op het tabblad "Resample" en verander de resample van een grootte van "H" naar "F." Klik vervolgens op de tab "Transform" en load "GrayG_To_GrayG1.mtx" door "Lees matrix van het bestand." Klik op OK; imago van de H_transform verschijnt op het venster. Sluit imago van de H, maar houd H_transform en F in het venster.
    3. Selecteer de "H_transform" image (highlight) en ga naar Menu: Algorithms / Transformatie gereedschap / Transform; de "Transform / Resample Image" dialoogvenster verschijnt. Klik op het tabblad "Resample" en verander de resample van een grootte van "H_transform" tot "F. & #34; Klik vervolgens op de tab "Transform" en load "HGray_transform_To_FGray.mtx" door "Lees matrix van het bestand." Klik op OK; het beeld "H_transform_transform" verschijnt op het venster. Sluit beeld H_transform; op dit moment alleen H_transform_transform en F altijd in het venster.
    4. Selecteer de "H_transform_transform" image (highlight) en ga naar Menu: Algorithms / Transformatie gereedschap / Transform-lineair; de "Niet-lineaire B-Spline Transformatie" dialoogvenster verschijnt. Vervolgens load "HGray_transform_register.nlt" en klik op OK; het beeld "H_transform_transform_registered" verschijnt op het venster. Sla de afbeelding op als een ICS-bestand. Sluit alle beelden op het raam.
  3. De combinatie van beeld stacks
    OPMERKING: Deze stap is om twee beeld stacks verworven in orthogonale richtingen (horizontaal en frontaal) te combineren in een hoge resolutie stack.
    1. Ga naar het menu: Plugins / Algemeen / Drosophila retinale Registrationl; de "Drosophila retinale Registratie v2.9" dialoogvenster verschijnt. Upload "H.ics" in beeld H, "H_transform_transform_registered" vanaf stap 3.2.4 in Afbeelding H-Geregistreerd, "F.ics" in Afbeelding F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" vanaf stap 3.1.7 in Transformation 1-Green (optioneel ) "HGray_transform_To_FGray.mtx" vanaf stap 3.1.12 in transformatie-2 Affiene en "HGray_transform_register.nlt" vanaf stap 3.1.14 in transformatie 3-lineaire (optioneel).
      1. Selecteer sqrt (Intensity-H x Intensity-F) en No herschalen in "Rescale H F." Houd de standaardopties voor de overige parameters. Klik op OK; deze stap zal ongeveer 3 minuten duren.
        LET OP: Na de verwerking, 3 sets van afbeeldingen worden gegenereerd: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (de laatste gerecombineerde afbeelding), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (groene kanaal voor H, F, en de uiteindelijke gerecombineerde afbeelding), en redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (rode kanaal foR H, F, en de uiteindelijke gerecombineerde afbeelding); alle output bestanden worden verkleind tot 512 x 512 x 512.
    2. Open "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" onder het beeld visualisatiesoftware. Sla de afbeelding op stapel in de IMS-formaat en naam van het bestand; Dit gecombineerd beeldbestand zal worden gebruikt voor neuriet opsporing en registratie.

4. Neuriet Tracing en referentiepunt Assignment

OPMERKING: Deze stap is om neurieten (4.1) op te sporen en aan referentiepunten toe te wijzen voor de registratie (4.2) met behulp van het beeld visualisatiesoftware.

  1. tracing neurieten
    1. Start de afbeelding visualisatiesoftware. Open het gerecombineerde beeldbestand. Ga naar het menu: Bewerken / Show Display Aanpassingen en schakel de fotoreceptor kanaal (rood).
    2. Visualiseer de afbeelding in "Overtref" mode. Schakel "stereo" en gebruik de "Quad Buffer" mode te visualiseren 3D-beelden als de computer is equipped met een stereograph systeem.
    3. Ga naar het menu: overtreffen / filamenten om nieuwe vezels toe te voegen. Klik op de "Skip automatisch aanmaken, handmatig bewerken" tab.
    4. Klik op het tabblad "Trek" en selecteer "AutoDepth."
    5. Selecteer "Instellingen," check "Line", en de sleutel in een passend aantal pixels voor een betere visualisatie (een 4-pixel lijn wordt gebruikt in dit protocol). Vink "Show Dendrieten", "beginpunt" en "vertakkingen". Stel "Render Quality" tot 100%.
    6. Selecteer de "Trek" tab en start het traceren van neurieten. Begin met de axon en vervolgens te verplaatsen naar de dendrieten (Figuur 2D). Het axon en dendrieten van transmedulla neuronen zijn gemakkelijk te onderscheiden.
      LET OP: Een Tm neuron breidt haar axon uit de cel lichaam en projecteert de hele weg naar de hogere visuele verwerking center, de lobula. Het systeem zal automatisch de eerste lange gloeidraad als axon en de resterende korte filamenten definiërendendrieten. Houd het startpunt aan het begin van de draad (axon) tijdens tracering en controleer of het overgetrokken neurieten verbonden. Onderzoek de vertakking punten en het beginpunt. Als de dendrieten niet zijn aangesloten, zal een nieuw begin punt worden gedefinieerd op de niet-aangesloten filament.
    7. Na het traceren, ga terug naar 'Instellingen' het vinkje "beginpunt" en "vertakkingspunt," en ga naar Menu: overtreffen / Export geselecteerde objecten ../. Sla de gloeidraad als uitvinder bestand (* .IV).
  2. Het toewijzen van referentiepunten
    1. Selecteer "Show Display Adjustment" en zet beide imaging kanalen. In dit voorbeeld, kanaal 1 is de fotoreceptor kleuring en kanaal 2 is de TM20 neuron (GFP).
    2. Ga naar het menu: overtreffen / Measurement. Selecteer het tabblad "Edit" en controleer of "specifiek kanaal:" (selecteer de fotoreceptor kanaal [red]).
    3. Wijs referentiepunten voor de toplaag. Ga naar het menu: / overtreffen / Measurement Poigen om nieuwe meetpunten te creëren. Markeren het begin van de M1 laag als een toplaag. De volgorde van de punten is als volgt: equatoriale, anterior-equatoriale, anterior, anterior-ventrale, ventrale, posterior-ventrale, posterior, posterior-equatoriale, en het centrum (figuur 3F); definieert het midden fotoreceptor als die geassocieerd met de dendritische uitlopers.
    4. Wijs de R8 en R7 lagen als in stap 4.2.3 (figuur 3G). Drie individuele meetpunten moeten worden gemaakt in stappen 4.2.3 en 4.2.4.
    5. Uitvoer van de coördinaten van de punten voor elke laag. Klik op het tabblad "Statistieken", selecteer "Gedetailleerde," "specifieke waarden", en "Position;" en klik op "Export Statistieken op het tabblad Weergave naar bestand." Opslaan als 'Comma separated values ​​"(* .csv).
    6. Open de drie csv-bestanden (van stap 4.2.3 - 4.2.4) en combineer de coördinaten van de 27 referentiepunten in een nieuw csv-bestand met kopiëren en plakken (the orde is Top, R8 en R7). Bekijk de Materials / Apparatuur Tafel en volgt de indeling van het voorbeeld bestand.

5. Rigid-body en TPS-lineaire registratie

OPMERKING: Deze stap is om de neuriet sporen (in iv-formaat) naar de kolom matrix verwijzing te registreren en een geregistreerde SWC-bestand te genereren met behulp van het MIPAV programma. Dit gedeelte vereist de volgende bestanden: de gerecombineerde afbeeldingsstapel (.ids) uit stap 3.3, het referentiepunt (.csv) uit stap 4.2, en de neuriet trace filament file (.IV) uit stap 4.1.

  1. Ga naar het menu: Plugins / Algemeen / DrosophilaStandardColumnRegistration. Het venster "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" zal verschijnen.
  2. Laad de beeldbestanden (.ids), de referentiepunten (.csv), en de gloeidraad bestand (.IV).
  3. Selecteer 9 punten per laag.
  4. Selecteer de positie van de afgebeelde neuron (LV / RD of RV / LD).
  5. Selecteer "Rigid Registratiop en TPS "en" Rigid Registration "naar lineaire en rigide lichaam registratie resp.
  6. Vink "Create SWC-bestand" om de volgende output bestanden te genereren: een geregistreerd neuriet trace bestand in SWC formaat (zie specifieke materialen / Apparatuur voor de definitie), een geregistreerd IV-bestand (.IV), coördinaten van de gestandaardiseerde neuriet (.txt), getransformeerde coördinaten (.txt), en de gecombineerde afbeelding (.ids).
  7. Verander de naam van het SWC-bestand. Breng de afkorting van de locatie aan het einde van de bestandsnaam (stap 1,7). Gebruik bijvoorbeeld "Tm20_3_RV.swc" voor TM20 neuron # 3 ligt aan de ventrale helft van het recht merg.

6. Standaardisatie naar rechts-ventrale Configuration

OPMERKING: Deze stap is om de neuriet sporen te zetten (in het SWC-formaat) met standaard RV (rechts-ventrale) configuratie met behulp van de aangepaste script "RV_standardization.m." Hier werd het script in de matrix laboratorium taal geschreven. Denamen van de input SWC-bestanden moeten worden in het volgende formaat: "NeuronName _ _ Aantal Configuration SWC" (bv Tm20_3_LV.swc).

  1. Open de "RV_standardization.m" script.
  2. Bewerk de volgende parameters in de sectie "Gebruikersinput":
    1. Typ de namen van de neuronen zonder nummering (bijv Tm2, TM20, etc.) in "neuron_names."
      LET OP: De standaard in "file_end_in" is "_ * swc,.", Die zoekt naar bestanden met namen bevatten ( "*" is een wildcard die passen bij een willekeurig aantal tekens) "_ * SWC.". De standaard van "swc_file_end_out" is "_f.swc", die "_F" zal toevoegen aan het einde van de bestandsnaam na standaardisatie.
    2. Geef de map waar de SWC-bestanden zijn in "directory_in". Geef de map waar de gestandaardiseerde bestanden zal gaan in "directory_swcout".
  3. Voer het script.
  4. Optioneel: Gebruik Vaa3D 14 naar het SWC-bestanden te visualiseren en valideren van de conversie.

7. Bereken Dendritische vertakking en Terminating Frequenties

Opmerking: deze stap gebruikt starre lichaam geregistreerd swc bestanden naar de Kaplan-Meier schatters voor de waarschijnlijkheid dat een dendritische segment een bepaalde lengte bereikt zonder beëindiging berekenen. Dit script maakt gebruik van twee Dendritic_Tree_Toolbox functies: extractDendriticSegmentLengthDistribution en estimateDendriticSegmentLengthProbability.

  1. Open de "Branch_term_P.m" script.
  2. Bewerk de volgende parameters in de sectie "Gebruikersinput":
    1. Geef het pad naar het stijve lichaam geregistreerd SWC-bestanden in "pathToSWCFiles" (bv, / Rigid_Registered_swc /). Geef het pad dat de grafische output in zal houden "pathToOutput." Geef de naam van de neuronen of neurale typen in "neuron_names" (bv Tm2, Tm20, etc.).
  3. Voer het script; de uitgangen zijn de Kaplan-Meier schatting curve voor dendritische vertakking en beëindiging.
    LET OP: Optioneel: Breng de functie passend methode om uit de Kaplan-Meier schatters de lokale kans dat de dendritische segment zal vertakken of te beëindigen.

8. Plot van de Distributie van Layer-specifieke Beëindiging van Dendritische Arbors

LET OP: Deze stap plot de verdeling van de dendritische terminals in verschillende lagen merg als een staafdiagram. Dit kan worden aangebracht op een neuron, een groep van neuronen of groepen neuronen. Het script maakt gebruik van de extractDistributionAlongAxis functie van Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. Open de "Layer_term.m" script.
  2. Bewerk de volgende parameters in de sectie "Gebruikersinput":
    1. Geef de map die niet-lineaire geregistreerd SWC-bestanden in "pathToSWCFiles" bevat (bijvoorbeeld / Non_linear_Registered_swc /). Geef de directory voor grafische output in "pathToOutput." Geef de naam van de neuronen of neurale typen in "neuron_names" (bv Tm2, TM20, etc.).
  3. Ren de tutorial script. De output is een histogram van het aantal eindknopen specifieke medulla lagen.

9. Plot de Planar Projectie Richting van Dendrieten

LET OP: Deze stap plots de vlakke projectie richtingen van dendrieten als een polaire plot. Het script maakt gebruik van de extractAngularDistribution functie van Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. Open het script "Planar_proj.m."
  2. Bewerk de volgende parameters in de sectie "Gebruikersinput".
    1. Geef de map die de niet-lineaire in "pathToSWCFiles" (bv, / Non_linear_Registered_swc /) bevat geregistreerd SWC-bestanden. Geef de map voor grafische output in "pathToOutput." Geef de naam van dede neuronen of neurale soorten van "neuron_names" (bijvoorbeeld, Tm2, TM20, etc.).
  3. Voer het script; de uitgang een polaire grafiek van vlakke projectierichtingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de dual-view beeldvorming procedure die hier gepresenteerd, een vlieg hersenen met dun gelabeld TM20 neuronen werd in beeld gebracht in twee orthogonale richtingen. Voorafgaand aan de beeldvorming, werd de hersenen gekleurd met de juiste primaire en secundaire antilichamen voor het visualiseren van membraan-tethered GFP en fotoreceptor axonen. Voor beeldvorming werd de hersenen eerst aangebracht in de horizontale stand (figuur 2A, B). Een GFP-gelabeld neur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier laten we zien hoe beeld en analyseren van dendritische priëlen van Drosophila merg neuronen. Het eerste deel, dual-view beeldvorming, beschrijft de deconvolutie en de combinatie van twee beeld stacks in een afbeelding stapel hoge resolutie. Het tweede deel, dendrite tracing en registratie, beschrijft de opsporing en registratie van de dendrieten van merg neuronen aan de kolomverwijzing array. Het derde deel, dendritische analyse, beschrijft het gebruik van aangepaste scripts dendritische patronen te analys...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (subsidie ​​HD008913 aan C.-HL) en het Centrum voor Informatie Technologie (PGM, NP, ESM en MM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software
Huygens ProfessionalScientific Volume Imagingversie 16.05voor beelddeconvolutie (https://svi.nl).  commerciële software
MIPAVversie 7.3.0voor beeldambinatie en registratie (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV-plug-in: PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		freeware
MIPAV-plug-in: PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		freeware
ImarisBitplanevoor het traceren van neuriten en het toewijzen van referentiepunten voor beeldregistratie (http://www.bitplane.com); commerciële software
Vaa3Dvoor het visualiseren van swc-bestanden (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
MatlabMathworksR2014bvoor morfometrische analyse van dendrieten (http://www.mathworks.com); commerciële software
Matlab-toolbox: TREES1.14v1.14voor het analyseren van dendritische morfometrische parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab-toolbox: Dendritic_Tree_Toolboxv1.0Voor het berekenen van morfometrische parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voorbeeldbstanden
SWC-bestandsdefinitiehttp://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
De codes en voorbeeldbestanden voor beeldambinatie en registratiehttps://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Voorbeeld van een referentiepunt https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Computersysteem
MS Windows Windows 7 x64 of Macintosh OS X 10.7 of hoger3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimaal)
Optioneel: Quadro4000  (of hoger) grafische kaartNvidiavoor stereografische visualisatie van dendrieten.
Optioneel: NVIDIA 3D vision2Nvidiahttp://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optioneel: 120 Hz LCD-scherm voor NVIDIA 3D vision2http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia voor beeldvorming
24B10-antilichaamThe Developmental Studies Hybridoma Bank24B10
GFP Tag AntilichaamThermofisher ScientificG10362
Geit anti-Konijn (H+L), Alexa Fluor 488Thermofisher ScientificA11034
Geit anti-Muis (H+L), Alexa Fluor 568Thermofisher ScientificA21124
VECTASHIELD Antifade Montage MediumVector LaboratoriesH-1000
Montage Klei FisherS04179
70% glycerol in 1x PBS
Dekglas, hoge prestaties, D = 0,17 mmZeiss474030-9000-000

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743(2010).
  4. Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
  5. Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
  6. Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).
  7. Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
  8. Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
  9. Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
  10. Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
  11. Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
  12. Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
  13. Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
  14. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
  15. Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
  16. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
  19. Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
  20. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  21. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  22. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
  23. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dendritische morfologieanalyseconfocale beeldstacksdual view imagingregistratie van dendriettracinglaagspecifieke terminatieplanaire projectierichtingdendritische vertakkingsfrequentiesMIPAV platformMATLAB toolboxesneuronen in de medulla van Drosophila

Gerelateerde artikelen