Methodenartikel

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

DOI:

10.3791/55412

⸱

30 maart 2017

 ,  ,  ,  , 
1The State Key Laboratory for Artificial Microstructures and Mesoscopic Physics, School of Physics, Peking University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences at Center for Quantitative Biology, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Knopgist Saccharomyces cerevisiae is een belangrijk modelorganisme in verouderingsonderzoek. Genetische studies hebben veel genen onthuld met geconserveerde effecten op de levensduur tussen verschillende soorten. Echter, de moleculaire oorzaken van veroudering en dood blijven ongrijpbaar. Om een systematisch begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gistveroudering te verkrijgen, hebben we methoden met hoge doorvoer nodig om de levensduur te meten en om verschillende cellulaire en moleculaire fenomenen in enkele cellen te kwantificeren. Eerder ontwikkelden we microfluïdische apparaten om moedercellen van knopgist gedurende hun hele levensduur te volgen terwijl nieuwgeboren dochtercellen weggespoeld worden. Dit artikel presenteert een methode voor het voorbereiden van microfluïdische chips en voor het opzetten van microfluïdische experimenten. Meerdere kanalen kunnen worden gebruikt om cellen tegelijkertijd onder verschillende omstandigheden of van verschillende giststammen te volgen. Een typische opstelling kan honderden cellen per kanaal volgen en hoge resolutie microscoopbeelden mogelijk maken gedurende de levensduur van de cellen. Onze methode maakt ook een gedetailleerde karakterisering mogelijk van de levensduur, moleculaire markers, celmorfologie en de celcyclusdynamiek van enkele cellen. Daarnaast is ons microfluïdische apparaat in staat om een aanzienlijke hoeveelheid verse moedercellen vast te leggen die kunnen worden geïdentificeerd door downstream beeldanalyse, waardoor het mogelijk wordt de levensduur met hogere nauwkeurigheid te meten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gist is een krachtige modelorganisme bij veroudering onderzoek. Echter, een gebruikelijke levensduur assay gist voert microdissectie, die niet alleen arbeidsintensief maar ook lage doorzet 1, 2. Bovendien is de traditionele microdissectie aanpak voorziet niet in een gedetailleerde weergave van verschillende cellulaire en moleculaire kenmerken van de alleenstaande moeder cellen als ze ouder worden. De ontwikkeling van microfluïdische apparaten is een geautomatiseerd systeem voor gist levensduur te meten en om moleculaire merkers en verscheidene cellulaire fenotypes volgen gedurende de levensduur van de moedercellen 3, 4, 5, 6, 7, 8 ingeschakeld. Na gistcellen in een microfluïdische inrichting zijn geladen, kunnen zij worden gevolgd onder een microscoop met automatische tijdsafhankelijkee beeldvorming. Met behulp van beeldvorming bewerkgereedschappen kunnen verschillende cellulaire en moleculaire fenotypes worden geëxtraheerd 3, 6, 8, zoals levensduur, formaat, fluorescente reporter, celmorfologie, cel cyclus dynamica, etc., waarvan vele zijn moeilijk of onmogelijk te verkrijgen met behulp de traditionele microdissectie methode. Microfluïdische apparaten hebben opgedaan bekendheid in gist veroudering onderzoek sinds hun succesvolle ontwikkeling van een paar jaar geleden 3, 4, 6, 7. Verschillende groepen zijn vervolgens gepubliceerd op variaties van de eerdere ontwerpen 5, en veel gist labs hebben microfluïdische apparaten gebruikt voor hun studie.

In een celcultuur exponentiële groei ondergaan, het aantal bejaarde moeder cellen die voor observatie beschikbaar zijn, is miniscule. Daarom is het algemene ontwerpprincipe van de microfluïdische inrichting voor levensduur metingen te moedercellen behouden en dochtercellen te verwijderen. Een dergelijk ontwerp maakt gebruik van het feit dat gist ondergaat asymmetrische celdeling. De structuren in de inrichting wil houden groter moedercellen en laten kleinere dochtercellen weg te wassen. De microfluïdische chip in dit artikel wordt een zachte polydimethylsiloxaan (PDMS) pad (verticaal hangend kolommen) te controleren moedercellen (figuur 1). Inrichtingen van vergelijkbaar type zijn eerder 3, 4, 6, 7 gemeld. Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudiger procedure microfluïdische inrichtingen en een eenvoudige cel-laadmethode die is geoptimaliseerd voor de time-lapse imaging experimenten fabriceren. Een van de belangrijkste parameters in de microfluïdische inrichting is de breedte van de PDMS kussens gebruikt te controleren moedercellen. onze device gebruikt breder pads die meer moeder cellen onder elke pad kan houden, met inbegrip van een aanzienlijk deel van de verse moeder cellen die gedurende hun levensduur kunnen gevolgd worden. Naast levensduur metingen Dit protocol is bruikbaar voor enkele cel time-lapse imaging experimenten wanneer de cellen moeten worden bijgehouden voor vele generaties of bij een waarneming gedurende de gehele levensduur noodzakelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Silicon Wafer Mold Fabrication

LET OP: Het fotomasker is ontworpen met AutoCAD-software en vervaardigd door een commerciële onderneming. Dit ontwerp bevat drie lagen van verschillende patronen ( aanvullend bestand 1 ). De hoogten van de eerste, tweede en derde lagen zijn ongeveer 4 urn, 10 urn en 50 urn respectievelijk. De siliciumwafel matrijs is samengesteld uit het fotomasker met behulp van zachte lithografie 9, 10.

  1. Bak een siliciumwafel bij 200 ° C gedurende 10 minuten om de waterdamp verdampt. Spin-coat negatieve fotolak SU-8 op de siliciumwafel.
    OPMERKING: Spin coat SU-8 3005 bij 5000 rpm gedurende 30 s op de eerste laag te genereren, SU-8 2010 bij 3000 rpm gedurende 30 s op de tweede laag genereren en SU-8 3025 bij 2000 rpm gedurende 30 s op het genereren derde laag.
  2. Soft-bak de beklede wafel vóór thij patroon overdracht. Uitlijnen en bloot de wafer "direct contact" modus met een masker aligner.
    OPMERKING: Zachte bakken de wafer gedurende 2 minuten bij 95 ° C voor de eerste laag, 3 min bij 95 ° C voor de tweede laag, en 15 min bij 95 ° C voor de derde laag. Met de belichtingsdosis van 100 mJ / cm2 gedurende de eerste laag 130 mJ / cm 2 voor de tweede laag, en 200 mJ / cm2 voor de derde laag.
  3. Na blootstelling, post-bak de wafer en te ontwikkelen met behulp van SU-8 ontwikkelaar. Drogen van de wafel via een N2 pistool en hard bakken de wafel op 200 ° C gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: De siliciumwafel mal is bevestigd aan een 15 cm diameter plastic Petri schaal met plakband, de patroon naar boven. Meestal zetten we verschillende identieke chipstructuren op dezelfde mal, waardoor meerdere microfluïdische chips te vervaardigen tegelijk. Elke vorm kan worden hergebruikt vele malen microfluïdumchips fabriceren.

2. Microfluidischechip Fabrication

  1. Plaats een schone wegen boot op een evenwicht scheurde de balans. Giet 50 g van PDMS base in de wegen boot.
  2. Voeg 5 g PDMS hardingsmiddel aan de gewichtboot (w / w-verhouding van 1:10 tot het PDMS base).
    Opmerking: Dit deel is gebaseerd op een 15 cm diameter Petrischaal met de mal. Pas de hoeveelheid reagens bij gebruik van een petrischaal van een ander formaat.
  3. Roer de PDMS base en het hardingsmiddel met een wegwerpbare pipet. Start vanaf de rand van het gewicht van de boot en langzaam naar binnen te verplaatsen. Roer grondig gedurende enkele minuten tot kleine belletjes gehele mengsel; doormenging is essentieel voor PDMS polymerisatie.
  4. Giet het mengsel langzaam in de petrischaal; het mengsel moet volledig bedekken de siliciumwafel matrijs.
  5. Plaats de petrischaal in een vacuüm gedurende 10 minuten om alle luchtbellen uit het mengsel te verwijderen PDMS. Indien bellen op het oppervlak van het mengsel blijven Gebruik een pipet om ze te blazen.
  6. Incubeer het siliciumwafer mal met PDMS in een oven bij 75 ° C gedurende ongeveer 2 uur.
  7. Haal voorzichtig de laag gepolymeriseerd PDMS van de siliciumwafel matrijs, om beschadiging aan de constructie van de wafel matrijs. Alternatief snijd de PDMS rechtstreeks van de siliciumwafel matrijs minimaal 5 mm marge rond het patroon met een enkele industriële edge scheermes; zachtjes schil de PDMS-laag van de wafel matrijs.
  8. Plaats de PDMS-laag op de bank met het patroon naar boven. Knip de individuele chip met één zijde industriële scheermesje vasthouden van een adequate marge van de rand van elke afzonderlijke chip constructie te voorkomen.
  9. Met het patroon naar boven, gebruikt een stempel pen (0,75 mm ID) perforeert recht door de inlaat en uitlaat cirkels aan elke zijde van de kanalen.
    LET OP: Deze gaten maken het pad voor de stroom van medium. Daarom is het van cruciaal belang om te gaan door de cirkels en punch helemaal door het PDMS laag. Zorg ervoor datVerwijder de PDMS kolommen uit het gat.
  10. Controleer elke gaatje door het invoegen van de punch pen naald weer in het gat. Zorg ervoor dat de naald kan komen van de andere kant, wat aangeeft dat er geen blokkade. Toepassing tape op het patroonoppervlak vervolgens voorzichtig afpellen de band stofdeeltjes reinigen. Herhaal deze stap ten minste drie keer. Laat een schone stukje plakband op de PDMS aan sterilisatie te handhaven.
  11. Herhaal deze procedure aan de andere zijde van de PDMS en laat het laatste stukje tape op ook.
  12. Bereid een 24 mm x 30 mm dekglas met een dikte van 0,13-0,17 mm. Spray 70% ethanol op het glas en droog met stofverwijderaar het oppervlak te steriliseren; daarnaast kan het glas worden gewassen met geautoclaveerd water en gedroogd met stofverwijderaar.
  13. Breng de dekglaasje en PDMS een kunststofplaat. Verwijder het plakband van de PDMS en plaats het patroon naar boven. Vermijd elk contact met het patroon oppervlak tijdens de overdracht.
  14. Plaats de kunststof plaat in het plasma machine. Toepassen zuurstofplasmabehandeling de PDMS en het dekglas op de oppervlakken hydrofiele de volgende bedrijfsparameters render: belichting, 75 s; gas stabilisatie, 20 cc / min; druk 200; en macht, 100 W.
  15. Plaats het PDMS op het afdekglas, verbinden zowel hydrofiele vlakken (de vlakken die zich geconfronteerd tijdens de plasmabehandeling). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de PDMS en het deksel glas.
  16. Incubeer de PDMS chip in een oven bij 75 ° C gedurende ten minste 2 uur.
    OPMERKING: deficiënte microfluïdische kan vloeistoflekkage veroorzaken op de microscoop tijdens het experiment. Daarom is het belangrijk om de hechting tussen de PDMS en dekglas controleren door iets optillen van de PDMS van de randen met een pincet. Voorzichtig op te tillen het PDMS moet het niet afgescheiden van het dekglas, wat wijst op een geslaagde verbinding.

3. Voorbereiding op de Experiment

  1. Tube voorbereiding.
    1. Dompel de input en output buizen in 70% ethanoloplossing afzonderlijk 1 dag vóór PDMS chip voorbereiding.
    2. Vul een 5 ml spuit met geautoclaveerd water om de buizen te wassen. Wassen elke buis door het aansluiten van de buis van de spuit en het spoelen van de buis met water.
    3. Herhaal de wasstap minstens 3 keer met ethanol residu reinigen.
  2. Onderzoek de PDMS kanalen onder een optische microscoop met een 10x objectief te zorgen dat de consistent is en intact. Stabiliseren van de PDMS chip op de microscoop platform via plakband.
    OPMERKING: Maak meerdere chips op een bepaald moment in stap 2 om ervoor te zorgen dat er een back-up chips, vooral als het maken van het apparaat voor de eerste keer.
  3. Vul een 5 ml spuit met geautoclaveerd water. Bevestig de spuit om een ​​injectiepomp en steek de bijbehorende input en output buizen. Stel de wassnelheid 750 ul / uur om de chip te spoelen gedurende 10 minuten. De luchtbellen aan de aftakkingskanalenmoet tijdens deze periode worden weggewassen; blijven er dan nog bellen, handmatig de snelheid aan te passen om de bubbels te elimineren.
  4. Gist monster voorbereiding.
    1. Breng 1 ml gist bereide monster (OD600 0,6-0,8) in twee 1,5 ml microcentrifugebuizen en centrifugeer 5 min bij 3000 x g.
    2. Verwijder het merendeel van de supernatant van elke buis en voeg de rest een 0,5 mL monster te vormen.
  5. Pauzeren injectiespuitpomp en verwijder de invoerbuizen van de PDMS chip.
  6. Handmatig achteruit de injectiespuitpomp met een kleine luchtbel zuigen (1-2 cm lang) in elke invoerbuis. Ga verder te zuigen in de gist monster; de luchtbel zal de sample grens te laten zien en aan te geven hoeveel monster is getrokken.
    OPMERKING: Vermijd het opzuigen van het monster in de spuit.
  7. Plaats de invoerbuis terug in de PDMS chip en de pomp te herstarten om de cellen bij een snelheid van 750 ul / h geladen.
  8. Laat de spuitpomp gedurende 10 minuten den en onderzoekt de celbelasting progressie onder de microscoop; een succesvolle laden zal val cellen onder meer dan 60% van de op te schorten pijler.
  9. Overschakelen naar voedingsoplossing en de snelheid tot 400 ul / h voor celkweek passen.
  10. Selecteer observatie posities voor de microscoop.
    OPMERKING: Bij levensduur metingen beelden werden eens 15 min door een optische microscoop met een 40x objectief. Voor de fluorescente reporter analyse werden beelden eens 15 min door een fluorescentiemicroscoop met een 60x olie doelstelling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de experimenten, kan de levensduur van de cellen en vele moleculaire en cellulaire fenotypes worden geëxtraheerd uit de opgenomen time-lapse beelden. Aangezien er een aantal verschillende functies die kunnen worden gewonnen uit elke cel, de eerste stap van de analyse is om de cellen en gebeurtenissen, zoals de positie en de grenzen van de cellen en het tijdstip van verschillende gebeurtenissen die worden bijgehouden aantekeningen, zoals als het ontluiken events. Deze annotaties zal he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De PDMS apparaat moet vers worden gemaakt. Anders zullen de luchtbellen veroorzaakt door het inbrengen van buizen in de inrichting moeilijk te verwijderen. Stap 3.4 is belangrijk voor de celbelasting efficiëntie door het concentreren van de cellen. Om het debiet van het experiment te verhogen, 4-6 modules op dezelfde PDMS chip verbonden met autonoom werkende pompen worden gewoonlijk gebruikt voor het uitvoeren 4-6 verschillende experimenten (verschillende stammen of mediacomposities) tegelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door NIH Grant AG043080 en de National Natural Science Foundation of China (NSFC), Nr. 11434001. We danken Lucas Waldburger voor het corrigeren van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3'' <111> silicon waferAddison Engineering
SU-8 2000 and 3000 SeriesMicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kitellsworth2065622Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
PetrischalenVWR391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0,75 mm)Sigma-Aldrich29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® dekglasThermo Fisher Scientific102440
3M Scotch TapeULINES-10223
VWR® scheermessenVWR55411-050
Pure Ethanol, KoptecVWR64-17-5
Whoosh-Duster™VWR16650-027
5 mL BD Spuit (Luer-Lock™ Tip)Becton, Dickinson and Company309646
PTFE Standaardwandbuis (100 ft, AWG Grootte: 22, Nominale ID: 0,028)Component Supply CompanySWTT-22
Naald AssortimentComponent Supply CompanyNEKIT-1
DessiccatorHACH2238300
Lab OvenFisher Scientific13246516GAQ
Nikon TE2000 microscoop met 40X en 60X objectiefNikon
Zeiss Axio Observer Z1 met 40X en 60X objectiefZeiss
SpuitpompLongerpumpTS-1B

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  2. Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
  3. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
  4. Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
  5. Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
  6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  7. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143(2013).
  8. Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
  9. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
  10. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  12. Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
  13. Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
  14. Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microfluidic DeviceYeast LifespanCell LoadingMicroscope ImagingPDMS ChipFlow RateYeast SampleImage Analysis

Gerelateerde artikelen