Methodenartikel

Met behulp van Enzyme-gebaseerde biosensoren te meten Tonic en Fasische glutamaat in de ziekte van Alzheimer muismodellen

DOI:

10.3791/55418

⸱

3 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de setup, softwarenavigatie en gegevensanalyse voor een ruimte en tijd nauwkeurige werkwijze voor het meten tonische en fasische extracellulair glutamaat veranderingen in vivo middels enzymgekoppelde micro-elektrode arrays (MEA).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurotransmitter verstoring is vaak een belangrijk onderdeel van ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS), die een rol spelen bij de pathologie ten grondslag liggen aan de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, depressie en angst. Traditioneel is microdialyse de meest voorkomende (geprezen) techniek om neurotransmitter veranderingen die optreden in deze aandoeningen te onderzoeken geweest. Maar omdat microdialyse heeft de mogelijkheid om langzame 1-20 minuten wijzigingen in grote weefselgebieden meten, heeft het nadeel invasieve potentieel vernietigen intrinsieke verbindingen binnen de hersenen en een langzame sampling vermogen. Een relatief nieuwere techniek, de micro-elektrode array (MEA), heeft talrijke voordelen voor het meten van specifieke neurotransmitter veranderingen in discrete hersengebieden die zich voordoen, waardoor een ruimte en tijd nauwkeurige benadering. Voorts worden volgens MEA is minimaal invasief, waardoor het meten van veranderingen in vivo neurotransmitter. In ons laboratorium, we have specifiek geïnteresseerd in veranderingen in de neurotransmitter glutamaat, gerelateerd aan de ziekte van Alzheimer-pathologie geweest. Als zodanig heeft de hier beschreven werkwijze werd gebruikt om potentiële storingen in hippocampale glutamaat evalueren in een transgeen muismodel van de ziekte van Alzheimer. In het kort, de gebruikte methode omvat het bekleden van een multi-site micro-elektrode met een enzym zeer selectief voor de neurotransmitter van belang en het gebruik van zichzelf verwijzende sites om af te trekken uit achtergrondgeluiden en storende stoffen. Na plateren en kalibratie, kan de MEA worden geconstrueerd met een micropipet en neergelaten in het hersengebied van interesse met behulp van een stereotaxische inrichting. Hier beschreven werkwijze het verdoven RTG (TauP301L) 4510 muizen en gebruiken van een stereotaxische inrichting nauwkeurig richten deelgebieden (DG, CA1 en CA3) van de hippocampus.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meten neurotransmitter veranderingen in de hersenen is een belangrijk instrument voor het bestuderen neurologen ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) die vaak wordt gekenmerkt door ontregeling neurotransmitter. Hoewel microdialyse in combinatie met hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC / EG) de meest gebruikte methode om veranderingen in extracellulaire neurotransmitter niveaus 1, 2, meten is 3, 4, de ruimtelijke en temporele resolutie van microdialyse probes niet ideaal voor neurotransmitters zoals glutamaat, die nauw worden geregeld in de extracellulaire ruimte 5, 6. Als gevolg van de recente ontwikkelingen in de genetica en imaging, zijn er extra methoden die kunnen worden gebruikt om glutamaat in kaart in vivo. Met behulp van genetisch gecodeerde glutamaat fluorescente reporters (iGluSnFR) eend twee-foton beeldvorming, kunnen onderzoekers glutamaatafgifte visualiseren neuronen en astrocyten zowel in vitro als in vivo 7, 8, 9. Met name maakt dit het opnemen van een groter gezichtsveld en niet de intrinsieke verbindingen van de hersenen verstoren. Terwijl deze nieuwe optische technieken maken visualisatie van glutamaat kinetiek en meting van sensorische reacties van de consument en neuronale activiteit, missen ze het vermogen om de hoeveelheid glutamaat in de extracellulaire ruimte in discrete hersengebieden kwantificeren.

Een alternatieve methode is het enzym-gebonden micro-elektrode array (MEA) die selectief kan meten extracellulaire neurotransmitter niveaus, zoals glutamaat, door middel van een zelf-verwezen opname systeem. De MEA techniek is gebruikt om veranderingen in de extracellulaire glutamaat na een traumatisch hersenletsel te bestuderenletsel 10, 11, 12, verouderen 13, 14, stress 15, 16, epilepsie 17, 18, de ziekte van Alzheimer 19, 20, en de injectie van een viraal nabootser 21 en vertegenwoordigt een verbetering van de ruimtelijke en temporele beperkingen die inherent zijn microdialyse. Dat microdialyse het vermogen te meten bij de synaps 22, 23 beperkt, MEA een hoge ruimtelijke resolutie waarmee selectieve maatregelen van extracellulair glutamaat spill buurt synapsen 24, 25. Ten tweede, de lage tijdsresolutie van microdialyse (1-20 min) beperkt de mogelijkheid om de onderzoekensnelle dynamiek van de afgifte van glutamaat en vrije ruimte die zich in de milliseconde naar de tweede reeks 26. Vanwege verschillen in de afgifte van glutamaat of klaring niet zichtbaar kunnen zijn maatregelen tonic, rusten glutamaat, kan het noodzakelijk zijn dat glutamaatafgifte en klaring direct worden gemeten. MEA toelaten dat dergelijke maatregelen vanwege hun hoge tijdsresolutie (2 Hz) en lage detectielimiet (<1 uM). Ten derde, MMO zorgen voor onderzoek van subregionale variaties in neurotransmitters binnen een bepaald hersengebied, zoals de rat of muis hippocampus. Bijvoorbeeld met behulp MEA kunnen we afzonderlijk richten de dentate gyrus (DG), cornu ammonis 3 (CA3) en cornu ammonis 1 (CA1) van de hippocampus, die via een trisynaptic schakeling 27 verbonden, subregionale verschillen in extracellulair glutamaat te onderzoeken. Vanwege de omvang van microdialyse probes (1-4 mm lang) en de schade veroorzaakt door implantatie 28 </ sup>, 29, subregionale verschillen zijn moeilijk aan te pakken. Bovendien is de optische systemen staan alleen stimulatie door middel van externe stimuli, zoals een whisker stimulatie of lichte trilling, die subregionale stimulatie 7 niet toelaat. Een laatste voordeel van MEA's ten opzichte van andere methoden is de mogelijkheid om deze subregio's in vivo te bestuderen zonder verstoring van hun extrinsieke en intrinsieke verbindingen.

Hier beschrijven we hoe een registratiesysteem (bijvoorbeeld FAST16mkIII) bij MEA, bestaande uit een keramiek gebaseerde multisite microelektrode, differentieel kunnen worden aangebracht op de opname plaatsen om voor storende stoffen te detecteren en uit het analytsignaal. We tonen ook aan deze arrays kunnen worden gebruikt voor amperometrie op basis van studies van in vivo glutamaat voorschrift in de DG, CA3 en CA1 hippocampus deelgebieden van verdoofde RTG (TauP301L) 4510 muizen, een veelgebruikte mOuse model van de ziekte van Alzheimer. Daarnaast bieden wij een bevestiging van de gevoeligheid van het MEA systeem om de snelle dynamiek van glutamaatafgifte en goedkeuring door behandeling van de muizen met riluzol een in vitro geneesmiddel glutamaatafgifte verminderen en glutamaat opname 30, 31, 32, 33, en demonstreren van deze respectieve veranderingen in vivo in de TauP301L muismodel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het bekleden van de micro-elektrode Array met enzymen of Matrix Layer

  1. Bereiding van de proteïne matrixoplossing
    1. Weeg 10 mg runderserumalbumine (BSA) en plaats het 1,5 ml microcentrifugebuis.
    2. Voeg 985 ul van DI water aan de microcentrifugebuis met BSA. Meng de oplossing door handmatig roeren (opnieuw pipetteren met behulp 1,000 ul pipet tot 3 maal, totdat het BSA opgelost).
      OPMERKING: Gebruik geen vortex om de oplossing te mengen Hierdoor kunnen de lucht in de oplossing. Zet tevens de pipet tot een volume <1,000 pi (bijvoorbeeld pi 700) om te voorkomen dat er luchtbellen. De oplossing kan in een microcentrifuge geplaatst indien nodig.
    3. Zodra de BSA-oplossing opgelost, voeg 5 ul van 25% glutaaraldehyde oplossing. Meng de oplossing door het omkeren van de gesloten buis 3-5 keer. De resulterende oplossing 1% BSA met 0,125% glutaaraldehyde.
    4. Vernietiging van het eiwit matrix oplostie gedurende 5 minuten. De oplossing zal lichtgeel van kleur verschijnen.
  2. Het bereiden van de gewenste enzymoplossing (bijvoorbeeld glutamaat oxidase)
    1. Bereid de glutamaat oxidase door toevoeging gefilterd DI water om het gevriesdroogde, gezuiverde enzym (bijvoorbeeld 50 pi DI water toegevoegd aan 25 eenheden glutamaat oxidase ter verkrijging van 0,5 E / ul).
      OPMERKING: Aliquot voorraadoplossing (bijvoorbeeld 1 pi) en de monsters in geschikte afmeting containers (bijvoorbeeld 500 pl microcentrifugebuizen) bewaren bij -20 ° C. Monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 6 maanden onder deze omstandigheden.
    2. Voeg 4 pi van de BSA / glutaaraldehyde oplossing voor de microcentrifugebuis porties verdeeld buis met glutamaat oxidase. Meng de oplossing door handmatig roeren (opnieuw pipetteren met een pipet 10 pi. De pipet moet worden ingesteld volume <5 pi). De resulterende oplossing 1% BSA, 0,125% glutaaraldehyde en 0,1 U / ul glutamaat oxidase.Met de oplossing onmiddellijk coaten.
      Opmerking: glutamaat oxidase bekledingsoplossing kan uitsluitend worden gebruikt binnen 15 minuten. Hoewel verschillende MEA worden bekleed met een bereide oplossing wordt aanbevolen de bruikbare tijdvenster voor glutamaat oxidase niet te overschrijden. Het aantal elektroden die binnen 15 minuten kan worden bekleed variëren. In het algemeen kunnen 4-6 elektroden bekleed tegelijk.
  3. Het bekleden van de MEA
    1. Typisch bekleden van een paar opnameplaats (s) op een MEA met het gewenste enzym (glutamaat oxidase) en een ander paar opnameplaats (s) ( 'sentinel' site (s)) wordt bekleed met het inactieve eiwit-matrix.
    2. Stompe-uiteinde Hamilton microspuitjes (bijvoorbeeld 10 pi) te bekleden MEA met L-glutamaat oxidase of inactief eiwit matrixoplossing (BSA + glutaaraldehyde). De voor enzym of inactief eiwit-matrix coatings zijn hetzelfde.
    3. Reinig de spuiten voor en na gebruik (3 spoelingen metDI water, 3 spoelingen met methanol, 5 spoelingen met DI-water).
      OPMERKING: Dedicated spuiten worden gebruikt voor het aanbrengen van lagen enzym (glutamaat oxidase) of eiwit-matrix. Gebruik de spuit niet gebruiken voor een andere oplossing. Het wordt aanbevolen om eiwit-matrix coatings voeren voordat enzym coatings.
    4. Opstellen glutamaat oxidase of proteïnematrix met een 10 pi Hamilton spuit. Druk de zuiger om een ​​kleine druppel oplossing af op de spuit (gevisualiseerd onder toepassing van een dissectiemicroscoop).
    5. Met de dissectiemicroscoop te concentreren op de MEA opname sites, de oplossing van toepassing op de juiste registratie plaatsen door kort contact brengen van de opname sites met de oplossing druppel / kraal, die een laag voorstelt. Drie lagen zijn voldoende om zowel eiwit-matrix en het enzym vacht. Dikke lagen kan de gevoeligheid van de MEA te verminderen.
    6. Breng de oplossing druppel recht omhoog en van de opnames sites (dat wil zeggen de syringe tip niet schrapen over het oppervlak MEA).
    7. Een timer instellen gedurende 1 minuut. Dit is de minimale benodigde tijd tussen bekledingstoepassingen de opnameplaats (s). Allow-enzym beklede MEA harden bij 4 ° C gedurende 5-7 dagen.
    8. Noteer het aantal lagen toegepast, hoe lang het duurde voor de verf, de elektrode nummer en een naam en datum toe te passen in een laboratorium notebook.

2. Galvaniseren met m-fenyleendiamine voor betere Selectiviteit

  1. Bereiden m-fenyleendiamine dihydrochloride (MPD) -oplossing
    OPMERKING: Plate uitsluiting laag MPD de oxidatie van dopamine en andere grote interfererende moleculen (bijvoorbeeld ascorbinezuur) te voorkomen, waardoor de selectiviteit van de sensor voor glutamaat / H2O 2 boven andere potentieel interfererende moleculen verbeteren.
    1. Breng 50 ml van 0,05 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een volumetrische kolf en 50 ml 0,05M PBS tot een grotere (150 ml) Erlenmeyer kolf.
    2. Via de buis aangesloten op een stikstoftank (bijvoorbeeld via de buis aangesloten druk ejecteur), voeg een pipetpunt (bijvoorbeeld P200 tip) aan het open einde van de buis. Plaats de buis met de bijgevoegde pipetpunt in PBS oplossing en dek de oplossing losjes met parafilm. Schakel stikstof en voorzichtig bellenoplossing gedurende 20 min.
    3. Weeg 0,045 g MPD.
      Let op: MPD is een potentieel kankerverwekkende stof. Wegen MPD worden uitgevoerd op een schaal binnen een zuurkast. Draag handschoenen en een masker bij het gebruik van MPD. Zorgen de kap en zorg ervoor dat het raam wordt getrokken om de juiste werkhoogte. Onmiddellijk reinigen oppervlakken die mogelijk zijn verontreinigd met MPD permanente kleuring te vermijden.
    4. Na borrelen, overdracht van al het MPD de ontgast PBS-oplossing. Dek de kolf opening met parafilm en voorzichtig swirl oplossing MPD in oplossing op te lossen. Vermijd aggressive mengen of het gebruik van een vortex Hierdoor kunnen de gassen introduceren in de oplossing.
    5. Breng de oplossing in een 50 ml beker. Een roerstaaf niet nodig.
  2. Electroplating de elektrode
    1. Verkrijgen van een referentie-elektrode. Met referentie-elektroden gewijd aan MPD alleen plating. Met een andere referentie-elektrode voor kalibratie procedures.
    2. Plaats de plastic arm van de referentie-elektrode houder boven het bekerglas. Controleer luchtbellen in het glas referentie-elektrode (mogelijk niet te zien). Zachtjes flick het distale uiteinde van de referentie-elektrode om eventuele luchtbellen aan het uiteinde te verwijderen.
    3. Plaats de referentie-elektrode door de opening in de kunststof arm en de onderste in de beker met PBS. Waarborgen dat de referentie-elektrode niet raakt de bodem van de beker.
    4. Sluit de referentie elektrode naar de headstage (bijvoorbeeld 2 pA / mV) en verbinding (bijv DIP connector) het MEA te mpd plaat zijnd de headstage.
    5. Laat de MEA in de beker oplossing zodat alleen de MEA tip ondergedompeld in oplossing. Dompel de MEA tips in vloeibare voorbij de zwarte 'bubble' (de zwarte isolatie boven de MEA tip bevindt). Hierdoor kan de MEA beschadigen.
    6. Voer een 'test' kalibratie om de functionaliteit van de elektrodekanalen en aansluiting op het headstage controleren.
      OPMERKING: Hoewel de hardware-instellingen van de apparatuur moet weerspiegelen wordt gebruikt, details met betrekking tot analyt / interfererende type en de concentratie niet hoeven te worden ingevoerd voor de 'test' kalibratie. Het hercoderen mode moet 'amperometrie' en 'V toegepast' moet -0,7 V. Controleer kenmerkend opname voor alle kanalen.
    7. Annuleren door op 'Annuleren' als de connectiviteit van alle opname-sites wordt geverifieerd. Het is niet nodig om de kalibratie gegevens op te slaan.
    8. Selecteer het pictogram "Electroplating" op het bureaublad. De Electroplating Tool Menu zal verschijnen. Controleer of de juiste instellingen zijn ingevoerd:
      PP amplitude: 0,25
      Offset: -0.5
      Frequentie: 0,05
      Duur (min): 20
    9. Selecteer de 'pauze' knop om plating beginnen. De verstreken tijd dient te beginnen met aftellen.
    10. Na voltooiing (alle tijd die is verstreken), selecteert u 'een ander MEA' in het popped up menu om te beginnen met MPD plating een extra MEA. Vervang de geplateerde MEA met een MEA te MPD bedekt en herhaal de elektrolytische bij gebruik van het elektrolytische tool.
      LET OP: Het is aanbevolen om de voorbereide MPD-oplossing niet meer dan 2 keer of binnen een 1 uur periode. Bereid een verse oplossing om meer dan 2 MEA te bereiden.
    11. Selecteer 'exit software' te galvaniseren voltooien. Spoel MPD-plated electrodepunten met DI-water (in een zout reststoffen) en opslag (24 uur) voorafgaand kalibreren.
    12. Verwijder de referentie-elektrode uit de oplossing en spoelen met gedeïoniseerd water alvorens in de juiste storage oplossing (bijvoorbeeld 3 M NaCl). Zorgen de referentie-elektrode is ondergedompeld in oplossing. Langzaam onderglas referentie-elektrode in de oplossing om beschadiging van het glas.
    13. Gooi de mpd oplossing in een geschikt gemerkte container gevaarlijk afval.

3. Kalibreer de MEA voor glutamaat detectie en selectiviteit (figuur 1) 21

  1. De voorbereiding van de oplossingen die nodig zijn voor de kalibratie.
    OPMERKING: zie tabel 1.
  2. Kalibratie uitvoeren onder constant roeren (magnetische roerder batterijen) bij 37 ° C. Zet de verwarming pad of circulerend waterbad en het verkrijgen van een kleine roerstaaf. Roer langzaam maar snel genoeg dat als een toevoeging wordt gedaan (zie hieronder), de nieuwe plateau is snel bereikt.
  3. Sluit de headstage (2 pA / mV) om de opname controlesysteem en plaats de MEA tip in 40 ml geroerde 0,05 M PBS (gebruik een 50 ml bekerglas).
  4. Sluit de raslagwerk elektrode. Flick het einde om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen.
  5. Open het opnameprogramma en klik op "Calibration". Zorg ervoor dat de instellingen juist zijn (controleer of sentinel sites worden geselecteerd als dit kan veranderen met verschillende elektroden), kiest MEA nummer en druk op "Start".
  6. Toestaan ​​5-10 min evenwichtstoestand; beginnen zodra de basislijn is gestabiliseerd (<0,004 nA / min verandering).
  7. Selecteer "Baseline" en voeg 500 ul van 20 mM ascorbinezuur (storende; finale [250 pm]) en selecteer "Interferentie" (AA wordt gezien als brain-breed interfererende) zodra de huidige een nieuwe, stabiele plateau heeft bereikt, indien ieder. Toestaan ​​0,5-1 minuut tussen toevoegingen. Als de MEA goed is gegalvaniseerd, moet bijna geen verandering worden waargenomen.
  8. Voeg 40 ul van 20 mM L-glutamaat (final [20 uM]) en zodra de stroom een nieuw stationaire plateau, mark 1 st naast "Analyt" bereikt. Herhaal dit drie keer voor een totaal van 3 glutamate toevoegingen.
  9. Voeg 40 ul DA. Do "Analyt" niet te selecteren; Selecteer "Test Substance" - DA mag alleen een storende stof in gebieden met DA zijn.
  10. Voeg 40 ul Peroxide. Do "Analyt" niet te selecteren; Selecteer "Test Stof".
  11. Klik op de "Stop" knop zodra de kalibratie is voltooid.
  12. Om de functionaliteit van de MEA te bepalen, klikt u op het tabblad berekening en de volgende parameters in een lab notebook op te nemen.
    1. Voor het ontwerp MEA (3000 pm2) die in deze kalibraties, gebruikt een MEA met een helling van ≥ 0,004 nA / gM maar lagere hellingen kan worden gebruikt voor bepaalde experimenten. Als er minder dan 10% verschil in helling tussen gecoat en ongecoat enzym plaatsen, gebruik dan deze MMO voor opgewekte introductie alleen of schone / gooi de MEA.
    2. Met een detectiegrens (LOD) ≤ 1,5 uM. Als de LOD groter is dan 1,5 urn, gebruik dan deze MMO voor opgeroepen release en slechts opname. Laat deze elektroden niet gebruiken voor het opnemen tonic niveaus.
    3. Gebruik een selectiviteit voor de gewenste analyt (bijvoorbeeld glutamaat) via storende stof van> 20 arbitraire eenheden. Als selectiviteit minder dan 20, dan schoonmaken / gooi het MEA.
    4. Gebruik een lineariteit (R2) van de ijkcurve ≥ 0.90. Als lineariteit kleiner dan 0,90, daarna behandelen of verwijderen MEA.
  13. Sla het bestand met de # van de MEA, de datum en de initialen van de persoon kalibreren.

4. Monteer het Micropipet

OPMERKING: Micropipetten (capillaire glas) zou een tip heeft met een inwendige diameter van 10-15 urn.

  1. Plaats de micropipet centraal over de vier platina opname plaatsen en monteren 50-100 urn boven de MEA behulp kleefwas en boetseerklei.
  2. De micropipet laden, gebruikt een 1 ml spuit met glutamaat of KCl-oplossing, een 0,22 urn steriele spuit filter, en een 97 mm lang, 28 gauge pipetvuller, backfill de micropipet. Dat wil zeggen de naald aan de bovenkant van de micropipet en vul onderaan de micropipet (het einde naar het MEA), zorg ervoor dat er geen luchtbellen.
  3. Bevestig de micropipet om de druk uitwerpsysteem bij 2-20 psi gedurende ongeveer 1 s.

5. Plaat de Miniature referentie-elektrode voor gebruik in vivo

  1. Bereid de bekledingsoplossing (50 g NaCl / 90 ml 1 M HCl in een 100 ml bekerglas (bekledingsbad)) en snijd het bad elektrode (~ 10 cm lengte van platina (Pt) draad (~ 0,02" diameter)).
  2. Snijd een 10-15 cm lang stuk teflon gecoate zilverdraad (0,008" onbelaste) en gebruik een scheermesje afschrapen ~ 1 cm Teflon coating van elk uiteinde van het einde van zilverdraad.
  3. Soldeer een gouden pen aan één uiteinde en plaats één uiteinde van belichte zilverhalogenide draad in het galvaniseerbad.
  4. Met behulp van een DC adapter (gebruiken alleen DC adapter met een vermogen van ~ 9 -. 15 opm),Klem de "red" (+) draad op de voorbereide zilverdraad (referentie-elektrode) op de gouden pin zijkant. Klem de "zwarte" (-) draad op Pt kathode bad.
  5. Sluit de DC-adapter. Kijk voor de juiste plating proces - bubbels moet op het bad elektrode verschijnen; referentie-elektrode maakt een zilver / grijze kleur.
    LET OP: de kabels niet te schakelen [Black (-) versus Rood (+)] - plating bad zal worden geruïneerd als dit gebeurt en vers plating oplossing zal moeten worden gemaakt. Een slechte oplossing wordt geel van kleur: GEBRUIK GEEN!
    Opmerking: Het plateren reactie vindt meestal 2-5 min: Ag 0 + Cl - → AgCl + e -
  6. Test de referentie-elektrode.
    1. Zet een multimeter aan de 100-200 mV DC-instelling.
    2. Plaats een referentie (dat wil zeggen een eerder geteste elektrode bekend te werken) referentie elektrode 3 M NaCl en toetsing aan de nieuw uitgeplaat referentie-elektrode.
      OPMERKING: Als onsing een nieuwe referentie-elektrode, weken in 3 M NaCl vóór gebruik (12 h aanbevolen).
    3. Leg het "red" (+) draad op de gouden pin van de referentie-elektrode te testen. Plaats de "zwarte" (-) lood op benchmark-elektrode. Een aanvaardbaar uitlezing is ± 10 mV. 0 mV is ideaal in de referentie-elektroden 2.

6. Algemene Animal Chirurgie voor MEA Recordings

  1. Voorbereiding op een operatie
    1. Plaats de operatie-instrumenten in ontsmettingsmiddel de avond tevoren.
    2. Verwijder de gereedschappen uit het desinfectiemiddel en goed naspoelen en plaats de tools op een steriele operatie pad. Zorg voor een verwarming pad.
    3. Kalibreer twee elektroden en bevestig de micropipet zoals beschreven procedures 3 en 4.
    4. Maak de referentie-elektrode, zoals beschreven in hoofdstuk 5.
    5. Maak 200 uM glutamaat en 70 mM KCl. Zie Tabel 1.
    6. Het verkrijgen van het dier en zijn gewicht op te nemen op een operatie vellen.
    7. Bereid de verdoving en zet de verwarming pad.
  2. Voer MEA chirurgie
    1. Middels isofluraan (4% stroming in zuurstof), verdoven van het dier in een inductie kamer tot de ademhalingsfrequentie aanzienlijk is afgenomen en het dier niet reageert op teen of staart knijpen. Opnemen ademfrequentie en lichaamstemperatuur elke 15 min.
    2. Plaats het dier in de stereotaxische apparaat met behulp van het oor bars om het hoofd te stabiliseren. Zorg ervoor dat het dier is veilig en het hoofd niet beweegt. Verlaag de isofluraan stroom naar 1,5-3% zuurstof. Zodat verwarming pad juist onder het dier is gepositioneerd en ingesteld op 37 ° C om extra warmte. Het niet om extra warmte kan resulteren in een diepe hypothermie en vroegtijdige dood van het dier.
    3. Toepassing oogzalf met een steriel katoenen applicator en noteer de ademhalingsfrequentie enlichaamstemperatuur. Met behulp van een batterij-aangedreven trimmer, scheren de bovenkant van het hoofd. Gebruik de kleine chirurgische schaar om de vacht te verwijderen in de buurt van de oren.
    4. Op dit punt, op de steriele operatie handschoenen. Breng jodium en dan alcohol (drie keer) op de hoofdhuid.
    5. Met behulp van een scalpel, een insnijding recht naar beneden het midden van de hoofdhuid en de verspreiding van de huid met behulp van stierenhond klemmen. Neem een ​​steriele katoenen tip om te genieten van geen bloed. Met waterstofperoxide om het uiterlijk van bregma en lambda vergemakkelijken.
    6. Controleer of het correct is geplaatst door het meten van de D / V en M / L coördinaten van bregma en lambda. Coördinaat wijzigingen moet nul zijn wanneer de kop op een plat vlak. Pas de kop en oor staven als nodig is om een ​​plat vlak te garanderen.
    7. Vind bregma, en nul de coördinaten. Met de gewenste coördinaten, naar links en rechts en een markering met behulp van een permanente marker. Met behulp van een cauterizer / marker, maak een groot plein rond de streep met genoeg ruimte om het te bereikengewenste gebied.
    8. Met een steriele draaigereedschap, boor rond de vierkante markering. Genieten geen bloed met een steriele katoenen applicator. Grondig ontsmet de boor voor elk gebruik.
    9. Bevestig de MEA de headstage en opvulling van de pipet met het eerste gewenste oplossing. Zeker laat een gat in de pipet onopgelost zodat de oplossing wordt verdreven kan worden onderzocht. Bevestig de slang aan op de glazen micropipet.
    10. Zet de stikstoftank en de druk ejecteur (psi = 5, time = 0,6 s). Test (druk handmatig rode knop) om de pipet te verzekeren niet verstopt is voordat u begint.
    11. Kalibreer de micropipet. Begin bij 0 op het dradenkruis en plaats een stuk van de blauwe tape op de headstage naar het beginpunt aan te geven. Schakel de digitale lezer en deze op nul terugzetten. Ga naar beneden 1 mm (DV) en tel het aantal tikken de oplossing is verplaatst op het dradenkruis. 10 teken moet gelijk 1 mm (1 mm = 250 nL), dus 1 tick = 25 nL.
    12. Plaats de referentie-elektrode in eenafgelegen locatie van de MEA zodanig dat het nog in vloeistofcontact met de hersenen om het circuit te sluiten.
    13. Zoek bregma met de MEA aangesloten en nul de digitale reader. Verplaats de MEA naar de gewenste coördinaten. Langzaam lager de MEA totdat de punt van de hersenen raakt. Nul de DV coördineren en langzaam de MEA in de hersenen.
    14. Op de opname programma, klikt u op de gewenste gekalibreerde elektrode en klik op "Perform Experiment." Het systeem zal dan beginnen met het opnemen tonic niveaus voor de analyt van belang, terwijl het dier is verdoofd.
    15. Zoom om een ​​as die zal helpen bij het observeren basislijn en laat de elektrode basislijn voor 20-45 min.
    16. Na de basislijn stabiel is, zet de druk ejector 0,6 s en 5 psi en de rode knop van de druk ejector te werpen. Noteer de tijd en druk en volume / teken verplaatst injectie vel (figuur 2). Maak notities die nodig zijn (dat wil zeggen,grotere pieken, verdunningseffecten, verstopte pipet noisy basislijn / o-scope).
    17. Voor glutamaat injecties Wacht 3-5 min tussen de injecties. Voor KCl injecties wacht 1-2 min tussen de injecties. Injecteren met dezelfde druk en tijd minstens 3 keer. Verander tijd en herhalen. Probeer niet om de druk te veranderen, tenzij de micropipet is verstopt.
    18. Indien de micropipet verstopt, verhoog de druk tot 30 psi.
    19. Opnemen van de gewenste hersengebieden, herhalen aan beide zijden van de hersenen met behulp van verschillende oplossingen. Neem een ​​basislijn in elk nieuw gebied voor 20 min.
    20. Neem de MEA met micropipet bevestigd, spoelen met DI water en genieten in PBS 's nachts totdat al het bloed is verdwenen.
    21. Inslapen het dier en slaan de hersenen bij een gelabelde gelast en bewaard in de -80 ° C vriezer of houdt een zijde voor bevestiging. Het dier, overdosis met isofluraan (inhalatie) euthanize. Voer onthoofding met behulp van chirurgische schaar en ontleden de gewenste gebieden.

7. Reiniging Coated MEA na gebruik

  1. Doe niet schoon MEA als ongebruikt. Als er pluisjes of stof op het oppervlak schoon met methanol en laten drogen gedurende 24 uur voorafgaande aan bekleden.
  2. Zet het waterbad (80 ° C) en geniet het uiteinde van de MEA gedurende 30 min. Veeg de punt van de elektrode met een wattenstaafje om vuil die kan worden overgelaten aan de elektrode te verwijderen. Laat de zwarte "isolatie gedeelte" van de MEA niet nat worden.
  3. Met behulp van drie verschillende sonicators, geniet het uiteinde van de MEA in (1) Citrisolv, een commercieel oplosmiddel en klaringsmiddel (2) isopropyl, en (3) DI water gedurende 5 minuten. Veeg de punt van de elektrode met wattenstaafje om vuil die kan worden overgelaten aan de elektrode te verwijderen.
  4. Onderzoek de tips onder een dissectie microscoop om ervoor te zorgen de lagen zijn met succes verwijderd.

8. Analyse

  1. Om de gegevens te analyseren,eerst exporteren de gewenste experiment door te dubbelklikken op het afgewerkte experiment en het selecteren van "gegevens exporteren" uit het bestand drop-down menu.
  2. Sla deze gegevens om het gewenste bestand locatie en het openstellen van de analyse programma. Klik op "open" in de analyse programma en kies het laatst opgeslagen bestand.
  3. Geef het programma een paar momenten om het bestand te uploaden en controleer vervolgens experiment onder het tabblad eventmarkers. Onder uitgang, de vakjes van de gewenste parameters. Bijvoorbeeld basislijn amplitude piekgebied (oppervlak onder de curve), T stijgen en T 80.
  4. Klik op Vernieuwen en vervolgens te analyseren om de gegevens te exporteren naar een spreadsheet (dit kan een paar minuten duren). Het programma zal een prompt om het bestand op te slaan naar de gewenste locatie te geven. Eenmaal opgeslagen, kan het bestand worden bewerkt in een spreadsheet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel deze technologie kan worden gebruikt om veranderingen in de glutamaterge signalering in vele soorten van dierlijke modellen, zoals traumatisch hersenletsel, veroudering, stress, en epilepsie te meten, hier laten we zien hoe de MEA technologie kan worden gebruikt om glutamatergic veranderingen in transgene muismodel onderzoeken menselijke tauopathie 19, 20. De RTG (TauP301L) 4510 muizen drukt de P301L-mutatie in tau geassoc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De MEA techniek maakt het mogelijk voor het meten van een snelle kinetiek van neurotransmitters en opname in vitro en in vivo. Vandaar dat de technologie produceert een breed scala aan data-uitgang waaronder tonisch neurotransmitter niveaus, opgeroepen afgifte van neurotransmitters en neurotransmitter klaring. Echter, omdat het gebruik van MEA is een relatief complexe procedure, zijn er tal van factoren die mogelijk moeten worden geoptimaliseerd voor succesvol gebruik. Bijvoorbeeld, tijdens het ijken k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GG is de enige eigenaar van Quanteon, LLC dat de FAST-16 registratiesysteem voor glutamaat metingen in dit onderzoek maakt. JEQ is een betaalde consultant voor Quanteon.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Alzheimer's Association (MNR; NIRG-12-242187), WVU Faculty Research Senaat Grant (MNR), en WVU PSCOR Grant (MNR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
FAST-16mkIII-8 kanaalQuanteon16mkIII
Microelectrode arraysCenMetW4 of 8-TRK
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA-305910 g (vervalt na 1 maand)
GlutaraldehydeSigma-AldrichG-6257100 mL (vervalt na 6 maanden)
Glutamaat OxidaseUS Biological of Sigma AldrichG4001-01 of 10064650 UI (vervalt na 6 maanden)
Hamilton-spuitHamilton#803832 spuiten
MethanolBDHUN12304 L
m-Fenyleen-diamine dihydrochloride (mPD)ACROS Organics133056025025 g
Referentie-elektroden (RE-5B)BASMF-20793 elektroden
Op batterijen werkende magnetische roerplaatCole-parmerEW-04804-01Kan bij een andere leverancier worden gekocht
GlutamaatSigma-AldrichG-1626100 g
AscorbinezuurTCI50-81-7500 g
Dopamine HydrochlorideAlfa Aesar62-31-75 g
PerchloorzuurVWRUN2920500 mL
KaliumchlorideVWR7447-40-71 kg
NatriumchlorideVWR7647-40-71 kg
CalciumchlorideMP153502100 g
NatriumhydroxideBDH1310732500 g
Glazen druk-uitwerp pipettenCenMet
Klevende wasKerrlab625Kan bij een andere leverancier worden gekocht
MicrospuitenWorld Precision InstrumentsMF28G-5
ModelleerkleiWalMartKan bij een andere leverancier worden gekocht
Picospritzer IIIParker
ZilverdraadAM systems#786500
ZoutzuurBDH76470102,5 L
PlatinedraadAM Systems778000
LoodpistoolLowes of Home DepotKan bij een andere leverancier worden gekocht
MultimeterWalMartKan bij een andere leverancier worden gekocht
PhysioSuiteKent ScientificKan bij een andere leverancier worden gekocht
SomnoSuiteKent ScientificKan bij een andere leverancier worden gekocht
Stereotaxisch apparaatStoeltingKan bij een andere leverancier worden gekocht
Digital Lab StandardStoeltingKan bij een andere leverancier worden gekocht
Meiji EMZ-microscoopMeijiEMZ-5
BoorDremelMicro
MetricideMetrex102800
SchelpVWRKan bij een andere leverancier worden gekocht
Operatie-schaarVWRKan bij een andere leverancier worden gekocht
Steriele katoenen tamponsPuritan25806Kan bij een andere leverancier worden gekocht
OogzalfPuralube Vet OintmentVerkrijgbaar bij de dierenarts
Jodium-tamponsVWRS48050Kan bij een andere leverancier worden gekocht
Alcohol-tamponsLokaal drogisterijKan bij een andere leverancier worden gekocht
Steriele operatiedekenDynarex4410Kan bij een andere leverancier worden gekocht
Steriele zoutoplossingTeknovaS5815Kan een eigen oplossing maken met behulp van filters
Waterstofperoxide (3%)Lokaal drogisterijKan bij een andere leverancier worden gekocht
VerwarmingskussenWalMartKan bij een andere leverancier worden gekocht

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  2. Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
  3. Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
  4. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  5. Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
  6. He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
  7. Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
  8. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  9. Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441(2016).
  10. Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
  11. Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
  12. Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
  13. Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
  14. Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
  15. Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
  16. Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
  17. Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
  18. Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
  19. Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
  20. Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
  21. Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
  22. Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
  23. Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
  24. Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
  25. Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
  26. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
  27. Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
  28. Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
  29. Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
  30. Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
  31. Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
  32. Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
  33. Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
  34. Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
  35. Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  36. Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
  37. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  38. Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Glutamaatmetingmicroelectrode arraystonisch glutamaathippocampaal glutamaatstereotaxische chirurgieneurotransmittervrijgaveriluzolbehandeling

Gerelateerde artikelen