Methodenartikel

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

DOI:

10.3791/55449

⸱

14 mei 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Histology, Department of Veterinary Sciences, University of Antwerp, 2Cell Systems and Imaging Research Group (CSI), Department of Molecular Biotechnology, Ghent University, 3Department of Biochemistry , Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) regelen essentiële cellulaire processen, waaronder genuitdrukking, migratie, differentiatie en proliferatie. Overmatige ROS-niveaus veroorzaken echter een toestand van oxidatieve stress, die gepaard gaat met onomkeerbare oxidatieve schade aan DNA, lipiden en eiwitten. Zo geeft kwantificering van ROS een directe proxy voor cellulaire gezondheidstoestand. Aangezien mitochondriën tot de belangrijkste cellulaire bronnen en doelstellingen van ROS behoren, is gezamenlijke analyse van mitochondriale functie en ROS-productie in dezelfde cellen van cruciaal belang voor het beter begrijpen van de interconnectie in pathofysiologische omstandigheden. Daarom is een microscopie gebaseerde strategie ontwikkeld voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS niveaus, mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨ m ) en mitochondriale morfologie. Het is gebaseerd op geautomatiseerde widefield fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse van levende aanhechtende cellen, gegroeid in platen met meerdere putjes en staineD met de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (ΔΨ m en mitochondriale morfologie). In tegenstelling tot fluorimetrie of flowcytometrie, kan deze strategie kwantificering van subcellulaire parameters op het niveau van de individuele cel met hoge spatiotemporale resolutie, zowel voor als na experimentele stimulatie. Belangrijk is dat de beeldgebaseerde aard van de werkwijze het mogelijk maakt om morfologische parameters te extraheren naast signaalintensiteiten. De gecombineerde funktieset wordt gebruikt voor exploratieve en statistische multivariate data-analyse om verschillen tussen subpopulaties, celtypes en / of behandelingen te detecteren. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving van de analyse verstrekt, samen met een voorbeeld-experiment dat zijn potentieel voor ondubbelzinnige discriminatie tussen cellulaire staten bewijst na chemische verstoring.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De concentratie van intracellulaire ROS wordt nauwgezet gereguleerd door een dynamisch wisselwerking tussen ROS-producerende en ROS-defusing systemen. Onevenwicht tussen de twee veroorzaakt een staat van oxidatieve stress. Onder de belangrijkste bronnen van ROS zijn mitochondriën 1 . Gezien hun rol in cellulaire ademhaling, zijn ze verantwoordelijk voor het grootste deel van intracellulaire superoxide (O 2 • - ) moleculen 2 . Dit komt voornamelijk uit elektronleklek op O2 bij complex 1 van de elektron transportketting onder omstandigheden van sterk negatief innerlijk mitochondriaal membraanpotentieel (ψψ m ), dat wil zeggen mitochondriale hyperpolarisatie. Aan de andere kant is mitochondriale depolarisatie ook gecorreleerd met verhoogde ROS-productie die wijst op meerdere werkingsmethoden 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Door middel van redoxmodificaties in eiwitten van de splitsingsfusie-machines coördineren ROS de mitochondriale morfologie 9. Bijvoorbeeld, fragmentatie is gecorreleerd met verhoogde ROS-productie en apoptose 10 , 11 , terwijl filamente mitochondriën zijn gekoppeld aan voedingshongersnood en bescherming tegen Mitofagie 12 . Gezien de ingewikkelde relatie tussen cellulaire ROS en mitochondriale morfofunctie, zouden beide ideaal gelijktijdig in levende cellen gekwantificeerd moeten worden. Om dit precies te doen, werd een hoogwaardige beeldbepalingstest ontwikkeld op basis van geautomatiseerde widefieldmicroscopie en beeldanalyse van aanhechtende celculturen die gekleurd zijn met de fluorescerende probes CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (mitochondriale Δψ m en morfologie). High-content beeldvorming verwijst naar de extractie van spAtiotemporally rich ( dat wil zeggen een groot aantal beschrijvende eigenschappen) informatie over cellulaire fenotypen met behulp van meerdere complementaire markers en geautomatiseerde beeldanalyses. In combinatie met geautomatiseerde microscopie kunnen veel monsters parallel worden gescreend ( dwz hoge doorvoer), waardoor de statistische kracht van de test wordt verhoogd. Inderdaad, een belangrijk voordeel van het protocol is dat het gelijktijdige kwantificering van meerdere parameters in dezelfde cel mogelijk maakt, en dit voor een groot aantal cellen en condities.

Het protocol is verdeeld in 8 delen (in detail beschreven in het protocol hieronder): 1) Zaadcellen in een 96-putjesplaat; 2) Bereiding van voorraadoplossingen, werkoplossingen en afbeeldingsbuffer; 3) Opstelling van de microscoop; 4) Laden van de cellen met CM-H2 DCFDA en TMRM; 5) Eerste live imaging ronde om basale ROS niveaus en mitochondriale morphofunction te meten; 6) Tweede live imaging ronde na toevoeging van tert -butylPeroxide (TBHP) om geïnduceerde ROS niveaus te meten; 7) Automatische beeldanalyse; 8) Gegevensanalyse, kwaliteitscontrole en visualisatie.

De test werd oorspronkelijk ontwikkeld voor normale humane dermale fibroblasten (NHDF). Aangezien deze cellen groot en plat zijn, zijn ze goed geschikt voor het beoordelen van mitochondriale morfologie in 2D breedbeeldbeelden 13 , 14 . Echter, met kleine wijzigingen, is deze methode van toepassing op andere aanhechtende celtypes. Bovendien, naast de combinatie van CM-H 2 DCFDA en TMRM, voldoet de workflow aan een verscheidenheid aan fluorescerende kleurstofparen met verschillende moleculaire specificaties 1 , 15 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderstaande protocol wordt beschreven als uitgevoerd voor NHDF-cellen en met behulp van de multiwellplaten die in het materiaalbestand zijn gespecificeerd. Zie Figuur 1 voor een algemeen overzicht van de workflow.

1. Bereiding van reagentia

  1. Bereid volledig medium op door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) te gebruiken met 10% v / v foetale boviene serum (FBS) en 100 IE / ml penicilline en 100 IE / mL streptomycine (PS). Voor 500 ml volledig medium, voeg 50 ml FBS en 5 ml PS toe aan 445 ml DMEM.
  2. Bereid HBSS-HEPES (HH) beeldbuffer door Hank's Gebalanceerde Zoutoplossing (met magnesium en calcium, maar zonder fenolrood) met 20 mM HEPES aan te vullen. Voor 500 ml HH voeg 10 ml 1M HEPES voorraadoplossing toe aan 490 ml HBSS. Controleer de pH en, indien nodig, aanpassen aan pH 7.2.
  3. Bereid 1 mM CM-H2 DCFDA voorraadoplossing door 50 μg CM-H2 DCFDA gelyofiliseerde poeder op te lossen in 86,5 &# 181; L watervrije DMSO. Meng door vortexing of pipettering omhoog en omlaag en maak 20 μL porties in bruine microcentrifugebuizen. Bewaar in het donker bij -20 ° C en gebruik binnen 1 week. Als deze onder N 2- atmosfeer wordt opgeslagen, kan de houdbaarheid tot tenminste 1 maand worden verhoogd.
    1. Bereid 1 mM TMRM voorraadoplossing door 25 mg TMRM poeder in 50 ml watervrije DMSO op te lossen. Meng door vortexing of pipettering omhoog en omlaag en maak 10 μL porties in bruine microcentrifuge buizen. Bewaar in het donker bij -20 ° C. Deze oplossing is minstens een jaar stabiel.
  4. Bereid een nieuw deel van Tert -butyl peroxide (TBHP) voorraad (~ 7 M) voor elk experiment door een volume van de 70% voorraadoplossing (10 μL / 96-putplaat) direct te pipetteren. Bewaar deze aliquot bij 4 ° C tot verder gebruik.
  5. Bereid antilichaam werkoplossing (AB) door twee secundaire antilichamen te verdunnen (Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn en CY3 ezel anti-konijn) 1.000 keer in 1x HH-buffer.

2. Opstellen van het Microscoop- en Acquisitieprotocol (± 15 min)

OPMERKING: Beeldverzameling wordt uitgevoerd met een brede veldmicroscoop uitgerust met een geautomatiseerde fase en luiken, en een op hardware gebaseerde autofocus-systeem met behulp van een 20X luchtplan gecorrigeerde doelstelling (NA = 0.75) en een EM-CCD camera. Bij het opstellen van de test voor de eerste keer wordt een testplaat met controlecellen, gekleurd volgens de instructies van het protocol, gebruikt om de XY-fase te kalibreren en de acquisitie-instellingen te optimaliseren. Als de acquisitie-instellingen al zijn vastgesteld, kan de kalibratie worden uitgevoerd met behulp van een lege plaat.

  1. Verlaag de doelstelling naar het absolute basisniveau en kalibreer de XY-fase volgens de software-instructies.
  2. Zorg ervoor dat de juiste filterblokken zijn geïnstalleerd. Om CM-H 2 DCFDA te visualiseren, gebruik een standaard GFP filterkubus met een 472/30 nm excitatie bandpass filter, een 495 nm cutoff dichroIc spiegel en een 520/35 nm bandpass emissie filter. Voor TMRM, gebruik een filterkubus voor TRITC met een 540/25 nm bandpass excitatie filter, een 565 nm cutoff dichroic spiegel en een 605/55 nm bandpass emissie filter.
  3. Maak een beeldprotocol met behulp van de acquisitie software.
    1. Selecteer het juiste type multiwellplaat (fabrikant en code) uit de lijst met beschikbare platen die in de software zijn geleverd. U kunt ook uw eigen multiwellplaatformaat definiëren met behulp van plaat- en putafmetingen.
    2. Breng de putplaat uit volgens de instructies van de software, bijv. Door twee hoeken van de vier buitenste hoekputten te definiëren. Deze stap heeft betrekking op de variatie van de camera-oriëntatie.
    3. Selecteer de bronnen die moeten worden verworven. Als deze optie niet beschikbaar is in de software, gebruik dan een set handmatig gedefinieerde XY-locaties die overeenkomen met de geselecteerde putten.
    4. Optimaliseer de acquisitie-instellingen (belichtingstijd, lampintensiteit, EM-gain) voor thE twee kanalen afzonderlijk met behulp van de testplaat. Minimaliseer de blootstelling en intensiteit als fluorescentie-excitatie licht zelf induceert ROS. Maar zorg ervoor dat de signaal-naar-achtergrond verhouding ten minste 2 voor basale CM-H 2 DCFDA en 3 voor TMRM is voor TBHP-behandeling, en dat er geen verzadiging is na TBHP-behandeling. De acquisitie-instellingen zijn sterk afhankelijk van de microscopische opstelling en het gebruikte celtype, maar als referentie dienen indicatieve instellingen bij het gebruik van een metalen halogeenlamp van 130 W als lichtbron- en NHDF-cellen die zijn gebrand volgens de instructies van het protocol, als volgt: voor beide CM- H 2 DCFDA en TMRM worden een belichtingstijd van 200 ms en ND filter 8 gebruikt, gecombineerd met een EM-gain van respectievelijk 15 (13 MHz, 14 bit) en 4 (27 MHz, 14 bit). Eenmaal geoptimaliseerd voor een bepaalde setup en celtype, kan deze stap worden overgeslagen.
      OPMERKING: het is essentieel dat de acquisitie-instellingen gedurende het gehele beeldproces gelijk blijven. Voor grootschalige, multi-day experimenten, lamp staDe mogelijkheid moet worden geregeld door middel van een regelmatige kwaliteitscontrole.
    5. Definieer een acquisitie protocol, bestaande uit een opeenvolgende lambda (golflengte) acquisitie. Selecteer het CM-H 2 DCFDA-kanaal dat eerst wordt verworven, om de lichtbelichting voor de meting te minimaliseren.
    6. Definieer een plaatplaatlus om 4 regelmatige, niet-overlappende beelden op elkaar te plaatsen die rondom het midden van elke bron van de putselectie worden geplaatst, met behulp van het acquisitieprotocol gedefinieerd in 2.3.4. Kies meanderende beeldverzameling, dwz eerst van links naar rechts, van goed B02 tot B11, dan terug, van rechts naar links, van put C11 tot C02 enzovoort ( Figuur 2A ). Dit bespaart tijd in vergelijking met links naar rechts beeldverwerving. Als deze optie niet beschikbaar is in de software, moet u de aangepaste set XY-locaties aangemaakt in 2.3.3 aanpassen om dit afbeeldingspatroon aan te nemen.
    7. Bewaar de XY-coördinaten van de afbeeldingsposities ( bijv. In een apart xml-bestand), om een ​​eenvoudige revisitie mogelijk te makenNg in het geval van microscoopherkenning. Dit is vooral belangrijk als de uitlezing uit deze analyse moet worden gecorreleerd met een post-hoc immunofluorescentie (IF) kleuring voor dezelfde cellen.

3 . Zaadcellen in een 96-putjesplaat (45 - 90 minuten, afhankelijk van het aantal verschillende cellijnen)

  1. Werk in steriele omgeving, zoals een klasse 2 bioveiligheidskast en draag handschoenen.
  2. Decontamineren alle oppervlakken en materialen met behulp van 70% v / v ethanol in gedistilleerd water.
  3. Neem een ​​celkweek fles met een 90% confluente celcultuur uit de incubator en plaats het in de biosafety-kast.
  4. Was de cellen tweemaal met PBS 1x.
  5. Voeg de juiste hoeveelheid 0,05% trypsine-EDTA-oplossing op de cellen toe, zorg ervoor dat het volledige celoppervlak bedekt is ( bijv . 1 ml voor een T25-fles) en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
  6. Als alle cellen losgemaakt zijn (controleer met een microscoop ), Voeg kweekmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline-streptomycine, ± 4 ml in een T25-fles) toe om de trypsine-EDTA-oplossing in te schakelen.
  7. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg bij kamertemperatuur.
  8. Gooi de supernatant weg en verwijder de celpellet in kweekmedium. Bepaal de hoeveelheid medium voor elk celtype om een ​​celconcentratie te verkrijgen die compatibel is met celtelling. Gewoonlijk bevat een 90% confluente T25-fles NHDF ongeveer 1-1,5 miljoen cellen, die geresuspendeerd zijn in 3-4 ml kweekmedium.
  9. Tel de cellen met behulp van een cel teller kamer of Coulter teller.
  10. Zaad 8.000-10.000 cellen in elk van de binnenste 60 putten van een zwarte 96-putjesplaat met een dunne continue polystyreen of glazen bodem (zwart om verstrooiing en kruisgesprek tussen naburige putjes tijdens beeldvorming te vermijden). Wanneer u verschillende condities / behandelingen / cellijnen gebruikt, verdeel uw zaaizaadjes homogeen op de plaat om de plaatseffecten te minimaliseren (Fig.> Figuur 2A). De buitenputten, met uitzondering van put B01 en A01, worden niet gebruikt omdat ze meer gevoelig zijn voor rand effecten.
  11. Zaad 8.000-10.000 cellen in B01. Deze bron wordt gebruikt voor focus aanpassing, net voor de opname van het beeld.
  12. Vul de lege buitenbronnen met medium om de gradiënten (temperatuur, vochtigheid, enz. ) Tussen de putten en het milieu te minimaliseren.
  13. Trek de plaat voorzichtig drie keer op voordat u deze terug in de incubator plaatst om te voorkomen dat cellen in patches groeien.
  14. Cultuur de cellen gedurende 24 uur, of tot een samenloopgraad van ca. 70%.
  15. Sla de behandelingsinformatie voor het experiment op in een spreadsheet genaamd "Setup.xlsx". Het bestand bevat vier kolommen en wordt gebruikt om de behandelingen met putten en beeldinformatie te koppelen tijdens data analyse. De vier kolommen zijn: 'Wel', 'Behandelnummer', 'Behandeling' en 'Beheer' (één rij per putje). Elke behandeling is gekoppeldMet een uniek behandelingsnummer, dat wordt gebruikt tijdens data visualisatie om de volgorde van de behandelingen op de X-as van plots te bepalen. De controle kolom geeft de behandeling aan die als controle voor de behandeling in de huidige rij fungeert. Illustraties van een typische experimentele indeling en bijbehorend instellingsbestand worden in figuur 2 afgebeeld.

4. Laden van de cellen met CM-H 2 DCFDA en TMRM (± 45 min)

OPMERKING: Hantering van de cellen op de dag van het experiment kan uitgevoerd worden in een steriele omgeving (biosafety cabinet), maar dit is niet verplicht omdat cellen direct na de test worden verwijderd of opgelost.

  1. Verhit de HH-buffer naar 37 ° C.
  2. Bereid een 20 μM TMRM werkoplossing door verdunning van de 1 mM voorraadoplossing 50 keer in HH-buffer (voeg 490 μL HH-buffer toe aan 1 aliquot van 10 μL TMRM voorraadoplossing).
  3. Bereid een lading voorOplossing met 2 μM CM-H2 DCFDA en 100 nM TMRM. Daartoe verdund de 1 mM CM-H 2 DCFDA voorraadoplossing 500x en de 20 μM TMRM werkoplossing 200x in HH-buffer.
    1. Typisch voor 60 putjes, bereiden 7,5 ml laadoplossing door 15 μl CM-H2 DCFDA en 37,5 μL TMRM-oplossing toe te voegen aan 7447,5 μL HH.
  4. Verwijder het kweekmedium uit de cellen door de plaat ondersteboven in een enkele vloeistofbeweging te draaien.
  5. Was de cellen twee keer zachtjes met HH-buffer met behulp van een multikanaalspipet (100 μl / putje). Gooi de HH-buffer tussen de wasstapjes door de plaat ondersteboven in een enkele vloeistofbeweging te draaien.
  6. Laad de cellen met CM-H 2 DCFDA en TMRM door 100 μL van de laadoplossing aan elke put toe te voegen, opnieuw met behulp van een multikanaalspipet. Incubeer gedurende 25 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Vergeet niet goed B01.
  7. Bereid de werkoplossingen van de oxidant TBHP gedurende deze 25 minuten en zorg ervoor dat de microscoop en accessoire hardware zijn ingeschakeld.
    1. Bereid werkoplossing I: Verdun de 7M voorraadoplossing 70x tot 100 mM (10 μL voorraad in 690 μL HH-buffer).
    2. Bereid werkoplossing II uit: Verdun WS I 100x tot 1 mM (10 μL WSI in 990 μL HH-buffer).
    3. Bereid werkoplossing III uit: Verdun WS III 25x tot 40 μM (voor 60 putjes voeg 300 μL WS II in 7200 μL HH buffer) toe.
  8. Na 25 minuten wassen de cellen tweemaal tweemaal met 100 μl HH-buffer zoals eerder beschreven.
  9. Voeg 100 μL HH-buffer toe aan alle 60 binnenbronnen.

5. Eerste Live Imaging Round om basale ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie te meten (± 15 min)

  1. Zorg ervoor dat de acquisitie software operationeel is en het beeldprotocol is geladen.
  2. Installeer de plaat op de microscoop, zet de hardware ba aanSed autofocus systeem en gebruik goed B01 om de autofocus offset aan te passen met behulp van het TMRM kanaal. Aangezien deze procedure een toename in CM-H 2 DCFDA signaalintensiteit veroorzaakt, wordt deze bron uitgesloten van stroomafwaartse beeldanalyse.
  3. Voer het afbeeldingsprotocol uit.

6. Tweede Live Imaging Round na toevoeging van TBHP om geïnduceerde ROS-niveaus te meten (± 20 min)

  1. Verwijder de 96-putjesplaat uit de microscoop zorgvuldig.
  2. Voeg 100 μL TBHP WS III (40 μM) toe aan elke put met een multikanaalspipet (dit resulteert in een 20 μM TBHP-concentratie in de putjes). Deze verbinding wordt gebruikt als een interne positieve controle voor de CM-H 2 DCFDA-kleuring (het signaal moet stijgen) alsook een middel om geïnduceerde ROS-niveaus te meten.
    OPMERKING: H 2 O 2 kan ook worden gebruikt in plaats van TBHP, maar deze verbinding is minder stabiel en dus minder betrouwbaar.
  3. Wacht tenminste 3 minuten om de complete reactie van TBHP w mogelijk te makenMet CM-H 2 DCFDA.
  4. Voeg gedurende deze tijd 100 μL antilichaam werkoplossing (1/1000) toe aan put A01.
  5. Monteer de plaat weer op de microscoop en controleer opnieuw de focus met behulp van de B01.
  6. Verkrijg dezelfde posities als in de eerste afbeeldingsronde met hetzelfde beeldprotocol.
  7. Exporteer de verworven datasets in een enkele map als afzonderlijke tiff-bestanden met behulp van gestandaardiseerde nomenclatuur die verwijzing naar de plaat, pre- of post-TBHP-behandeling, put, veld en kanaal bevat, gescheiden door onderstrepen, bijv . 'P01_Pre_B02_0001_C1' voor plaat 1, pre-TBHP-behandeling, put B02, veld 1 en kanaal 1. Deze informatie wordt gebruikt tijdens beeldanalyse ( bijv. Om de juiste segmenteringsinstellingen te selecteren), alsmede tijdens data-analyse (om analysegegevens te verbinden Met de juiste behandelingen).
  8. Verkrijg platte veldafbeeldingen voor beide kanalen op alle vier de posities rond het centrum van put A01 met behulp van het acquisitieprotocol. Sla thEm als individuele tiff-bestanden in dezelfde map als de andere afbeeldingen met behulp van de volgende gestandaardiseerde nomenclatuur: 'P01_FF_A01_0001_C1' voor plaat 1, veld 1 en kanaal 1. Zorg ervoor dat de signalen goed in het dynamische bereik liggen; In geval van verzadiging, gebruik een lagere concentratie werkzame oplossing van antilichamen.
  9. Verwijder de plaat of sla het op voor verdere verwerking.
    OPMERKING: In plaats van de plaat uit de microscoop te verwijderen en een multikanaalspipet te gebruiken om de TBHP-oplossing toe te voegen, kan een geautomatiseerde pipet op het microscoopfase worden geïnstalleerd en verbonden met de acquisitie software om te functioneren bij het ontvangen van een trigger. Dit zorgt ervoor dat TBHP bij elke eerste put rechtstreeks na de eerste aansluiting wordt toegevoegd, voordat u naar de volgende put gaat. Op deze manier, wanneer de eerste afbeeldingsronde is afgerond, kan de tweede meteen beginnen en alle putten hebben een gelijke incubatietijd met de TBHP.

7. Beeldverwerking en analyse (± 30 min per96-putje plaat)

OPMERKING: Alle beeldverwerking wordt uitgevoerd in FIJI (http://fiji.sc), een verpakte versie van ImageJ freeware. Een speciaal script werd geschreven voor geautomatiseerde analyse van intracellulaire ROS- en mitochondriale signalen, evenals morfologische parameters (RedoxMetrics.ijm, beschikbaar op aanvraag). De onderliggende algoritmen zijn beschreven in Sieprath et al. 1 .

  1. Zorg ervoor dat FIJI is geïnstalleerd en operationeel.
  2. Start FIJI en installeer de macro-set (Plugins -> Macros -> Install ...). Dit zal een aantal nieuwe macro-opdrachten en een set actieprogramma's aanroepen om de analyse-instellingen te optimaliseren, zoals weergegeven in Figuur 3A .
  3. Open de instellingsinterface om de analyse instellingen in te stellen door op de 'S' knop te klikken ( Figuur 3B ).
    1. Selecteer het beeldtype, het aantal kanalen en de bron die is gebruiktVoor het verwerven van flatfieldbeelden.
    2. Geef aan welk kanaal cellen bevatten (CM-H 2 DCFDA-kanaal) of mitochondria (TMRM-kanaal) en pas de voorverwerkings- en segmenteringsparameters voor elk kanaal aan, afhankelijk van de beeldkwaliteit ( Figuur 3B ). Vink het selectievakje 'Achtergrond' en 'Contrast' aan om respectievelijk respectievelijk respectievelijk achtergrondaftrekking of contrastbegrenzende adaptieve histogramuitkering 16 uit te voeren. Definieer een sigma voor Gaussiaanse vervaging van cellen en Laplaciaanse verbetering van mitochondria. Selecteer een automatisch drempelalgoritme en vul de limietgrootte uit (in pixels). Als een vaste drempel wordt gekozen in plaats van een automatisch drempelalgoritme, vul dan de bovenste drempel in.
    3. Test de segmentatie instellingen op een paar geselecteerde afbeeldingen van de verworven datasets door ze te openen en de 'C' of 'M' knoppen in het menu voor cel- of mitochondria segmentatie respectievelijk te klikken,En pas indien nodig de instellingen aan. Een voorbeeld resultaat is weergegeven in figuur 3C .
  4. Voer de batchanalyse uit op de map (en) van belangstelling door op de knop '#' te klikken en de map met de afbeeldingen te selecteren. Per map produceert dit een nieuwe 'Output'-map met individuele ROI-sets (zip-bestanden) en resultaatbestanden (.txt) per afbeelding. Voor beide kanalen bevat het resultatenbestand intensiteit en morfologische descriptoren. Het CM-H 2 DCFDA-kanaal (cellen) resultatenbestand bevat per descriptor de gemiddelde waarde voor de gecombineerde ROI's in een afbeelding. Voor het TMRM-kanaal bevat het resultatenbestand per omschrijving de waarde voor elke afzonderlijk gesegmenteerde mitochondriale ROI.
  5. Na batchanalyse verifieer je de segmenteringsprestaties visueel op een 'Verificatie stack', een hyperstack van alle afbeeldingen met hun respectieve ROI overlay door op de 'V' knop te klikken. Op deze manier worden artefacten zoals over-/ Onderverdeling, uit focusbeelden of stofdeeltjes / vezels in afbeeldingen kan al snel worden gezien. Verdere curatie kan worden gedaan tijdens de data kwaliteitscontrole (zie §8).

8. Gegevensanalyse, kwaliteitscontrole (QC) en visualisatie

De verwerking en analyse van de rauwe data wordt uitgevoerd met behulp van R statistisch freeware (http://www.rproject.org - versie 3.3.2) en RStudio (http://www.rstudio.com/ - versie 1.0.44). Om de resultaten snel te verkrijgen en te visualiseren is een intuïtieve glanzende applicatie 17 (beschikbaar op aanvraag) ontwikkeld die de data integreert en visualiseert in heatmaps en boxplots en ook statistische analyses uitvoert. In het algemeen bestaat de workflow uit twee opeenvolgende stappen. Ten eerste worden de gegevens verwerkt en geïnspecteerd per 96-putjesplaat om afwijkende datapunten te detecteren. Ten tweede worden gecorrigeerde data van alle platen van een bepaald experiment gecombineerd en geanalyseerd met behulp van niet-parametrische multiVariabele tests 18 en een hoofdcomponent analyse.

  1. Zorg ervoor dat R en RStudio geïnstalleerd en operationeel zijn.
  2. Start RStudio.
  3. Open de glanzende applicatie RedoxMetrics en voer de app uit (kies deze in een externe browser).
  4. Selecteer op de pagina 'invoer' de map waar de resultatenbestanden van RedoxMetrics.ijm zijn.
  5. Zorg ervoor dat 'Setup.xlsx' (aangemaakt in stap 3.15) ook aanwezig is in deze map.
  6. De resultatenbestanden en instellingen worden automatisch geïmporteerd, herschikt en zichtbaar.
    1. Op de pagina 'Experimentele instellingen' wordt de indeling van het experiment weergegeven. Gebruik deze pagina voor verificatie.
    2. Op de volgende pagina, 'resultaten per bord' worden de gegevens voor elke plaat afzonderlijk weergegeven in een kleurcodes met multi-well plate-indeling en in doosplaten met outliers gemarkeerd met naam en beeldnummer. Deze laat toezicht en identificatie toeAfwijking van afwijkende gegevenspunten (extreem hoge of lage waarden vergeleken met de gemiddelde waarden gemeten voor die specifieke behandeling - zie figuur 4 voor een voorbeeld).
      Gebruik deze informatie, controleer de afbeeldingen die overeenkomen met de afwijkende punten. Als abnormaliteiten worden gedetecteerd, moeten ze verwijderd worden van de analyse. De meeste abnormaliteiten worden veroorzaakt door onjuiste segmentatie wanneer (deel) van het beeld buiten focus ligt, of wanneer zeer fluorescerende stofdeeltjes de juiste segmentatie verstoren. Extreme gevallen kunnen al snel worden gedetecteerd met behulp van het Verificatie stapelgereedschap (stap 7.5), maar in deze stap worden meer subtiele gebeurtenissen ontdekt. Als er geen duidelijke of technische reden voor de afwijkende waarde kan worden gevonden, moet de afbeelding niet uit de analyse worden verwijderd.
    3. Optioneel: maak een nieuwe spreadsheet genaamd 'Drop.xlsx' met slechts één kolom genaamd 'Drop'. In deze kolom, geef de bestandsnamen (inclusief ".tif" extensie) van alle beelden opDie uit de analyse moeten worden verwijderd (geïdentificeerd in stap 7.5 of stap 8.6.2). Upload dit bestand met de 'invoer' pagina.
    4. De pagina 'resultaten hele experiment' toont de resultaten van alle platen gecombineerd. Als een dossier is geüpload, wordt dit bestand gebruikt om de opgegeven gegevenspunten uit de analyse te verwijderen.
      Voor elke parameter afzonderlijk worden de gegevens genormaliseerd per plaat volgens hun respectieve controles. Gegevens uit alle platen worden dan gecombineerd, gevolgd door niet-parametrische multivariate tests uit het nparcomp-pakket 18 . Als er slechts 2 behandelingen worden vergeleken, worden twee proefproeven uitgevoerd voor het nonparametrische Behrens-Fisher probleem. Voor meer dan 2 behandelingen wordt een niet-parametrische contrast gebaseerde meervoudige vergelijkingstest gebruikt. De resultaten worden visualiseerd met behulp van boxplots.
    5. De pagina 'cluster analyse' toont de resultaten van een hoofdcomponentanalyse (PCA - R core 'stats' pakket). Gegevens uit 5 parameters (baSal & geïnduceerde ROS, en mitochondriale membraanpotentieel, grootte en cirkelvormigheid) worden gecombineerd om de verschillende behandelingen te onderscheiden op basis van een gevoelig redoxprofiel. Hiertoe wordt een hoofdcomponentanalyse (PCA) uitgevoerd (R core 'stats' pakket). De resultaten worden visualiseerd met behulp van een biplot (ggbiplot pakket - http://github.com/vqv/ggbiplot).
    6. Gebruik de 'download data' pagina om de backend data frames te downloaden die de verwerkte en herschikt data bevatten, zodat ze hergebruik kunnen worden voor meer geavanceerde data visualisatie of statistische analyses.
      OPMERKING: Typische valkuilen en mogelijke oplossingen staan ​​vermeld in tabel 1 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De test is getest met behulp van verschillende controle experimenten, waarvan de resultaten worden beschreven in Sieprath et al. 1 . In het kort is de fluorescentie reactie van CM-H2 DCFDA en TMRM op extrane geïnduceerde veranderingen in respectievelijk intracellulaire ROS en Δψm , gekwantificeerd om het dynamische bereik te bepalen. Voor CM-H 2 DCFDA vertoonde NHDF een lineaire toename in fluorescentiesignaal wanneer behandeld met t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit document beschrijft een microscopiemethode met hoge inhoud voor de gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie in NHDF. Zijn prestatie werd aangetoond met een casestudy over SQV-behandelde NHDF. De resultaten ondersteunen eerder bewijs uit de literatuur waarin verhoogde ROS niveaus of mitochondriale dysfunctie zijn waargenomen na behandeling met type 1 HIV protease remmers, zij het in afzonderlijke experimenten 19 , ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs stellen dat er geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten zijn. De bijbehorende auteur zorgt er ook voor dat alle auteurs gevraagd zijn om alle belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door de Universiteit Antwerpen (TTBOF/29267, TTBOF/30112), het Bijzonder Onderzoeksfonds van de Universiteit Gent (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Projectcode 01-MR0110) en de CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiatief van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO; Nr: CSBR09/013V). Delen van dit manuscript zijn aangepast van een andere publicatie1, met toestemming van Springer. De auteurs danken Geert Meesen voor zijn hulp met de widefield microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagenten
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchloraat (TMRM)ThermoFisher ScientificT668
CM-H2DCFDA (Algemene oxidatieve stressindicator)ThermoFisher ScientificC6827
DimethylsulfoxideSigma)AldrichD8418
MatriPlate 96-Well Glasbodem MicroWell Plate 630 µL-Zwart 0,17 mm Lage Glazen DekselBrooks life science systemsMGB096-1-2-LG-L
HBSS zonder Fenol Rood 500 mLLonzaBE10-527F
DMEM hoge glucose met L-glutamineLonzaBE12-604F
Fosfaat Buffered Saline (PBS) zonder Ca en MgLonzaBE17-516F
HEPES 1 M 500 mLLonza17-737F
Trypsine-Versene (EDTA) OplossingLonzaBE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Ezel Anti-Konijn IgG (H+L)Jackson711-166-152Antilichaam gebruikt voor het verkrijgen van flat-field beeld
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Ezel Anti-Konijn IgG (H+L)Jackson711-546-152Antilichaam gebruikt voor het verkrijgen van flat-field beeld
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
Nikon Ti eclipse widefield microscoopNikon
Perfect Focus System (PFS)Nikonhardware-gebaseerde autofocus systeem
CFI Plan Apo Lambda 20X objectiefNikon
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 met JOBS moduleNikonDeze software wordt gebruikt om de microscoop te besturen en het automatische beeldacquisitieprotocol te programmeren/uit te voeren
ImageJ (FIJI) Versie 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Versie 1.0.44Rstudio
R versie 3.3.2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
  3. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
  4. Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
  5. Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
  6. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
  7. Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
  8. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  9. Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
  10. Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
  11. Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
  12. Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
  13. Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
  14. Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
  15. Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
  16. Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
  17. Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
  18. Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
  19. Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
  20. Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
  21. Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
  22. Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
  23. Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
  24. Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
  25. Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
  26. Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035(2015).
  27. Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
  28. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  29. Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
  30. Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
  31. Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
  32. Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
  33. Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
  34. Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
  35. Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
  36. Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
  37. Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
  38. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

High content MicroscopyReactive Oxygen SpeciesMitochondrial Membrane PotentialMitochondrial MorphologyCellular Redox ProfilingFluorescence MicroscopyImage AnalysisCM H2DCFDA StainingTMRM StainingPrincipal Component Analysis

Gerelateerde artikelen