Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Summary

In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Abstract

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) regelen essentiële cellulaire processen, waaronder genuitdrukking, migratie, differentiatie en proliferatie. Overmatige ROS-niveaus veroorzaken echter een toestand van oxidatieve stress, die gepaard gaat met onomkeerbare oxidatieve schade aan DNA, lipiden en eiwitten. Zo geeft kwantificering van ROS een directe proxy voor cellulaire gezondheidstoestand. Aangezien mitochondriën tot de belangrijkste cellulaire bronnen en doelstellingen van ROS behoren, is gezamenlijke analyse van mitochondriale functie en ROS-productie in dezelfde cellen van cruciaal belang voor het beter begrijpen van de interconnectie in pathofysiologische omstandigheden. Daarom is een microscopie gebaseerde strategie ontwikkeld voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS niveaus, mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨ _m ) en mitochondriale morfologie. Het is gebaseerd op geautomatiseerde widefield fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse van levende aanhechtende cellen, gegroeid in platen met meerdere putjes en staineD met de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen CM-H ₂ DCFDA (ROS) en TMRM (ΔΨ _m en mitochondriale morfologie). In tegenstelling tot fluorimetrie of flowcytometrie, kan deze strategie kwantificering van subcellulaire parameters op het niveau van de individuele cel met hoge spatiotemporale resolutie, zowel voor als na experimentele stimulatie. Belangrijk is dat de beeldgebaseerde aard van de werkwijze het mogelijk maakt om morfologische parameters te extraheren naast signaalintensiteiten. De gecombineerde funktieset wordt gebruikt voor exploratieve en statistische multivariate data-analyse om verschillen tussen subpopulaties, celtypes en / of behandelingen te detecteren. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving van de analyse verstrekt, samen met een voorbeeld-experiment dat zijn potentieel voor ondubbelzinnige discriminatie tussen cellulaire staten bewijst na chemische verstoring.

Introduction

De concentratie van intracellulaire ROS wordt nauwgezet gereguleerd door een dynamisch wisselwerking tussen ROS-producerende en ROS-defusing systemen. Onevenwicht tussen de twee veroorzaakt een staat van oxidatieve stress. Onder de belangrijkste bronnen van ROS zijn mitochondriën ¹ . Gezien hun rol in cellulaire ademhaling, zijn ze verantwoordelijk voor het grootste deel van intracellulaire superoxide (O ₂ ^{• -} ) moleculen ² . Dit komt voornamelijk uit elektronleklek op O2 bij complex 1 van de elektron transportketting onder omstandigheden van sterk negatief innerlijk mitochondriaal membraanpo....

Protocol

Het onderstaande protocol wordt beschreven als uitgevoerd voor NHDF-cellen en met behulp van de multiwellplaten die in het materiaalbestand zijn gespecificeerd. Zie Figuur 1 voor een algemeen overzicht van de workflow.

1. Bereiding van reagentia

1. Bereid volledig medium op door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) te gebruiken met 10% v / v foetale boviene serum (FBS) en 100 IE / ml penicilline en 100 IE / mL streptomycine (PS). Voor 500 ml volledig medium, voeg 50 ml FBS en 5 ml PS toe aan 445 ml DMEM.
2. Bereid HBSS-HEPES (HH) beeldbuffer door Hank's Gebalanceerde Zoutoplossing (m....

Results

De test is getest met behulp van verschillende controle experimenten, waarvan de resultaten worden beschreven in Sieprath et al. ¹ . In het kort is de fluorescentie reactie van CM-H2 DCFDA en TMRM op extrane geïnduceerde veranderingen in respectievelijk intracellulaire ROS en Δψm _, gekwantificeerd om het dynamische bereik te bepalen. Voor CM-H ₂ DCFDA vertoonde NHDF een lineaire toename in fluorescentiesignaal wanneer behandeld met t.......

Discussion

Dit document beschrijft een microscopiemethode met hoge inhoud voor de gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie in NHDF. Zijn prestatie werd aangetoond met een casestudy over SQV-behandelde NHDF. De resultaten ondersteunen eerder bewijs uit de literatuur waarin verhoogde ROS niveaus of mitochondriale dysfunctie zijn waargenomen na behandeling met type 1 HIV protease remmers, zij het in afzonderlijke experimenten ^{19 , .......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethyl sulfoxide	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded	Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective	Nikon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	Nikon		This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44	Rstudio
R version 3.3.2