Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd

7.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55453

⸱

24 maart 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Samenvatting

Het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor antituberculosegeneesmiddelen wordt belemmerd door de inefficiënte translatie van verbindingen met in vitro activiteit naar effectiviteit in de klinische setting. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan aandacht voor de fysiologisch relevante cellulaire penetratiebarrières die bestaan in de geïnfecteerde gastheer. We hebben onlangs een alternatief infectiemodel gevestigd dat grote macrofaagaggregatstructuren genereert die dicht gepakte M. tuberculosis (Mtb) in het midden bevatten, wat geschikt was voor geneesmiddelgevoeligheidstests. Dit infectiemodel is goedkoop, snel en het belangrijkste is BSL-2 compatibel. Hier beschrijven we de experimentele procedures om Mtb/macrofaagaggregatstructuren te genereren die macrofaag-gepassageerde Mtb zouden produceren voor geneesmiddelgevoeligheidstests. In het bijzonder demonstreren we hoe dit infectiesysteem direct kan worden aangepast aan het 96-well plate-formaat dat doorvoercapaciteit toont voor het screenen van verbindingsbibliotheken tegen Mtb. Over het algemeen is deze test een waardevolle aanvulling op de momenteel beschikbare Mtb geneesmiddelontdekkingstoolbox vanwege zijn eenvoud, kosteneffectiviteit en schaalbaarheid.

Inleiding

Tuberculose (tbc) blijft een ernstige bedreiging voor de wereldwijde gezondheid ondanks de beschikbaarheid van anti-TB chemotherapie regimes voor meer dan 40 jaar 1. Dit is deels te wijten aan de eis voor langere tijd de behandeling van meer dan 6 maanden gebruik van meerdere combinaties van geneesmiddelen, wat leidt tot niet-naleving 2 patiënt. De opkomst van resistente tbc in de afgelopen jaren nog verergerd problemen op een gebied waar de succesvolle ontwikkeling van klinisch goedgekeurde medicijnen is vrijwel non-existent 3. Sterker nog, ondanks uitputtende anti-TB geneesmiddelenontwikkeling slechts één geneesmiddel goedgekeurd door de FDA voor klinisch gebruik in de afgelopen 40 jaar 4. Zo worden nieuwe generaties anti-TB middelen dringend nodig om dit probleem aan te pakken.

Een belangrijk probleem bij tuberculose geneesmiddelen is het gebrek aan succesvolle overdracht uit verbindingen met in vitro activiteit werkzaamheid in de klinische setting= "xref"> 5, 6, 7. Aanvankelijk werden doelwit gebaseerde benaderingen gebruikt om te screenen op anti-Mtb drugs 5, die niet aan te vertalen naar hele bacteriële cellen. Zelfs wanneer Mtb cellen worden gebruikt, wordt vaak uitgevoerd met behulp bouillon gekweekt culturen, die niet nauwkeurig kan voorspellen geneesmiddelefficiëntie in vivo 8, 9. Deze problemen zijn erkend en screeningstesten voor geneesmiddelen tegen macrofagen bevattende Mtb of latente Mtb werden met succes 8, 10, 11, 12. Echter, zelfs deze meer geavanceerde assays onvoldoende rekening met de penetratie barrières drugs tegenkomen in de niet-gevasculariseerd pulmonaire laesies en in de necrotische foci op de plaats van infectie. InderdaadZelfs voor de eerste lijn TB geneesmiddel rifampicine is suboptimale dosering ondervraagd door onvoldoende in vivo weefsel en cerebrospinale vloeistof (CSF) penetratie 13, 14, 15 en verminderde werkzaamheid tegen intracellulaire Mtb 8, 9. Als zodanig, nieuwe modellen en testen die rekening zou houden met deze parameters tijdens het voortouw ontwikkelingsproces vroeg zou ongetwijfeld verbeteren TB drug discovery inspanningen.

Om aan deze behoefte te pakken, hebben we onlangs een goedkope, snelle en BSL-2 compatibele alternatieve infectie model voor MTB werkzaamheid van het geneesmiddel testen 16. Deze infectie model dichtbevolkte geproduceerd gepakt MTB in grote macrofagen aggregaat structuren, die fysiologisch relevante cellulaire penetratie barrières recapituleerde en genereerde macrofaag-gepasseerd MTB met een veranderde fysiologische toestand die lijkt op latente MTB. Mtb afgeleid van deze infectie model werd gecombineerd met de Resazurin microtiter assay (REMA) om de werkzaamheid van geneesmiddelen, waarvan de resultaten in overeenstemming met andere intracellulaire infectie modellen geproduceerd evalueren en goed gecorreleerd met de gerapporteerde vermogen van gemeenschappelijke TB drugs hoge CSF-concentraties ten opzichte van serumconcentraties bereiken 16.

Hier beschrijven we in detail de generatie van MTB / macrofaag aggregaat structuren te produceren macrofaag gepasseerd MTB geschikt voor drug gevoeligheid testen met behulp van REMA. In het bijzonder tonen we hoe deze infectie systeem kan worden aangepast om een ​​96-well formaat voor compatibiliteit met screening van kandidaat anti-TB-geneesmiddelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Als M. tuberculosis mc 2 6206 is een avirulente stam 17, 18, kunnen alle werkzaamheden in dit protocol worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2-faciliteit (BSL-2).

1. Cultuur Voorwaarden voor Green Fluorescent Protein Het uiten van M. tuberculosis mc 2 6206 (MTB-GFP)

LET OP: De M. tuberculosis H37Rv afkomstig auxotroof stam mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) getransformeerd met de GFP tot expressie plasmide pMN437 wordt in dit protocol 16 gebruikt. Het is mogelijk om het Mtb-GFP-stam te vervangen door niet-GFP tot expressie brengende wildtype gemakkelijker toegankelijkheid van de stam voor onderzoekers mogelijk. Echter, GFP expressie is wenselijk om visuele bevestiging van fagocytose en de vorming van MTB / macrofaag aggregaten mogelijk te maken. voor long termijnopslag, Mtb-GFP werden ingevroren bij -80 ° C in volledige 7H9 medium (in stap 1.1 beschreven) aangevuld met 20% glycerol.

  1. Bereid volledige Mtb GFP media (7H9-C) door aanvulling 7H9-medium met 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, 24 ug / ml D-pantotheenzuur, 50 ug / mL L-leucine en 50 ug / ml hygromycine B.
  2. Dooi een flacon van MTB-GFP en toe te voegen aan 10 ml van 7H9-C in een 30 ml vierkante bodem PETG kolf.
  3. Incubeer bij 37 ° C op roterende schudmachine (50 rpm). Neem metingen van optische dichtheid (OD 600) om de paar dagen tot OD 600 1,0 (ongeveer 5-8 dagen) bereikt.
  4. Verdunnen en passage cultuur als nodig is om een OD 600 te handhaven tussen 0,2-1,0.
  5. Voor infectie, gebruik van een gevestigde cultuur van de MTB-GFP in de logaritmische groeifase (OD 600 van 0,6-1). Om clumpy culturen voorkomen, ultrasone trillingen de cultuur kolf Mtb in een waterbad (130 W, 3 x 5 en peulvruchten) ONCe of twee keer per week

2. Cultuur Voorwaarden voor THP-1 cellen

  1. Bereid volledige THP-1 celmedium (RPMI-C) door toevoeging RPMI 1640 medium met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine en 10 mM HEPES.
  2. Incubeer cellen in een T-75 kolf bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.
  3. Aantal cellen met een hemocytometer of flowcytometrie om de dag te handhaven en THP-1 cellen bij een dichtheid tussen 0,1-0.600.000 per mL.

3. Infectie Protocol bij MTB / macrofaag Aggregate Structures Genereer

  1. THP-1 celpreparaat (per 96 putjes)
    1. Centrifugeer 7 x 10 6 THP-1 cellen bij 250 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in 7 ml RPMI-C.
  2. Mtb-GFP voorbereiding
    1. Centrifuge 2,8 x 10 8 MTB-GFP bij 3200 xg gedurende 5 minuten in een swingende-bucket centrifuge uzingen een omzetting van OD 600 1,0 = 3 x 10 8 bacteriën / ml.
    2. Was eenmaal met RPMI-C en gecentrifugeerd zoals in stap 3.2.1.
    3. Resuspendeer in 7 ml RPMI-C en vortex gedurende 10 s.
  3. Infectie
    OPMERKING: Zie figuur 1 voor de template.
    1. Bereid een 96-well plaat door toevoeging van 200 pl steriel water in rijen A en H en kolommen 1 en 12 een rand water om verdamping van kweekmedium voorkomen.
    2. Voeg 200 ul RPMI-C kolom 2 (B2 G2) voor de achtergrond controle (blanco).
    3. Te infecteren, voeg Mtb GFP suspensie (stap 3.2) aan THP-1 cel suspensie (stap 3.1) en meng goed door pipetteren. De uiteindelijke THP-1 celdichtheid 5 x 10 5 per ml en de overeenkomstige multipliciteit van infectie 40.
    4. Giet de THP-1 / MTB-GFP ophanging in een 25 ml reservoir.
    5. Voeg 200 ul van THP-1 / Mtb GFP suspensie alle resterende 96 putjes (B3 tot G11) usinga multi-channel pipet.
      Opmerking: Als het werken met meerdere 96-well platen, regelmatig resuspendeer de resterende THP-1 / Mtb suspensie in het reservoir om een gelijkmatige mengsel wordt aan elk putje toegevoegd.
    6. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 7-10 dagen.
    7. Veranderen media elke 2 dagen door langzaam verwijderen 100 pi bracht inhoud van de bovenkant van elk putje en voorzichtig toevoegen van 100 ul voorverwarmde RPMI-C een multi-kanaal pipet. Niet putjes resuspendeer verstoren de Mtb / macrofaag aggregaten op de bodem van de putjes.
    8. Visueel onderzoek van de putten door fluorescentie microscopie (4-10X doelstelling) per dag, rekening houdend met de omvang van de MTB / macrofaag aggregaten. Per dag 7-10, moet MTB / macrofaag aggregaten voldoende groot zijn (zie figuur 2 voor de referentie) om door te gaan naar de werkzaamheid van drugs testen (hoofdstuk 4).
    9. Indien gewenst, foto's maken van de 96-wells met behulp van een geautomatiseerd cell imaging-systeem gemonteerdmet heldere veld en GFP filter sets te MTB / macrofaag aggregaat vorming documenteren.
      LET OP: Als gebruikers geen toegang hebben tot een geautomatiseerd imaging systeem kunnen beelden van representatieve putten worden genomen met behulp van een geschikte microscoop met GFP en heldere veld mogelijkheden.

4. Groei Remming Assay te beoordelen Drug werkzaamheid tegen Mtb Afgeleid van MTB / macrofaag Aggregaten

  1. Bereiding geneesmiddel (triplo voorwaarden voor twee geneesmiddelen)
    OPMERKING: Zie figuur 1A voor template.
    1. In een afzonderlijke 96-well plaat, voeg 125 ul van 7H9-C media B2 tot G10.
    2. Bereid twee geneesmiddelen dubbel zo hoog gewenste eindconcentratie in 1 ml van 7H9-C die overeenkomt met het verdunning in stap 4.2.4.
    3. Voeg 250 ul van elk geneesmiddel te putten B11-C11-D11 en E11-F11-G11, respectievelijk drievoud behandelingen.
    4. Een multi-kanaal pipet, serieel dilute de test drugs tweevoudige door het bewegen van 125 pi van B11-G11 in B10-G10. Meng door pipetteren 5 keer bij elke stap.
    5. Verder 125 ul van kolom naar kolom (van rechts naar links) over de plaat en stoppen na kolom 4.
    6. Na het mengen kolom 4, gooi 125 ul in een afvalcontainer. Kolommen 2 en 3 mogen geen drugs bevatten om voor gebruik als een achtergrond (lege) en positieve controles groei.
      NB: Als alternatief, volg sjabloon in figuur 1B voor het testen van drugs bibliotheken. Elke 96-putjesplaat kan geschikt 58 geneesmiddelen bij één concentratie. Bereid deze drug plaat met behulp van het dubbele van de gewenste uiteindelijke concentratie, omdat het in de helft zal worden verdund in stap 4.2.4.
  2. Behandeling met geneesmiddelen:
    1. Haal de 96-well plaat met de Mtb geïnfecteerde macrofagen (MTB / macrofaag aggregaten).
    2. decanteren zorgvuldig alle relevante bronnen (B2 door middel van G11) met een multi-channel pipet.Voer deze in een twee-staps manier: eerste 150 ul verwijderen zonder het kantelen van de plaat en verwijder de resterende media (~ 50 pi) door het kantelen van de plaat en het plaatsen van de pipet tip om de onderste rand van de put. Zoals Mtb / macrofaag aggregaten aanhanger van de bodem van de put, mag geen materiaal verloren.
    3. Zachtjes 100 ul van 7H9-C media toe te voegen aan alle relevante bronnen (B2 door middel van G11) van de plaat met de MTB / macrofaag aggregaten.
    4. Een multi-kanaal pipet, breng 100 ui van de geneesmiddel bevattende 96 putjes (stap 4,1) in de overeenkomstige putjes van de plaat infectie.
    5. In een afgesloten zak en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C.

5. Het kwantificeren van de werkzaamheid van het geneesmiddel met behulp van de Resazurin Microtiterplaten Assay

  1. Bereid Resazurin voorraadoplossing bij een uiteindelijke concentratie van 0,8 mg / ml in H2O gefiltreerd door 0,22 urn poriegrootte PVDF membraan sterilisatie.
  2. Bereid resazurin werkoplossing door mengen Resazurin voorraadoplossing, H2O en Tween-80 (20% oplossing in H 2 O) in een 2: 1: 1 ratio. Uiteindelijke concentraties 0,4 mg / ml resazurine en 5% Tween-80.
  3. Met behulp van een plaatlezer, opstelling een programma fluorescentie afgelezen bij 530 nm excitatie en 590 nm emissie elke 30 min gedurende 24 uur bij 37 ° C. Voorverwarmen plaatlezer bij 37 ° C.
  4. Voeg 20 ul van Resazurin werkoplossing alle relevante putjes (B2 tot G11) van de met geneesmiddel behandelde plaat (stap 4.11) een multi-channel pipet.
  5. Plaats de plaat op de plaat lezer en start de set-up in stap 5.3 programma.
    Opmerking: Om de verwerking van grote hoeveelheden testplaten vergemakkelijken, kan worden volstaan ​​met de bepaling in een 37 ° C incubator ontwikkelen en uitvoeren van één leest fluorescentie elke 24 uur. Dit is ook van toepassing op gebruikers die geen toegang hebben tot een plaat reader met kinetische en incubatie bekwaamheden beschikken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de robuustheid van aanpassing van deze infectie model 96-well plaat formaat bevestigen we hier onderzocht de drug gevoeligheid van Mtb afgeleid van onze 96-well aangepast infectiemodel tegen rifampicine (RIF) en moxifloxacine (Moxi) volgens het model weergegeven in figuur 1A. We tonen aan dat het genereren van Mtb / macrofaag aggregaatstructuren sleutel tot deze test betrouwbaar kan worden geproduceerd in een 96-well plaat formaat (Figuur 2),...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we gedetailleerd beschreven alternatieve Mtb infectiemodel geschikt voor drug werkzaamheid testen. Dit model houdt rekening met twee belangrijke factoren die meer rekening moet worden gehouden tijdens de vroege TB geneesmiddelenontwikkelingsproces: de aanwezigheid van fysiologisch relevante barrières voor penetratie van het geneesmiddel en metabolische veranderingen van Mtb tijdens infectie. Terwijl we eerder de voordelen van onze infectie model hebben laten zien en de mogelijkheid van het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Frank Wolschendorf voor toegang tot de Cytation 3 geautomatiseerde beeldvormingsplaatlezer. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH-subsidie R01-AI104499 aan OK. Delen van het werk werden uitgevoerd in de UAB CFAR-faciliteiten en door de UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, die worden gefinancierd door NIH/NIAID P30 AI027767 en door NIH 5P30 AR048311.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
7H9BD Difco271310Volg de aanbevelingen van de fabrikant
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761Bereid 20% stockoplossing in H2O; filter steriliseren
D-Pantotheenzuur hemicalciumzoutSigmaP5710Bereid 24 mg/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren
L-leucineMP Biomedicals194694Bereid 50 mg/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren
Hygromycin BEMD Millipore400051Bereid 200 mg/mL stockoplossing in H2O
Nalgene Square PETG mediaflesThermo Fisher2019-0030
RPMI 1640 mediaHycloneSH30027.01
Fetaal bovien serumAtlanta BiologicalsS12450H
L-glutamineCorningMT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Cytation 3 platelezerBiotekUitwisselbaar met elke fluorescente platelezer en microscoop
Gen5 SoftwareBiotekOpname en analyse van rezasurin conversie
Rifampicine Fisher ScientificBP2679250Bereid 10 mg/mL stockoplossing in H2O
Moxifloxacine HydrochlorideAcros Organics457960010Bereid 10 mg/mL stockoplossing in H2O
Resazurin natriumzoutSigmaR7017Bereid 800 μg/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren
Tween-80Fisher ScientificT164500Bereid 20% stockoplossing in H2O; filter steriliseren

Referenties

  1. Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
  2. Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
  3. Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
  4. Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
  5. Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
  6. Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
  7. Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
  8. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).
  9. Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
  10. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114(2014).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
  12. Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
  13. Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117(2015).
  14. van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
  15. Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
  16. Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
  17. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  18. Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
  19. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
  20. Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
  21. Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Macrofage aggregaatstructurengevoeligheidstesten voor geneesmiddelenresazurine assay96 wellplaatformaatTHP1 monocytenBSL 2 compatibel modelhigh throughputscreeningfluorescentiemicroscopielevensvatbaarheidskleurstof
Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.