Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Samenvatting

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Samenvatting

Het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor antituberculosegeneesmiddelen wordt belemmerd door de inefficiënte translatie van verbindingen met in vitro activiteit naar effectiviteit in de klinische setting. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan aandacht voor de fysiologisch relevante cellulaire penetratiebarrières die bestaan in de geïnfecteerde gastheer. We hebben onlangs een alternatief infectiemodel gevestigd dat grote macrofaagaggregatstructuren genereert die dicht gepakte M. tuberculosis (Mtb) in het midden bevatten, wat geschikt was voor geneesmiddelgevoeligheidstests. Dit infectiemodel is goedkoop, snel en het belangrijkste is BSL-2 compatibel. Hier beschrijven we de experimentele procedures om Mtb/macrofaagaggregatstructuren te genereren die macrofaag-gepassageerde Mtb zouden produceren voor geneesmiddelgevoeligheidstests. In het bijzonder demonstreren we hoe dit infectiesysteem direct kan worden aangepast aan het 96-well plate-formaat dat doorvoercapaciteit toont voor het screenen van verbindingsbibliotheken tegen Mtb. Over het algemeen is deze test een waardevolle aanvulling op de momenteel beschikbare Mtb geneesmiddelontdekkingstoolbox vanwege zijn eenvoud, kosteneffectiviteit en schaalbaarheid.

Inleiding

Tuberculose (tbc) blijft een ernstige bedreiging voor de wereldwijde gezondheid ondanks de beschikbaarheid van anti-TB chemotherapie regimes voor meer dan 40 jaar ^1. Dit is deels te wijten aan de eis voor langere tijd de behandeling van meer dan 6 maanden gebruik van meerdere combinaties van geneesmiddelen, wat leidt tot niet-naleving ² patiënt. De opkomst van resistente tbc in de afgelopen jaren nog verergerd problemen op een gebied waar de succesvolle ontwikkeling van klinisch goedgekeurde medicijnen is vrijwel non-existent ^3. Sterker nog, ondanks uitputtende anti-TB geneesmiddelenontwikk....

Protocol

LET OP: Als M. tuberculosis mc ² 6206 is een avirulente stam ^{17, 18,} kunnen alle werkzaamheden in dit protocol worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2-faciliteit (BSL-2).

1. Cultuur Voorwaarden voor Green Fluorescent Protein Het uiten van M. tuberculosis mc ² 6206 (MTB-GFP)

LET OP: De M. tuberculosis H37Rv afkomstig auxotroof stam mc ² 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) getransformeerd met de GFP tot expressie plasmide pMN437 wordt in dit protocol ^16....

Resultaten

Om de robuustheid van aanpassing van deze infectie model 96-well plaat formaat bevestigen we hier onderzocht de drug gevoeligheid van Mtb afgeleid van onze 96-well aangepast infectiemodel tegen rifampicine (RIF) en moxifloxacine (Moxi) volgens het model weergegeven in figuur 1A. We tonen aan dat het genereren van Mtb / macrofaag aggregaatstructuren sleutel tot deze test betrouwbaar kan worden geproduceerd in een 96-well plaat formaat (Figuur 2),.......

Discussie

Hier hebben we gedetailleerd beschreven alternatieve Mtb infectiemodel geschikt voor drug werkzaamheid testen. Dit model houdt rekening met twee belangrijke factoren die meer rekening moet worden gehouden tijdens de vroege TB geneesmiddelenontwikkelingsproces: de aanwezigheid van fysiologisch relevante barrières voor penetratie van het geneesmiddel en metabolische veranderingen van Mtb tijdens infectie. Terwijl we eerder de voordelen van onze infectie model hebben laten zien en de mogelijkheid van het .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
7H9	BD Difco	271310	Volg de aanbevelingen van de fabrikant
Middlebrook OADC	BD Biosciences	212351
Tyloxapol	Sigma	T8761	Bereid 20% stockoplossing in H2O; filter steriliseren
D-Pantotheenzuur hemicalciumzout	Sigma	P5710	Bereid 24 mg/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren
L-leucine	MP Biomedicals	194694	Bereid 50 mg/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren
Hygromycin B	EMD Millipore	400051	Bereid 200 mg/mL stockoplossing in H2O
Nalgene Square PETG mediafles	Thermo Fisher	2019-0030
RPMI 1640 media	Hyclone	SH30027.01
Fetaal bovien serum	Atlanta Biologicals	S12450H
L-glutamine	Corning	MT25005CI
HEPES	Hyclone	SH30237.01
Cytation 3 platelezer	Biotek		Uitwisselbaar met elke fluorescente platelezer en microscoop
Gen5 Software	Biotek		Opname en analyse van rezasurin conversie
Rifampicine	Fisher Scientific	BP2679250	Bereid 10 mg/mL stockoplossing in H2O
Moxifloxacine Hydrochloride	Acros Organics	457960010	Bereid 10 mg/mL stockoplossing in H2O
Resazurin natriumzout	Sigma	R7017	Bereid 800 μg/mL stockoplossing in H2O; filter steriliseren
Tween-80	Fisher Scientific	T164500	Bereid 20% stockoplossing in H2O; filter steriliseren