Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Summary

Dit handschrift maakt gebruik van de Fiji-gebaseerde open-source softwarepakket VirusMapper single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie microscopie afbeeldingen om nauwkeurige modellen van de nanoschaal structuur te genereren.

Abstract

Super-resolutie fluorescentiemicroscopie is momenteel een revolutie in de celbiologie onderzoek. De capaciteit om de resolutie limiet van ongeveer 300 nm maakt het mogelijk om de routine beeldvorming van nanoschaal biologische complexen en processen te breken. Deze toename in resolutie betekent dat werkwijzen populair in elektronenmicroscopie, zoals alleenstaande-analyse van deeltjes kan gemakkelijk worden toegepast op superresolutie-fluorescentiemicroscopie. Door die analytische benadering superresolutie optische beeldvorming, wordt het mogelijk te profiteren van het molecuul-specifieke labeling vermogen van fluorescentiemicroscopie structurele kaarten van moleculaire elementen genereren binnen een metastabiele structuur. VirusMapper - - verpakt als een eenvoudig te gebruiken, high-performance en high-throughput ImageJ plugin Daartoe hebben we een nieuw algoritme ontwikkeld. Dit artikel geeft een uitgebreide gids voor deze software presentatie van zijn vermogen om nieuwe structurele kenmerken onthullen in biologische mMolecular complexen. Hier presenteren we hoe u compatibele gegevens monteren en zorgen voor een stap-voor-stap protocol over hoe dit algoritme te gebruiken om single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie beelden.

Introduction

Super-resolutie (SR) microscopie heeft een grote invloed op de celbiologie gehad door het verstrekken van de mogelijkheid om beelden op de belangrijkste moleculaire processen samen met de moleculaire specifieke etikettering van cruciaal belang om ze te begrijpen. SR maakt het nu mogelijk een lichtmicroscoop de resoluties (20-150 nm) voorheen alleen haalbaar met elektronenmicroscopie (EM) met behoud van de grote voordelen van het licht microscopie, zoals de mogelijkheid om de afbeelding levende cellen ^{1, 2} te benaderen. Verder kan de structurele conservering gevonden op nanoschaal niveau staat de toepassing van enkele deeltjes analyse (SPA) om SR data, een concept uitgebreid in elektronenmicroscopie ^3. Gebruik SPA, veel sterk geconserveerde exemplaren van een structuur af te beelden en gemiddeld samen met de resolutie, nauwkeurigheid of signaal-ruis van de gevisualiseerde object verbeteren. Bij gebruik in combinatie met SR, is SPA is aangetoond dat een krachtig hulpmiddel voor de high-precision kaart brengen van onderdelen van de nucleaire porie complex ^{4, 5, 6} centrosomes en virussen, zoals HIV en ^HSV-7 1 ^8.

Toch heeft de routine gecombineerde toepassing van SR en SPA uitgedaagd door een gebrek aan beschikbare software. Daarom ontwikkelden we VirusMapper, een plugin om het populaire beeld processing software ImageJ / Fiji ^9. Dit is de eerste vrij beschikbare software pakket voor gegeneraliseerde SPA met fluorescentie beelden ¹⁰ ontworpen om snelle, gebruiksvriendelijke, multi-channel naïeve middeling van structuren afgebeeld met SR microscopie te bieden. Hoewel ontworpen virussen, kan worden toegepast op elk macromoleculair complex waarbij verschillende moleculaire species kunnen worden afgebeeld, geïdentificeerd en gelokaliseerd.

VirusMapper kan worden gebruikt voor de productie van hoge precisie moleculairemodellen van elke bekende structuur, waardoor de berekening van gemiddelde afmetingen en andere parameters. Het algoritme ontwerp maakt het bijzonder bruikbaar voor het scheiden van populaties van structuren, betreffende de vaststelling van verschillende oriëntaties of verschillende morfologische toestanden. Bovendien kan multichannel beeldvorming worden gebruikt om een ​​referentiekanaal in gevallen passen wanneer de onderliggende structuur staat bekend, waardoor voor referentie gebaseerde structuur ontdekking. De instructies voor het downloaden en installeren van de software zijn voorzien op https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Voorbeeld gegevens kunnen ook daar te vinden, en gebruikers worden geadviseerd om te oefenen met behulp van de software op het voorbeeld data voordat u probeert toe te passen op hun eigen land.

Hier zijn de stappen voor het gebruik van deze plugin om SPA modellen uit ruwe data produceren, worden beschreven. De software neemt RAW-afbeeldingen met single- or multi-gemerkte structuren als input. Het keert, onder voorbehoud van een aantal parameters die zijn aangepast omdat de software wordt uitgevoerd, SPA modellen die het gemiddelde verdelingen van de gelabelde componenten binnen het afgebeelde structuren.

Het doel van dit protocol is nauwkeurige SPA modellen die de gemiddelde lokalisaties van onderdelen binnen afgebeelde constructies volgens de in figuur 1 pijplijn te produceren. Zoals getoond in figuur 1, is de software workflow nuttige wijze verdeeld in drie fasen. De eerste fase is het segmenteren grote afbeeldingen, waardoor stapels deeltjes per kanaal. Deze deeltjes zijn de eenheden die zullen worden gemiddeld om modellen te maken en om zaden voor de generatie van het model te produceren. De tweede fase is het zaad afbeeldingen, die worden gebruikt om het geheel van de deeltjes te registreren in de slotfase genereren. Dit gebeurt door het kiezen van een referentiekanaal en handmatig te selecteren deeltjes in dit kanaal zal bijdragen aan de seeds. Zaden worden gekozen deze referentiekanaal maar kunnen worden gegenereerd voor alle kanalen. Deeltjes worden initieel uitgelijnd door het aanbrengen van een 2D Gaussische in dit kanaal. Alle deeltjes die zijn geselecteerd en opnieuw uitgelijnd worden vervolgens gemiddeld om een ​​zaad te produceren. Voor elke gemeenschappelijke structuur gezien in de gegevens die moeten worden gemodelleerd dient deeltjes gekozen als zaden die duidelijk en nauwkeurig die structuur geven. De interface in dit stadium ook bruikbaar voor het scannen van de gegevens voor dergelijke structuren.

De laatste fase is om modellen te genereren met behulp van template matching. Dit wordt bereikt door de registratie van de deeltjes aanvankelijk onttrokken aan het zaad gegenereerde beelden in de vorige paragraaf door kruiscorrelatie. Een subset van geregistreerde deeltjes samen gemiddeld, en de werkwijze verder herhaald om model te verminderen gemiddelde gekwadrateerde fout, indien gewenst. Deze subset wordt bepaald door het instellen van een minimum overeenkomst tegen het zaad dat moet worden voldaan. Bij het maken modelTussen gelijktijdig meerdere kanalen, het gewricht gelijkenis of het gemiddelde van de overeenkomsten voor elk kanaal, wordt gebruikt. De resulterende modellen en de geregistreerde deeltjes die bijdragen aan hen kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd.

Protocol

LET OP: Dit protocol en video aanvulling op de originele papieren ¹⁰ beschrijven van het softwarepakket in meer detail. Lezers worden aangemoedigd om deze zorgvuldig voor bijkomende richtlijnen met betrekking tot het gebruik van de software. Er zijn drie belangrijke stappen: extractie deeltjes, welke segmenten grote afbeeldingen in afzonderlijke deeltjes; zaadselectie, waarbij gemeenschappelijke structuren zijn aangegeven in de data en gepositioneerd met zaden, die worden gebruikt in de eindfase te produceren; en de generatie van het model, waar de template matching op basis van deze zaden lijnt de gewonnen deeltjes en gemiddelden een subset van de SPA-modellen te produceren.

1. Setup uit te voeren voordat het softwarepakket

1. Bereid monsters van de structuur te bestuderen op een dekglaasje of relevante proefomstandigheden.
2. Het imago van de monsters met een super-resolutie fluorescentiemicroscopie, zoals gestructureerde verlichting microscopie (SIM) ¹¹ of stimulated emission depletion (STED) ¹² microscopie.
   OPMERKING: De precieze details van hoe voor te bereiden en het imago samples sterk afhankelijk van de aard van de structuur te bestuderen, zodat de relevante literatuur moet worden geraadpleegd. Als voorbeeld, de precieze werkwijze voor het bereiden en het afbeelden van monsters van vacciniavirus, zoals hier gebruikt, wordt beschreven in de representatieve resultaten sectie.
3. beelden van meervoudige gezichtsvelden dat een groot aantal afzonderlijke exemplaren van de structuur of deeltjes, bij voorkeur duizenden creëren. Afbeelding deeltjes die ook gescheiden zijn van elkaar mogelijk en zorgen ervoor dat de beelden zijn vrij van vuil of andere fluorescerende structuren die niet van belang zijn.
4. Open alle afbeeldingen waarin de deeltjes in Fiji door de bestanden in de werkbalk Fiji te slepen of door het selecteren van "File"> "Open".
5. Selecteer "Beeld"> "Stack"> "Extra"> "Aaneenschakelen" om het samenvoegenafbeeldingen in een enkele stapel. Dan, als het resulterende beeld is een HyperStack, zet hem in een stapel door het selecteren van "Beeld"> "Hyperstacks"> "HyperStack te stapelen".
   OPMERKING: De laatste stapel mag ingelast kanalen. Indien er twee kanalen, zou de eerste plak in de stapel kanaal 1 van het eerste beeld, moet het tweede segment het betreffende kanaal 2, het derde segment moet kanaal 1 van het tweede beeld enzovoort, en worden.

2. Pak de Deeltjes

1. Kies de afbeelding om segment en selecteer "Extract Viral Structures". Kies waar de uitgepakte deeltjes op te slaan en bekijk de "Extract Viral Structures" dialoogvenster (Figuur 2).
2. extractieparameters met een initiële schattingen wijzen door het invoeren van deze in de "Extract Virale Structures" dialoog als volgt. Fine-tunen van deze parameters na de voorvertoning van de afbeelding segmentatie.
   1. Stel de gevoellooser kanalen in de dataset als het aantal verschillende fluorescentiekanalen die zijn afgebeeld (bijvoorbeeld 2).
   2. Stel het referentiekanaal waarvan deeltjes door detectie van pieken in dat kanaal worden geëxtraheerd door het nummer van de kanaalkeuze. Selecteer de meest consistente kanaal; dat wil zeggen het kanaal waarin de deeltjes hetzelfde uiterlijk.
      OPMERKING: Indien mogelijk zullen deeltjes in dit kanaal een centraal maximum hebben.
   3. Kies of om een ​​pre-detectie Gaussiaanse vervaging toe te passen. Stel het voor-detectiesysteem Gaussiaanse vervaging 0 geen vervaging passen; Als deze waarde wordt verhoogd, wordt een Gauss filter vervaging van de gegeven straal aangebracht voordat de plaatselijke maxima detectie. Met deze functie als het referentiekanaal een centrale maximum (bijvoorbeeld ringvorm) heeft; vervaging veroorzaakt de verschijning van één.
      OPMERKING: ingedeeld in regio's van belang (ROI) niet over de Gaussiaanse vervaging op hen van toepassing, aangezien deze functie alleen gebruikd om ROI positie in het referentiekanaal.
   4. Stel de straal ROI (die wordt rondom elke lokale maxima) in pixels. Kies een zodanige waarde dat ROI's zijn iets groter dan de grootste deeltjes, zoals in figuur 3. Bijvoorbeeld, als de grootste deeltjes blijken een diameter van ongeveer 30 pixels (ruw geschat door ogen), vervolgens de straal ROI 20 pixels.
   5. Stel het aantal ROI te gebruiken per frame een eerste, relatief kleine waarde onder 100.
   6. De maximale ROI overlap. Als de deeltjes goed gescheiden blijven deze kleine; Als deeltjes worden geclusterd, verhogen deze de ROI mogelijk overlappen.
3. Selecteer "Show preview".
   Opmerking: Als dit is geselecteerd, zal de geëxtraheerde ROI voor het referentiekanaal in verband met het huidige frame weergegeven.
4. Stel de radius ROI, het aantal ROI en de maximale ROI overlap ROI's zijn van geschikte grootte rond zoveel mogelijk deeltjesZoals in figuur 3.
5. Kies "OK" om de segmentatie te voeren. Sluit het beeld en de ROI manager.
   LET OP: niet de namen van de bestanden van het deeltje sets te wijzigen. Deze namen moeten in het formaat "Virale deeltjes - channelX" voor de volgende paragrafen.

3. Selecteer Seeds

1. Selecteer "Generate Seeds", selecteert u de map waarin de uitgepakte deeltjes worden opgeslagen, en bekijk de dialoog en ramen "Generate Seeds" (figuur 4).
2. Wijs aanvankelijke seed-selectie parameters door het invoeren van hen in het dialoogvenster "Generate Seeds", als volgt.
   1. Stel de referentiekanalen die worden gemonteerd op alle kanalen uit te lijnen en het centrum. Kies een kanaal waarin de meeste deeltjes hetzelfde uiterlijk hebben en die een centraal maximum, indien mogelijk.
   2. Selecteer de vakjes voor alle kanalen waarvoor een zaadje moet worden gegenereerd.
   3. Selecteer deze optie als de zaden rotat zou moeten zijned 90 °. Gebruik deze functie om de uitlijning in overeenstemming met andere modellen hebben
   4. Kies of om een ​​pre-alignment Gaussiaanse vervaging toe te passen. Stel de straal vervaging voor elk kanaal 0 en zonder ruis passen. Verhoog de waarde Gaussiaans vervagen filter van de gegeven straal toepassen voordat herschikking. Gebruik deze functie als de deeltjes niet een centrale maximum te hebben; vervaging veroorzaakt de verschijning van één.
      OPMERKING: Zaden zal niet de toegepaste vervagen, aangezien deze functie alleen om een ​​consistente lijn te krijgen.
   5. Selecteren of verschuiving corrigeren gebruiken afzonderlijk centrum zaden voor niet-referentiekanalen, hoewel ze niet roteren, door het controleren of uit te "Shift correctie" dozen voor elk kanaal.
      OPMERKING: Gebruik deze optie als de kanalen zijn niet goed uitgelijnd met elkaar; Het kan ook nuttig zijn voor het uitlijnen van andere kanalen uitsluitend op basis van de referentie zonder verschuiving correctie.
3. Kies deeltjes te gebruiken als zaden. Doorzoek tHij sequentie deeltje een deeltje dat de structuur die wordt gemodelleerd en noteer het framenummer lijkt te vinden.
4. Voer het nummer in de "Frames te gebruiken" box, en meer vensters verschijnen (Figuur 5). Voer meerdere framenummers gescheiden door komma's.
5. Bekijk het zaad frames en de daaruit voortvloeiende gemiddelde zaden in de vensters die worden weergegeven.
   NB: Het logboek zal voorstellen zaden vergelijkbaar met het gemiddelde.
6. Pas het referentiekanaal, Gaussiaans vervaging radius en de verschuiving correctiemogelijkheden de zaadselectie optimaliseren zodat een aantal zaad frames vond een soortgelijk uiterlijk bezitten. Ga door het toevoegen van zaden tot gemiddeld zaden worden gecreëerd die naar tevredenheid lijken op de structuur te zien in de data die moet worden gemodelleerd.
7. Noem de zaden en waar ze te worden opgeslagen en selecteer "OK" om de laatste zaad beelden voor later gebruik in model generatie op te slaan.

4. Genereer Models

1. SeLECT "Generate modellen, gebaseerd op Seeds", selecteert u de map waarin de uitgepakte deeltjes worden opgeslagen, en bekijk de dialoog "Generate Models" (figuur 6).
2. Laad de kiem voor elk kanaal door het vink.
   OPMERKING: Zaden zal in een submap die werd genoemd in de "Generate Seeds" dialoog worden opgeslagen. De standaard naam is "Analysis". Zorg ervoor dat het zaad Gemiddelden, niet de frames, die ook worden opgeslagen voor referentie selecteren.
3. Wijs de eerste generatie van het model parameters door het invoeren van hen in het dialoogvenster "Generate Models", als volgt. Fine-tunen van deze parameters later.
   1. Selecteer of een referentiekanaal voor het uitlijnen, waarbij translaties en rotaties berekent alleen van het referentiekanaal en past deze toe op alle kanalen. Bij gebruik van deze optie selecteert het kanaal te gebruiken als referentie.
      OPMERKING: Deze optie moet alleen worden gekozen om specifiek gebruik maken van een kanaal als een reference, bijvoorbeeld als doe-referentiegebaseerde structuur ontdekking. Anders zal dit resulteren in minder nauwkeurige modellen. De kanalen moet goed worden afgestemd bij gebruik van deze optie.
   2. Selecteer of image intensiteiten Square tijdens template matching. Dit kleine verschillen accentueren Gebruik dus deze bij het maken van een model dat bijzonder subtiele eigenschappen heeft.
   3. Kies een minimale overeenstemming met zaad met de "Minimum gelijkenis tegen zaad" schuifregelaar of door een getal in het vak.
      OPMERKING: Alleen deeltjes met een gelijkenis met de zaden groter dan dit cut-off zal worden gebruikt. 60-80% is meestal een goede keuze om mee te beginnen.
   4. Het maximum aantal iteraties tot 1, dan dient de minimale overeenstemming met zaden, en later verhogen, zoals vereist.
   5. Selecteer de vakjes om de elementen van de generatie proces model dat zal verschijnen kiezen.
      OPMERKING: "Show zaden" zullen de zaden die met de boxe hebt geüploads aan de top van de dialoog. "Show models" zal alle herhalingen van de modellen die zijn gemaakt op basis van het gemiddelde van de subset van deeltjes die de minimale gelijkenis tegen zaad voldoet aan te geven. "Show MSE" zal het beeld op van een gemiddelde kwadratische fout (MSE) dat de gebieden van het model dat de meest variabele zijn hoogtepunten te geven. "Show deeltjes" zal de subgroep van deeltjes die worden gebruikt om de modellen te maken, geregistreerd volgens de hoogste iteratie van het model dat wordt weergegeven weer te geven.
4. Selecteer "Show preview" om een ​​voorbeeld modellen te genereren en de resultaten te bekijken.
   NB: Dit is de meest rekenintensieve stap van het proces. De looptijd van een reeks van enkele duizenden deeltjes met een diameter van enkele tientallen pixels op een desktop PC moeten circa 10 min. Als rekentijd een probleem is, moeten de gebruikers eerst proberen het algoritme op een kleiner deel van de gegevens of een kleinere ROI straal in stap 2.2.4, indien mogelijk.
5. Bekijk het genererend modellen en optimaliseren van de parameters, met name de minimale gelijkenis tegen zaad. Verhoging van de minimale overeenstemming met zaad tot enige ware deeltjes van het gemodelleerde morfologie worden opgenomen in het model.
6. Verhoging van het maximum aantal iteraties met behulp van de "Maximum aantal iteraties" schuifregelaar of door een getal in het vak en maken het model generatie proces herhalen. Gebruik een waarde rond 10 voor maximale iteratie.
7. Naam modellen en selecteer "OK" om model evolutie stacks dat alle herhalingen van het uiteindelijke model generatie proces bevatten slaan.
   LET OP: Als het minimum gelijkenis tegen zaad is zo hoog dat er geen deeltjes deze overeenkomst, zal er niets worden bijgewerkt. Als de plugin lijkt te worden bevroren, rekening houden met de mogelijkheid dat de minimale gelijkenis is te hoog.

Results

Hier tonen we de software op het model pokkenvirus, vacciniavirus. Eén van de meest complexe zoogdierlijke virussen, vaccinia pakketten ongeveer 80 verschillende eiwitten in een 350 x 270 x 250 ^nm3 baksteen-vormige deeltjes ^{13, 14.} Drie substructuren zijn waarneembaar elektronenmicroscopie: een centrale kern, waarbij het dsDNA-genoom bevat; twee eiwitachtige structuren, genoemd laterale organen, waarbij de kern flankeren; en een proteolipide dubbellaag envelop ^15. De grote omvang, complexe structuur en ontvankelijkheid voor recombinant fluorescent eiwit tagging maken vaccinia een uitstekend systeem voor het VirusMapper workflow tonen.

Gebruik van de software zoals hier beschreven, kan de verdeling van verschillende eiwitten op de vaccinia virion worden gemodelleerd. Een eiwit werd gelabeld en afgebeeld, eventueel in combinatie met een ander eiwit van bekende zoals referentie, en de software werd gebruikt zoals beschreven gemiddelde modellen van de lokalisatie van deze eiwitten op het deeltje. In dit voorbeeld werden twee eiwitten gemodelleerd, de binnenste kerneiwit L4 en hoofdzijwanden lichaamsonderdeel F17.

Een recombinant vaccinia virus dat F17 is gelabeld met GFP en L4 gelabeld met mCherry ¹⁶ werd toegepast. Gezuiverd virus werd verdund in 1 mM Tris, pH 9 en gebonden aan gewassen, high-performance dekglaasjes door ze te bekleden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. De monsters werden vervolgens gefixeerd door toepassing van 4% formaldehyde in PBS gedurende 20 min. Dekglaasjes direct op objectglaasjes in antifade fixeermiddel geplaatst. Beeldvorming werd uitgevoerd door SIM op een commerciële SIM-microscoop uitgevoerd. Een gezichtsveld geselecteerd met honderden virussen en afbeeldingen werden verkregen met behulp van 5 faseverschuivingen en 3 rooster rotaties bij 561 nm (32 urn rooster peRIOD) en 488 nm (32 urn rasterperiode) lasers. Beelden werden verkregen met behulp van een sCMOS camera en verwerkt met behulp van de microscoop software. Kanalen werden uitgelijnd op basis van een multi-gekleurde kralen dia afgebeeld met dezelfde afbeelding overname instellingen. Na SIM reconstructie en kanaal uitlijning afbeeldingen geopend in Fiji en samengevoegd in een enkel beeld stapel.

Virale deeltjes werden uit de beelden met de L4 kanaal als de referentie en zonder dat enige Gaussian blur, omdat deze deeltjes een centraal maximum. Rond 15.000 deeltjes werden geëxtraheerd in dit experiment.

Vanwege de geometrie van vaccinia, de zijdelingse lichamen een duidelijk ander uiterlijk gebaseerd op het virus oriëntatie. We gevisualiseerd twee oriëntaties, waarin een of twee laterale lichamen konden worden onderscheiden. We verwezen naar deze richtsnoeren als frontale en sagittale, respectively.

Aparte zaden voor de frontale en sagittale oriëntaties werden geselecteerd door te zoeken door de lijst deeltje op de "Generate Seeds" stage (figuren 4 en 5); deeltjes die duidelijk in één richting zijn of andere gekozen. De L4-kanaal werd gebruikt als het referentiekanaal naar de zaden elkaar uitlijnen. Opnieuw, geen Gaussian blur noodzakelijk. 5 deeltjes per oriëntatie werden geselecteerd en werden gemiddeld om de zaden te produceren.

Modellen werden gegenereerd voor elke oriëntatie op basis van deze zaden. Noch een referentiekanaal of gekwadrateerde intensiteitswaarden gebruikt. Het maximum aantal iteraties is aanvankelijk ingesteld op 1, en de minimale gelijkenis werd ingesteld op ongeveer 1000 deeltjes telkens met een consistente uitstraling voor elke oriëntatie gaf omvatten. Het maximum aantal iteraties werd vervolgens verhoogd totzorgen voor de convergentie van het model. Modellen werden aldus gegenereerd voor de twee richtingen in de twee kanalen (figuur 7).

Figuur 1: VirusMapper workflow. De plugin is georganiseerd in drie grote fasen. Virusdeeltjes worden uit grote afbeeldingen worden sjabloonafbeeldingen of zaden semi-handmatig gekozen uit de data en de uiteindelijke SPA modellen worden gegenereerd uit de data door te verwijzen naar de zaden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: "Extract Viral Structures" dialoog. Bij het selecteren van "Extract Viral Structur es", zal dit dialoogvenster verschijnen. De parameters moeten worden gevuld met de eerste ramingen voor een optimale segmentatie. 'Show preview' kan dan worden gekozen, waardoor de ROI te worden bekeken en de parameters te worden verfijnd. Klik hier om te bekijken grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: extractieparameters instellen. Na voorvertoning van de ROI die wordt geëxtraheerd, de straal ROI, aantal ROI en maximale overlap ROI worden aangepast om zo'n situatie te bereiken. ROI's zijn iets groter dan de deeltjes, alle deeltjes worden opgenomen in een ROI, en ROI kan voldoende overlappen om gegroepeerde deeltjes te scheiden.ank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Het genereren van template matching zaden. Het dialoogvenster "Generate Seeds" (1) worden de parameters moet worden toegewezen. De referentie sequentie deeltjes (2) kan de gebruiker scan door deeltjes in het referentiekanaal. Wanneer een deeltje wordt gezien in de referentie sequentie deeltjes, kunnen deeltjes uitgelijnd voor alle kanalen worden gezien in de voorbeelden uitgelijnd deeltje (3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Het toevoegen van zaad afbeeldingen. Als zaden worden toegevoegd aan de box "Frames te gebruiken", het gemiddelde van alle zaden (4) en de frames die betrokken zijn (5) worden weergegeven. Deeltjes die vergelijkbaar is met de huidige gemiddelde zaden worden voorgesteld in het dialoogvenster (6). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: "Generate Models" dialoog. Bij het selecteren van "Genereer modellen op basis van zaden," dit dialoogvenster verschijnt. De parameters worden gevuld met een initiële schattingen voor optimale model genereren, en de elementen van het model generatie procedure tijdens berekening getoond worden geselecteerd. "Show preview" kan dan worden gekozen, waardoor het model generatie proces om te draaien en de parameters te worden verfijnd.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7: Modellen gemaakt met VirusMapper. Vaccinia virions met L4 kerneiwit gelabeld met mCherry en F17 zijlichaam eiwit gelabeld met EGFP werden afgebeeld met behulp SIM. Modellen werden vervolgens gegenereerd met de software, zoals beschreven in het protocol. Twee oriëntaties, frontaal en sagittaal, onderscheiden zich door het verschijnen van de zijdelingse lichamen. Schaal bar = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Met deze methode, zijn onderzoekers uitgerust om de macht van de SPA en SR microscopie te combineren om hoge precisie, multi-channel 2D-modellen van het eiwit architectuur van virussen en andere macromoleculaire complexen te genereren. Er moet echter een aantal belangrijke overwegingen rekening worden gehouden.

Zaden moeten worden gekozen om een ​​structuur die consistent gezien vertegenwoordigen. Daarom moet de ruwe gegevens worden zorgvuldig geïnspecteerd voordat de zaden worden gekozen. Dit is van belang voor het voorkomen van bevooroordeeld modellen. Keuzes kunnen worden gevalideerd door het onderzoek van de minimale gelijkenis drempels nodig is om een ​​bepaald aantal deeltjes in de modellen zijn. Duidelijk voor gekozen zaaizaad, hoe hoger deze drempel moet zijn voor een bepaald aantal deeltjes, hoe meer structuur blijkt uit de gegevens.

De template matching concept is vooral handig wanneer er heterogeniteit in de gegevens. Alle verschillende structuren die vi zijnlijk moeten worden geïdentificeerd en verschillende modellen gemaakt voor elke zaak. Door het scheiden van heterogene structuren uit een kanaal tegelijk maken van modellen in een tweede kanaal, kunnen patronen ontstaan ​​die niet onmiddellijk zichtbaar zijn.

Een andere overweging te nemen bij het gebruik van dit algoritme is dat de procedure iteratie stochastische asymmetrie maximaliseert. Bijvoorbeeld, bij het modelleren van een structuur met twee symmetrische maxima, alle geringe asymmetrie tussen de maxima worden uitgelijnd met elkaar tijdens het iteratie, en het uiteindelijke model zullen dus maximaal asymmetrisch zijn. Als dit geeft niet bekende symmetrie in de structuur te modelleren, dan moet rekening worden gehouden. Momenteel is de enige manier om dit te vermijden is maximalisatie het aantal iteraties beperken tot 1, hoewel een mogelijke ontwikkeling zou zijn VirusMapper aan symmetrieassen nemen in het model generatieproces. Elke nieuwe versies van VirusMapper zal zijn beschiketiket op het gerefereerde website (zie Materials Table). Gebruikers zullen ook een FAQ vinden hier een gemeenschappelijke vragen te beantwoorden.

De software zoals beschreven is toepasbaar op elke structuur die kan worden afgebeeld met voldoende resolutie om de functies die de gebruiker wenst te modelleren visualiseren. Hoewel SPA resolutie kan verbeteren, zal het duidelijk niet het verbeteren van de zichtbaarheid van functies die anders niet zichtbaar zijn. Dit protocol is dus niet een werkwijze om de kwaliteit van de gegevens te verbeteren. Zoals met elke techniek, zorgvuldige monstervoorbereiding en optimalisatie van beeldvormende strategie zal de schoonste gegevens en de beste resulterende modellen bieden.

De keuze van SR beeldvormingstechniek is ook belangrijk en in het algemeen zal afhangen van het monster bij de hand. VirusMapper is gevalideerd voor gebruik met de SIM-kaart en STED ^10, en het kan ook gebruikt worden met een hoge kwaliteit localisatie microscopie gegevens, maar zorg moeten worden genomen in dit geval,als luchtige herkenbaarheid kan problemen vergelijkbaar met die van asymmetrie maximalisatie veroorzaken.

Momenteel, VirusMapper de enige vrij beschikbaar algoritme voor de enkelvoudige deeltjes analyse van fluorescentiebeelden en enige algemene doeleinden 2D SPA middeling software. Andere studies die gebruik maken van dezelfde principes ^{4, 6} hebben ^gemaakt, hebben ⁸ aangepaste software gespecialiseerd voor ieder afzonderlijk onderzoek gebruikt. Algemene doeleinden algoritmen voor de reconstructie van 3D data zijn gepubliceerd ^{5, 18,} hoewel er geen software is verstrekt.

Wanneer gebruikt zoals beschreven in dit artikel, kan VirusMapper worden gebruikt om precieze, nauwkeurige en robuuste modellen van de macromoleculaire eiwit architectuur van virussen en andere complexen te produceren. Met deze modellen kunnen onderzoekers nauwkeurige metingen van de gemiddelde afmetingen van de structuur te nemengelen onder studie, mogelijk waardoor ze biologische conclusies die zou hebben anders niet mogelijk geweest te bereiken.

Verder met de meervoudige kanalen van deze techniek is het mogelijk om een ​​ongelimiteerd aantal eiwitten en complexen componenten in kaart te brengen en nieuwe proteïne organisatie ontdekken. Het onderzoeken van veranderingen in de nanoschaal structuur in verschillende biologisch relevante omstandigheden, zoals de verschillende fasen van een levenscyclus van het virus, heeft het potentieel om waardevolle inzichten geven in de biologie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji			Open-source image analysis software
NanoJ-VirusMapper	developed by the Henriques lab		Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)
VectaShield antifade mounting medium	Vector Labs	H-100
Elyra PS1	Zeiss
ZEN BLACK	Zeiss		Image processing software for SIM
High performance coverslip	Zeiss	474030-9000-000
TetraSpeck beads	ThermoFisher	T7279