Een op maat HPLC Zuivering Protocol dat zijn vruchten High-zuiverheid Amyloïd Beta 42 en Amyloid Beta 40 Peptiden, in staat oligomeervorming

Samenvatting

Hierin beschrijven we een speciaal HPLC zuiveringsprotocol hoogzuivere amyloïde beta 42 (Aß42) en amyloïde beta 40 (Aβ40) peptiden, kunnen oligomeervorming oplevert. Amyloid beta is een zeer gevoelig aggregatie, hydrofoob peptide betrokken bij de ziekte van Alzheimer. De amyloidogenic aard van het peptide maakt de zuivering ervan een uitdaging.

Samenvatting

Amyloidogene peptiden zoals het bij Alzheimer gerelateerde Amyloid beta (Aβ), kunnen een belangrijke uitdaging vormen bij het proberen om materiaal met hoge zuiverheid te verkrijgen. Hier presenteren we een op maat gemaakt HPLC-zuiveringsprotocol om hoogzuiverheid amyloid beta 42 (Aβ42) en amyloid beta 40 (Aβ40) peptiden te produceren. We hebben gevonden dat de combinatie van commercieel verkrijgbare hydrofobe poly(styreen/divinylbenzeen) stationaire fase, polymeer laboratorium omgekeerde fase - styreendivinylbenzeen (PLRP-S) onder hoge pH-condities, het mogelijk maakt om hoge zuiverheid (>95%) Aβ42 te bereiken in een enkele chromatografische run. De zuivering is zeer reproduceerbaar en kan worden aangepast aan zowel semi-preparatieve als analytische omstandigheden, afhankelijk van de hoeveelheid materiaal die gewenst is om te zuiveren. Het protocol kan ook worden toegepast op het Aβ40 peptide met identieke succes en zonder de noodzaak om de methode te wijzigen.

Inleiding

De ziekte van Alzheimer is een neurodegeneratieve aandoening die wereldwijd gevolgen meer dan 35 miljoen mensen. ¹ sterk Betrokken bij het ontstaan en de ontwikkeling van de ziekte, is het zeer gevoelig aggregatie, hydrofoob peptide Amyloid beta (Aß). ² Aß varieert 36-43 aminozuren lang, echter, wordt gedacht dat de 42-aminozuur variant amyloïde beta 42 (Aß42), is de meest giftige vorm van het eiwit. ³ Dit heeft in hoofdzaak het vermogen van Aß42 gemakkelijk vormen diffundeerbare, oligomere species die geacht worden bijzonder neurotoxische entiteiten. ⁴ Om ons begrip van het Ap-peptide te bevorderen, is het essentieel om routinematig bekomen hoge zuiverheid materiaal. De aanwezigheid van sporen verontreinigingen is aangetoond dat drastisch veranderen de aggregatie neiging eigenschappen van het peptide. ⁵

Traditionally, heeft de hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) scheiding van hydrofobe peptiden zoals Aß gedaan door het gebruik van een combinatie van C ₄ of _C-8 silica gebaseerde vaste fasen en een zure mobiele fase. ⁶ kan evenwel omstandigheden een uitdaging voor de zuivering van het peptide. De lage isoelektrische punt van het Aß peptide (pI ongeveer 5,5) ⁷ betekent dat onder zure omstandigheden, peptide aggregatie verhoogd en daardoor breed, niet opgeloste HPLC pieken die vaak moeilijk te isoleren zijn geproduceerd (Figuur 2A). Bovendien is een dergelijke brede pieken bevatten vaak verontreinigingen die de aggregatie profiel van het peptide van invloed kunnen zijn, en vaak vereisen daaropvolgende ronden van zuivering die dramatisch kan invloed hebben op de hoeveelheid peptide geproduceerd.

De poly (styreen / divinylbenzeen) stationaire fase PLRP-S, vertegenwoordigt een alternatieve purifying hydrofobe peptiden. De stationaire fase is gebruikt bij de zuivering van een aantal verschillende eiwitten en messenger ribonucleïnezuren (mRNA). ^{8, 9} De PLRP-S stationaire fase vereist geen extra alkyl ligand voor omgekeerde fasescheiding en vooral chemisch stabiel is bij hoge pH die leidt tot disaggregatie van het peptide. ⁷ Hierin vermelden wij een op maat gesneden HPLC zuivering protocol dat hoge zuiverheid amyloïde beta 42 (Aß42) en amyloïde beta 40 (Aβ40) peptiden oplevert.

Protocol

1. Preparatieve HPLC Zuivering van de Aβ40 of Aß42 Peptide

1. Bereid de volgende buffers voor HPLC zuivering.
   1. Bereid buffer A (20 mM NH ₄ OH) door toevoeging van 1,3 ml _NH4OH (28% oplossing) tot 1000 ml ultrazuiver water.
   2. Bereid buffer B (80% acetonitril met 20 mM NH ₄ OH) door toevoeging van 1,3 ml _NH4OH (28% oplossing) aan een oplossing van 800 ml HPLC kwaliteit acetonitril en 200 ml ultrazuiver water.
   3. Bereid monster buffer oplossing (0,1% _NH4OH) door toevoeging van 100 ul van _NH4OH (28% oplossing) tot 100 ml ultrazuiver water.
2. Stel de HPLC instrument zoals getoond in figuur 1.
   1. Breng het oplosmiddel flessen die bevatten buffer A en buffer B om de inlaten van de HPLC-pomp met behulp van polymeer leidingen. Bevestig het polymeer slang aan de HPLC-pomp met een eendelige fitting. Zorg ervoor dat het polymeer buis vanelke buffer wordt aan de juiste inlaatklep van het instrument. Monteer de HPLC-pomp met een ontgasser.
   2. Stel de HPLC-pomp met de inlaat van de 300 Å 8 urn 25 mm х 300 mm preparatieve kolom (Figuur 1B, kolom aan de linkerkant, zie Materialen List) gebruikt polymeer buis.
      1. Bevestig het polymeer slang aan op de preparatieve kolom met een uit één stuk vinger strak. Zorgen dat het polymeer kolom is georiënteerd op de juiste wijze.
         OPMERKING: De stationaire fase van de preparatieve kolom bestaat uit poly (styreen-divinylbenzeen) deeltjes. De correcte oriëntatie van het polymeer kolom wordt aangegeven op de buitenmantel met een richtingspijl.
   3. Sluit de uitlaat van de kolom aan de dubbele golflengte detector gebruikt polymeer buis en de detectorgolflengte tot 214 nm en 280 nm.
      1. Wijzig de golflengte door verandering van de detectiegolflengte parameters in het setup instrumentmethode keuze van deingebouwde HPLC software.
   4. Bevestig het polymeer slang aan op de inlaat van de golflengte detector met een uit één stuk vinger strak. Hechten polymeer slang aan de uitgang van de klep golflengte detector. Bevestig het polymeer slang aan op de uitlaat klep van de HPLC-detector met een uit één stuk vinger strak. Dit zal de monstername slang zijn.
      Opmerking: Het ontbreken van een sterke chromofoor op het Aß peptide dat dicteert 214 nm worden gebruikt als het voornaamste ultraviolet (UV) golflengte van maximale verzamelen.

Figuur 1: Experimentele opstelling van de HPLC instrument gebruikt voor de zuivering van de amyloïde beta peptide. (A) De quaternaire HPLC-pomp voorzien van een ontgasser en variabele golflengte detector ingesteld op 214 nm en 280 nm; (B) HPLC-kolommen voor zuivering van de amyloïde beta peptide, uitlinks naar rechts, 25 x 300 mm ² preparatieve kolom, 7,5 x 300 mm semi preparatieve kolom ² en 4,6 x 250 mm analytische kolom ^2; (C) handmatige injector met 20 pl roestvrijstalen injectieblok gebruikt voor analytische HPLC; (D) Handmatig injector met 10 ml roestvrijstalen injectieblok gebruikt voor preparatieve en semi preparatieve zuivering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Programmeer de HPLC software om de zuiveringswerkwijze in werking zoals getoond in tabel 1. Voer de zuiveringswerkwijze door het veranderen van het oplosmiddel tijdschema parameter (in het setup instrument-optie ingebouwd in de software HPLC). Schakel de HPLC-pomp door te klikken op de "aan" knop op de HPLC-software.
   OPMERKING: De pomp begint toevoeren uitgangsverhouding van buffer A en buffer B tot de preparative kolom en HPLC instrument.
   1. Laat het systeem gedurende 30 minuten volledig evenwicht.

Time / min	% Buffer A een	% Van de buffer B b	Flow Rate d / ml min -1
0	80	20	6
45	75.5	24.5	6
45.01	80	20	6
52.01	80	20	6
52.02	73	27	6
85	73	27	6
92	5	95 c	6

Tabel 1: Tijdschema voor de zuivering van het Aß42 en Aβ40 peptiden met de polymeer mm kolom 25 x 300. ^a Buffer A - H ₂ O met 20 mM NH ₄ OH; ^b 80% MeCN / 20% _H2O met 20 mM NH ₄ OH; ^c Ran gedurende 15 min op de kolom vóór de volgende injectie van het monster was; ^d Om een stroomsnelheid van 6 ml / min op HPLC instrumentatie werking, de drukgrens moet worden verlaagd tot 200 bar.

4. Zuivering van het Aß peptide monster
   Opmerking: Het ruwe peptide werd verkregen door geautomatiseerde vaste-fase peptidesynthese. ¹⁰
   1. Los 3 mg ruw Ap peptide in 4 mL van het monster ontbinding buffer. Sonificeer het monster gedurende 30-60 s bij kamertemperatuur en bij een frequentie van 40 kHz tot oplossen te bevorderen.
   2. Injecteer het gehele monster op de HPLC-kolom met een 5 ml plastic spuit uitgerust met een 16-gaugeroestvrijstalen naald. Run de zuiveringsmethode zoals beschreven in deelstap 1,3.
      Opmerking: Het systeem kan monsterinjectie gebeuren door middel van een handmatige injector voorzien van een 10 ml roestvrijstalen injectieblok (figuur 1D). De gewenste AP-peptide zullen elueren tussen 72 en 74 min als een scherpe piek opgelost (figuur 2C).
   3. Verzamel het monster in een 50 ml conische centrifugebuis. Bevestigen de identiteit van het Ap piek door middel van directe injectie massaspectrometrie van de verzamelde eluens. ¹¹ Store het elutiemiddel tot 12 uur bij -20 ° C.
      OPMERKING: Bewaren van de oplossing gedurende een periode langer dan 12 uur wordt afgeraden vanwege de mogelijkheid van oxydatie van het peptide.
   4. Isoleer het gezuiverde peptide door Snelkoeling de verzamelde hoeveelheid / hoeveelheden van het Ap peptide in vloeibare stikstof en Lyophilize. Lyofilisatie uitvoeren door vriesdrogen van het monster bij een temperatuur van -60 ° C en een drukzeker van 20 mTorr gedurende 24 uur.
   5. Voer het analytische HPLC protocol zoals hieronder beschreven om de zuiverheid van het Aß peptide te bepalen. WINKEL peptiden in de gevriesdroogde vorm bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden.

2. Analytische HPLC analyse van het gezuiverde eiwit Aß

1. Bereid de HPLC buffers zoals beschreven in paragraaf 1.1. van het bovengenoemde protocol.
2. Stel de analytische HPLC volgens stap 1.2.1 en zoals in figuur 1 met de 4,6 x 250 mm analytische kolom (Figuur 1B, meest rechtse kolom) en de handmatige injector 20 pl roestvrijstalen injectieblok (figuur 1C) gemonteerd op de instrument.
3. Programmeer de HPLC software om de analysemethode werking zoals weergegeven in tabel 2 volgende instructies overeen met die in stap 1,3.

Time /min	% Buffer A een	% Van de buffer B b	Debiet / ml min -1
0	95	5	1
30	50	50	1

Tabel 2: Tijdschema voor de HPLC-zuiverheid analyse van het Aß peptide. ^a Buffer A - H ₂ O met 20 mM NH ₄ OH; ^b 80% MeCN / 20% _H2O met 20 mM NH ₄ OH.

4. Zuiverheidsanalyse van het Aß peptide
   1. Maak een 1 mg / ml oplossing van het gezuiverde peptide door middel van ontbinding van het peptide in het monster bufferoplossing.
      LET OP: De buffer recept is te vinden in paragraaf 1.1. De eiwitconcentratie wordt bepaald door de proteïne absorptie bij 280 nm _{(280 nm} A). ¹² m Olar extinctiecoëfficiënt (ε) wordt gebruikt om de concentratie te bepalen is ε = 1.490 ^dm3 mol ^-1 cm ^{-1. 13}
   2. Injecteer 20 pi van de oplossing 1 mg / ml (222 pM) op de HPLC-kolom en voer de analysemethode die ingesteld in stap 2,3 was.
      OPMERKING: De overblijvende oplossing niet gebruikt voor analyse kunnen worden flash bevroren in vloeibare stikstof en gevriesdroogd om het Ap-peptide te herstellen. Vriesdrogen details zijn te vinden in paragraaf 1.4.4. Het Ap peptide elueren uit de analytische kolom tussen 16 en 18 min (figuur 2D). Gebruik de ingebouwde integratie analysesoftware dat de HPLC instrument om de zuiverheid van het Aß peptide te bepalen begeleidt. Zuiverheid wordt bepaald door integratie van elk van de afzonderlijke pieken in het spectrum en de berekening van peptide-piek percentage area. Gewoonlijk moet een zuivering van> 95% worden vastgesteld.

"Figuur 2" src = "/ files / ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg" />
Figuur 2: Representatieve HPLC sporen van AB42. (A) Traditionele C ₄ silica zuivering omstandigheden: Buffer A: _H2O met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA), buffer B: MeCN (acetonitril) met 0,1% TFA, gradiënt: 20-27% buffer B gedurende 40 min gevolgd isocratisch met 27% buffer B; (B) Preparatieve zuivering met gebruik van de 25 x 300 mm ² polymeer kolom omstandigheden: Buffer A: H ₂ O met 20 mM NH ₄ OH, buffer B: 80% MeCN / 20% _H2O met 20 mM NH ₄ OH, gradiënt : 20 tot 27% buffer B gedurende 70 min gevolgd door isocratisch 27% buffer B; (C) Optimized preparatieve zuivering met behulp van de 25 x 300 mm ² polymeer kolom, worden de voorwaarden beschreven in tabel 1 in paragraaf 1.3 van het protocol beschrijvende tekst; (D) Analytische HPLC gebruikmakend van de 4,6 x 250 mm kolom ² polymeer, conditions: Buffer A: H ₂ O met 20 mM NH ₄ OH, buffer B: 80% MeCN / 20% _H2O met 20 mM NH ₄ OH, gradiënt 5-50% buffer B gedurende 30 min. Voor delen A, B en C de piek AB42 is gemarkeerd met een sterretje. Verzameling van de gemarkeerde Aß42 piek gedeeltelijk C toont een zuiverheid van> 95% zoals getoond in deel D Massaspectrometrie werd gebruikt om de identiteit van de AB42 piek te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

De zuivering van de Aß42-peptide met een combinatie van de PLRP-S stationaire fase en een hoge pH mobiele fase resulteert in de vorming van een scherpe, opgelost piek voor het Aß-peptide bij een verblijftijd tussen 72 en 74 min (figuur 2C). Bevestiging van de identiteit van de piek wordt gedaan door middel van directe injectie massaspectrometrie van de verzamelde eluens. Het eluens kan worden opgeslagen bij -20 ° C in oplossing tot 12 uur. Langere opslag kan leiden tot o...

Discussie

De HPLC zuivering van het Aß peptide hangt sterk af van de keuze van zowel de stationaire fase in de zuivering en de mobiele fase gekozen om het peptide te elueren. De lage isoelektrische punt van het peptide en hoge neiging tot aggregatie render traditionele chromatografische omstandigheden voor de scheiding van hydrofobe eiwitten (C4 en C8 stationaire fase in combinatie met een zuur mobiele eluens) uitdagend, met het Aß peptide geëlueerd als een verlengde breed, niet-opgelost piek (Figuur 2A).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump	Agilent	G7111B	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector	Agilent	G7114A	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop	Agilent	0101-1232	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop	Agilent	G1328C	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket	Agilent	1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical)	Agilent	PL1512-5501	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide			Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution)	Fisher Scientific	A669-500
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea	Sigma-Aldrich	Z227250
Normject 5 cc sterile syringe	Fisher Scientific	1481729
16 Gauge SS Needle	Rheodyne	3725-086