Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo's to Cell Nonautonomous Invloeden Studie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De genetische en technische troeven hebben de zebravis gewervelde een belangrijk modelorganisme waarin de gevolgen van gen-manipulaties kunnen worden getraceerd in vivo gedurende de snelle ontwikkelingsperiode gemaakt. Meerdere processen kunnen worden onderzocht waaronder celproliferatie, genexpressie, celmigratie en morfogenese. Belangrijk, kan het genereren van chimeren door middel transplantaties gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor mozaïek etikettering en volgen van individuele cellen onder invloed van de nieuwe omgeving. Bijvoorbeeld, door het combineren functioneel gen manipulaties van de ontvangende embryo (bijvoorbeeld door micro-injectie morfolino) en levende beeldvorming, de effecten van extrinsieke signalen nonautonomous cellen (aangeleverd door de genetisch gemodificeerde milieu) individuele getransplanteerde donor cellen kan worden geëvalueerd. Hier laten we zien hoe deze aanpak wordt gebruikt om het begin van fluorescerende transgenexpressie vergelijken als proxy voor de timing die het lot determinatie in verschillende genetische host-omgevingen.
In dit artikel geven we het protocol voor microinjecting zebravis embryo's donorcellen te markeren en te-gen knock-down in gastheer embryo's, een beschrijving van de transplantatie techniek die wordt gebruikt om chimere embryo's te genereren, en het protocol voor de voorbereiding en uitvoering in vivo time-lapse confocale veroorzaken beeldvorming van meerdere embryo. Vooral uitvoeren op meerdere beeldvorming is cruciaal bij het vergelijken van de timing van gebeurtenissen zoals het ontstaan van genexpressie. Dit vereist het verzamelen van gegevens uit meerdere controle en experimentele embryo's tegelijk verwerkt. Een dergelijke benadering kan eenvoudig worden uitgebreid voor onderzoek extrinsieke invloeden in een orgaan of weefsel van keuze toegankelijke imaging leven, mits transplantaties gemakkelijk kunnen worden gericht volgens de gevestigde embryonale lot kaarten.
Inleiding
De mogelijkheid om belangrijke ontwikkelingsprocessen in een in vivo vertebrate visualiseren heeft bijgedragen dat de zebravis een belangrijk model voor de studie van normale en zieke omstandigheden (besproken in 1, 2). Vooral de neurale retina is een toegankelijk deel van het centrale zenuwstelsel. Het netvlies leent zich gemakkelijk studies van neurogenese voeren vanwege de goed georganiseerde, maar relatief eenvoudige structuur en zijn sterk geconserveerd neuron types in gewervelde species 3. Dynamiek van cellulaire gedrag zoals proliferatie, celcyclus exit asymmetris....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden overeenkomstig de bepalingen van de Australische National Health en Medical Research Council gedragscode voor de verzorging en het gebruik van dieren uitgevoerd en werden goedgekeurd door de institutionele ethische comités.
1. Voorbereiding van de zebravis
- Volwassen vissen pairing
- Opgezet volwassen vissen als paren (of twee paren) in de juiste maat kweekbakken de avond vóór gebruik.
- Het vrouwelijke gescheiden van de mannelijke houden gebruiken een verdeler om de vissen in staat om te zien, maar elkaar niet raken.
- In de ochtend, na het inschakelen van het licht, verwijder de ve....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit werk geeft een experimentele protocol om veranderingen in genexpressie timing beoordelen wanneer wild type netvlies voorouders ontwikkelen binnen een morphant gastheer embryo. De experimentele gastheer embryo's Ptf1a morphants, die de tussenliggende geboren horizontale en amacrine interneuronen van het netvlies 7, 26 missen. Deze werden vergeleken gastheer embryo's die waren geïnjecteerd met een standaard controle mor.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Inzicht in de mate waarin naburige cellen beïnvloeden timing van de expressie van cruciaal lot van de cel bepalend is essentieel als doel efficiënt instrueren embryonale of geïnduceerde multipotente stamcellen te differentiëren in een bepaalde post-mitotische celtype of weefsel patroon. Het bestuderen deze moleculaire gebeurtenissen in de ontwikkeling van cellen van de levende dieren verschaft bovendien relevante dynamische (temporele en ruimtelijke) gegevens over de specifieke cellulaire contexten gerelateerd aan deze .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een ARC DECRA aan PRJ (DE120101311) en door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onderzoek subsidie op LP (PO 1440 / 1-1). De Australische Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door fondsen van de staat regering van Victoria en de Australische federale regering. Wij erkennen Dr Jeremy Ng Chi Kei, die experimenten hier beschreven, zoals gepubliceerd in Kei et al uitgevoerd. , 2016. We zijn dankbaar voor de bepalingen van transgene vis uit Prof. Higashijima en dank Profs. Turner en Rupp voor de levering van de pCS2 + plasmide en Dr. Wilkinson voor het genereren van H2B-RFP en H2A-GFP constructen. Wij danken Fish....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Agarose gecoate schalen kunnen een paar dagen van tevoren worden voorbereid, afgesloten met parafilm om uitdrogen te voorkomen en bewaard worden bij 4 °C |
| Agarose low melt | Sigma | A9414-100G | Kan in groter volume worden voorbereid, in de magnetron worden verwarmd om te vloeibaar te maken en vervolgens gesmolten worden gehouden in een 40 °C waterbad. 1 mL aliquots kunnen worden voorbereid (één voor elke groep embryo's die worden gemonteerd). |
| borosilicaat glas capillairbuis zonder filament | SDR Scientific | 30-0035 | alternatieven met vergelijkbare diameter kunnen worden gebruikt |
| borosilicaat glas capillairbuis met filament | SDR Scientific | 30-0038 | alternatieven met vergelijkbare diameter kunnen worden gebruikt |
| glas petrischalen (60 mm diameter) | Science Supply | 1070506 | elke glazen alternatief van elke maat |
| Injectiebuis (2 m) | Eppendorf | 524616004 | Dit verbindt de naaldhouder met de spuit tijdens transplantatie |
| Microinjectievorm (kunststof mal met wigvormige uitsteeksels) | Adaptive Science Tools | PT-1 | alternatieven met vergelijkbare vorm kunnen worden gebruikt |
| micronaaldhouder | Narishige | M-152 | elke alternatief dat past bij de buitendiameter van de injectienaalden kan worden gebruikt |
| microinjector | Narishige of Eppendorf Femtojet | Pneumatische injector die gasdruk gebruikt | |
| micromanipulator | Coherent Scientific | M330IR | vergelijkbare alternatieven kunnen worden gebruikt |
| microloader tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Mineralolie | Sigma | M5904-500ML | |
| naaldtrekker | Sutter Instruments | Model P-2000 | Instellingen gebruikt voor deze trekker zijn: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Elke naaldtrekker kan worden gebruikt als deze resulteert in een geschikte tipafmeting |
| Parafilm | Interpath | PM996 | elke paraffine film |
| Pasteur pijpje plastic | Samco Scientific | 202 | |
| Pasteur pijpje glas | Hirschmann Laborgeräte | 9260101 | |
| Pronase | Sigma | P5942-25MG | Protease Type XIV |
| N-fenyl thioureum | Sigma | P7629-25G | PTU is giftig en kan worden bereid als een stockoplossing om frequente blootstelling aan het poeder te vermijden, raadpleeg MSDS voor aankoop/gebruik. |
| Qiaquick gel extractie | Qiagen | 28704 | elke alternatieven om DNA te zuiveren kunnen worden gebruikt |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | elke alternatieven om RNA te zuiveren kunnen worden gebruikt |
| SP6 mMessage kit | Qiagen | AM1340 | elke alternatieven om DNA te transcriberen met behulp van SP6 |
Referenties
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO pra....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
