Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Proteïne kinasen zijn in staat om grote cellulaire veranderingen te regelen in reactie op complexe arrays van stimuli, en veel inspanning is gericht op het onthullen van allosterische details van hun regulering. Kinases omvatten signaleringsnetwerken waarvan de gebreken vaak kenmerken van meerdere vormen van kanker en aanverwante ziekten, waardoor een assayplatform wordt gemaakt dat manipulatie van stroomopwaartse regulerende factoren kan manipuleren en validatie van reactievereisten die kritisch zijn bij het zoeken naar verbeterde therapeutica. Hier beschrijven we een basische kinase-analyse die gemakkelijk kan worden aangepast om specifieke experimentele vragen aan te passen, waaronder maar niet beperkt tot het testen van de effecten van biochemische en farmacologische middelen, genetische manipulaties zoals mutatie en deletie, evenals celcultuuromstandigheden en behandelingen om te probeeren Cel signalering mechanismen. Deze analyse maakt gebruik van radiomerkte [γ-32P] ATP, waarmee kwantitatieve vergelijkingen en duidelijke visualisatie van resultaten mogelijk zijnIngevuld voor gebruik met immunoprecipitated of recombinant kinase, specifieke of typische substraten, over een breed scala van reactieomstandigheden.
Inleiding
Proteïne kinasen zijn geavanceerde enzymen die kritiek zijn voor de transmissie van cellulaire signalen in passende responsen 1 . Gezien hun rol in het behoud van homeostase en het voorkomen of bevorderen van ziektestaten 2 , zijn biochemische methoden voor het beoordelen van kinase-activiteit nog steeds krachtige instrumenten om de details van eukaryotische signalering 3 te definiëren. Hoewel strategieën die fosfo-specifieke antilichamen gebruiken, zeer informatief zijn in termen van het meten van de effecten van verschillende behandelingsomstandigheden op cel signaleringsstatus 4 , kan een kinase-analyse de effecten van verschillende behandelingsomstandigheden rechtstreeks meten aan de enzymatische activiteit van een kinase van interesseren. Hoewel er verschillende opties zijn voor vergelijkbare analyses die geen radioactieve materialen gebruiken 5 , blijven we vertrouwen op deze methode voor een robuuste kwantificering van de resultaten. ErZijn twee typische toepassingen van deze test, beide waardevol om verschillende redenen: de immunoprecipitated (IP) kinase assay ( Figuur 1 ) en de recombinant proteïne kinase assay ( Figuur 2 ).
De IP-kinase-analyse is enorm nuttig voor het identificeren van factoren die in staat zijn specifieke proteïne kinasen te activeren, evenals het meten van remmende remmende behandelingsomstandigheden. In het kort wordt een epitoopgemerkte kinase van belang getransfecteerd in gekweekte eukaryote cellen, onderworpen aan een verscheidenheid aan behandelingen, immunoprecipitated, en geanalyseerd voor het vermogen om radioactief gemerkte fosfaat in een model substraat ( bv. Myelin basis eiwit (MBP)) op te nemen. IP-kinase-analyse kan ook worden uitgevoerd zonder overexpressie toe te passen, hetzij door immunoprecipitatie van endogeen eiwit of een aantal genoom-bewerkende technieken. Omdat behandelingen in cultuur worden toegediend, kan deze methode stimulaties detecteren die door meerdere upstream-factoren worden overgedragenOf parallelle wegen door in vitro uitlezing. Een belangrijk voordeel van deze methode is dat het geen voorafgaande kennis vereist van directe stroomopwaartse of stroomafwaartse factoren of fosforyleringsplaatsen daarin. Bovendien, zodra specifieke substraten voor een kinase van belang zijn geïdentificeerd, kan hetzelfde kinase assay protocol gebruikt worden met recombinante componenten om specifieke activiteit te meten aan natuurlijke substraten en specifieke fosforyleringsplaatsen te identificeren wanneer gecombineerd met massaspectrometrie analyse. Sites die op deze wijze worden geïdentificeerd, kunnen verder worden gevalideerd met kinase-analyses die substraatmutanten gebruiken. Ten slotte kan deze methode ook worden gebruikt om autofosforylering te detecteren en te meten.
Het hierin gegeven protocol veronderstelt ofwel een geoptimaliseerde eiwitzuiveringsschema of transfectie methode voor het uitdrukken van een affiniteit gemarkeerde kinase van belang in gekweekte cellen. Voor meer gedetailleerde exposities van transfectie, lysis, immunoprecipitatie en eiwitzuivering protOcols, wij raden aan te verwijzen naar Cold Spring Harbor Protocols 6 . Voor meer informatie over testontwikkeling en -verandering, verwijzen wij u naar Proteïnefosforylering: Geselecteerde Methoden in Enzymologie 7 .
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Kinase Zuiveringsmiddelen en Algemene Immunoprecipitatie Pijpleiding
OPMERKING: Kinasen voor gebruik bij deze bepaling kunnen afkomstig zijn van immunoprecipitaten van gekweekte cellen of door recombinante middelen zoals affiniteit gemerkte zuivering 6 . Hieronder vindt u een algemeen protocol voor flag-tagged immunoprecipitatie die mogelijk moet worden gewijzigd afhankelijk van het belang van de kinase. Alles moet op ijs worden gehouden indien mogelijk.
- Voeg 2 μl 1 mg / ml antilichaam toe aan 200 μl cellysaten (meestal ~ 1 mg / ml totale eiwitconcentratie) en incubeer bij 4 ° C gedurende 1 uur tijdens het schommelen.
- Was eiwit Een sepharose kralen 2-3 keer met lysis buffer (zie hieronder) door kort te draaien bij 4 ° C gedurende 30 s tot 1 min bij 5.000 xg ("touch spin"), het verwijderen van supernatant met een pipet en resuspende kralen in buffer .
- Bereid lysisbuffer op: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0,2 mM natriumorthovanadaat, 100 mM natriumfluoride, 50 mM P-glycerofosfaat, 0,1% Triton X 100 of 0,1% NP-40.
- Voeg 30 μl 50% slurry van eiwit toe. Een sepharose kralen in lysis buffer aan lysaten; Incuberen bij 4 ° C gedurende 1 uur tijdens het schuiven.
- Raak de spin bij 4 ° C aan om de kralen te pelletiseren en de supernatant te verwijderen.
- Was 3 keer met 1 ml kraalwasbuffer (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4).
- Was eens met 1x kinase reactiebuffer (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Verwijder zoveel mogelijk buffer zonder kralen te verwijderen.
2. Initialiseren van Kinase Reacties
OPMERKING: Bij IP-kinase-analyses is ~ 15 μl niet-gesuspendeerde kralen een typisch startmonster. Voor recombinante proteïne kinase assays lopen typische starthoeveelheden van 0,1-1,0 μg in 1-10 voor 25-50 μl uiteindelijke reactievolumes. Pas de volumes van recombinante eiwitmonster aanS gelijk zijn aan de buffer die ze zijn opgeslagen voordat de test wordt geitialiseerd. Bij het gebruik van hoge hoeveelheden kinase, omvatten een drager eiwit zoals BSA om te helpen bij het behoud van eiwitstabiliteit gedurende de duur van de test.
- Bereid de onderstaande 5x kinase reactiebuffer voor:
50 mM HEPES pH 8,0
50 mM MgCl2
50 mM benzamidine (proteaseremmers)
50 mM DTT (reductiemiddel)
250 μM ATP (niet gelabeld of "koud") - Houd kinase monsters op ijs in 1,5 ml buizen. Bereid het volgende reactiemengsel in afzonderlijke, gekoelde 1,5 ml buizen:
21 μl H20
6 μl 5x kinase reactiebuffer
1 μL radiolabelde ("hot") ATP
2 μl substraat (~ 5 mg / ml)
OPMERKING: Voor recombinante kinase-analyses kan het volume worden aangepast om het gezuiverde eiwit op te nemen. Bereken zodanig dat het uiteindelijke reactievolume 30 μl is. Gebruik dit recept om een meester voor te bereidenmengen. Na ontvangst van gelabelde ATP verdunde voorraad in H20 tot een specifieke activiteit van 0,01 mCi / μl voorafgaande aan toevoeging aan reactiemengsel. - Om de analyse te initialiseren, voeg het gehele reactiemengsel toe aan kinase monster en incubeer reactie bij 30 ° C gedurende 5 min tot 1 uur afhankelijk van de activiteit van kinase die wordt getest.
OPMERKING: Als u met een kinase werkt waarvan de activiteit niet eerder is getest, voer u een tijdschema van kinase-activiteit uit met intervallen van 5 minuten tussen de tijdspunten.
3. Reactie Beëindiging en SDS-PAGE
- Stop de reactie door ijs aan te brengen en voeg 7,5 μL 5x Laemmli monsterbuffer 6 toe .
- Hitte bij 100 ° C gedurende 30 s tot 2 min in warmteblok.
- Touch spin en laad 20 μL per putje op 10-15% SDS-PAGE gel. Loop gel lang genoeg om kinase en substraat te scheiden (meestal 1 uur bij een constante kracht van 5 W). Zorg ervoor dat gel-apparaat afgeschermd blijft om de blootstelling te beperken tot 32 P.
- Gebruik hier zelfgemaakte gelapparaten, maar standaard in de handel verkrijgbare mini-gels zijn perfect geschikt. Gebruik de afmetingen als volgt:
Gels: 8 cm breedte, 5,5 cm lengte (oplossen), 1,5 mm dikte.
Kombinaties: 15 putjes, 1,5 mm dikte, 2,9 mm breedte, 16 mm diepte
- Gebruik hier zelfgemaakte gelapparaten, maar standaard in de handel verkrijgbare mini-gels zijn perfect geschikt. Gebruik de afmetingen als volgt:
4. Gelverven en drogen
Let op: Voor alle stappen moet u de persoonlijke blootstelling op 32 P verminderen door gebruik te maken van radioactieve afscherming en persoonlijke beschermende uitrusting dragen. Voor meer informatie over specifieke stappen zijn enkele nuttige verwijzingen opgenomen.
- Verwijder de gel van glas / aluminiumoxide platen en plaats in 50 ml Coomassie vlek (10% ijsazijn, 50% methanol, 0,25% R-250 kleurstof) gedurende 1 uur op een orbitale shaker ingesteld op 50 rpm. Gebruik hiervoor een container die iets groter is dan de gel zelf. 8
- Verplaats de gel van vlek tot fixatieoplossing (10% ijszuur aciD, 20% methanol) om te ontkleuren. Steek de gel in 600-700 ml fixeringsoplossing 's nachts op een orbitale shaker bij 50 rpm. Plaats stukken schuim of geknoopt laboratoriumdoekjes in de houder met de gel om de Coomassie-kleurstof 8 , 9 op te nemen .
- Verwijder de gel van de fixatieoplossing en week in 200 ml methanol gedurende 1 minuut met zachte roering tot de melk melkwit wordt. Dit zal voorkomen dat kraken tijdens de droogstap voorkomen.
- Vet een 14 cm x 14 cm stuk kwalitatief filterpapier met methanol en plaats op een slabgel vacuumdroger. Leg de gel neer op de filterpapier voorzijde naar boven gericht.
- Bedek de gel met een plastic wrap zorgvuldig om rimpels en luchtbellen te vermijden. Reinig de droger gedurende 1,5 uur bij 80 ° C. Nadat het vacuüm is bereikt, open het deksel en rol eventueel luchtbelletjes uit met een zachte rubberen brayer.
5. Autoradiogram en scintillatie tellen
- Verwijder driEd gel en bevestig een autorad marker, fosforescerende liniaal of stippen aan het filterpapier aan de zijkant van de gel. Als u punten gebruikt, zorg dat u zich in een asymmetrisch patroon bevindt. Hiermee wordt de gel gelijktijdig met de film na blootstelling en ontwikkeling afgestemd.
- Gebruik een Geiger-teller om de intensiteit van het signaal te controleren. Bij zwakkere signalen zal de filmbanddichtheid worden blootgesteld bij -70 ° C tot -80 ° C met een intensiverend scherm.
- In een donkere kamer zet gedroogde gel in een filmcassette met film en een intensiverend scherm in de volgende volgorde van boven naar beneden: gel, film, intensiverend scherm.
- Bevestig het intensiverende scherm aan het deksel van de cassette en plak de gel op de plaats om deze stap makkelijker te maken. Het intensiverende scherm licht uit wanneer de bèta-deeltjes van de 32 P. bestralen. Deze lichtemissies penetreren de film efficiënter dan de bèta-deeltjes.
- Zorg ervoor dat de golflengte die uit het intensiverende scherm wordt uitgestuurd correertVijvers naar een golflengte waar de film het meest gevoelig is voor.
- Gebruik een Geiger-teller om te bepalen hoe lang de blootstelling moet verlaten. Als cpm-telling is ~ 100 of lager, probeer dan een nacht bij -70 ° C. Als de telling is ~ 10.000, begin met een 1 uur belichting en optimaliseer vanaf daar.
- Na afloop van de blootstelling verwijder de film en ontwikkel in een medische / röntgenfilm processor. Als de belichting werd uitgevoerd op -70 tot -80 ° C, laat u de cassette warm maken tot kamertemperatuur om condensatie op de film te minimaliseren of de film onmiddellijk te verwijderen voor condensatieformulieren 10 .
- Leg de film over het gedroogde gel / filterpapier en pas de afbeelding van de markering / punten aan met de markeringen / punten op de gedroogde gel. Merk op de film de bands die overeenkomen met de eiwitstandaarden. Benoem de eiwitnormen en welke rijstroken de reacties zijn voor toekomstige verwijzing.
- Accijns de bands uit de gel die overeenkomen met bands van interesse op de film en plaats zeIn 7 ml scintillatieflessen. Voeg 4 ml scintillatievloeistof toe en tel met vloeibare scintillatieteller. Bevestig dat de teller is ingesteld om het juiste energiespectrumvenster te controleren voor 32 P.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u ook de band die overeenkomt met substraat van de no-kinase control lane, accijnzen. Dit wordt gebruikt om achtergrondstraling te berekenen die van alle scintillatietellingen wordt afgetrokken.
6. Analyse van de resultaten
OPMERKING: Het autoradiogram biedt een kwalitatieve visualisatie van de resultaten. Voor nauwkeurige kwantificering kan 32 P incorporation worden gemeten met een scintillatieteller. Gegevens worden meestal uitgedrukt in relatieve activiteit, zoals getoond in Figuur 1B . Zolang er uniforme omstandigheden voor alle monsters worden onderhouden, zijn relatieve metingen van specifieke activiteit voldoende om behandelingen te vergelijken.
- Bij het berekenen van absolute specifieke activiteitwaarden, voer een strengheid uitOus optimalisatie van alle reactieomstandigheden, waaronder kinase, substraat en koude ATP concentraties, teneinde een lineair bereik van de activiteit over een tijdsoort te waarborgen ( bijv. 2 x [kinase] = 2 x specifieke activiteit). Voor kinasen met een hoge specifieke activiteit, verricht analyses met verhoogde substraatconcentratie in geval kinase-activiteit beperkt wordt door hoeveelheid substraat.
- Bereken de specifieke activiteit van kinase van belang in eenheden van nanomol fosfaat overgedragen per minuut per mg kinase.
- Trek blanks van de cpm in de getelde bands af.
- Bereken het verval van hete ATP: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 waar t het aantal dagen is sinds de referentie datum (dient te worden geleverd door de verkoper), t 1/2 is de De halveringstijd van 32 P, dat is 14,3 dagen en 0,95 weerspiegelt de efficiëntie van de scintillatieteller. Voorbeeld: als het gebruik van hot ATP dat 28 dagen oud is, zou de vervalwaarde 0,255 moeten zijn.
- CalcDe picomolen (pmol) van de totale ATP in de test (meestal gelijk aan de hoeveelheid koude ATP in de reactie): het volume van de analyse (μL) x [koude ATP] (μM) = totale ATP (pmol). Voorbeeld: 30 μl x 50 μM = 1500 pmol
- Bereken cpm / pmol ATP: [μL hete ATP x (2,2 x 107 ) x vervalfactor] / pmol van koude ATP.
OPMERKING: De waarde van 2,2 x 10 7 converteert 0,01 mCi / μL ATP tot cpm. - Bereken de hoeveelheid kinase in de test in mg. Voor zowel recombinante kinase als immunoprecipitated kinases zijn standaardmethoden zoals BCA assays geschikt voor het bepalen van uitgangsconcentraties. Voorbeeld: wtERK2 0,0002 μg / μL in een 50 μl kinase reactie is 0,01 μg of 1 x 10 -5 mg.
- Bereken totale cpm in de test. Monteer 30 μl reacties en run 20 μL van elke reactie op een gel. Vermenigvuldig de cpm geteld (na blanco aftrekken) met een factor van het totale testvolume / volume geladen. Vervolg bovenstaandeVoorbeeld, vermenigvuldigt alle tellingen met 1,5 of 30/20.
- Bereken de specifieke activiteit van de geteste kinase:
Totale cpm in test) / (cpm / pmol ATP) / (analysetijd in minuten) / (hoeveelheid kinase in mg)
OPMERKING: Het verdelen van bovenstaande waarde met 1.000 geeft de specifieke activiteit in nanomolen / minuut / mg
- Bereken hoeveel mol fosfaat in een substraat wordt opgenomen (zolang het molecuulgewicht bekend is). Dit wordt gebruikt om het aantal fosfosieten op een bepaald eiwit te bepalen zodra de reactie tot voltooiing is gegaan.
Totale cpm in assay) / (cpm / pmol ATP)] / (hoeveelheid substraat in pmolen)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
WNK1 IP kinase assays
Myc-gemerkte WNK1 werd getransfecteerd in HEK293-cellen en immunoprecipitueerd met een anti-Myc antilichaam 11 . Het immunoprecipitaat vertoonde de kinase activiteit ten opzichte van het model substraat MBP evenals naar zichzelf ( Figuur 1A ). WNK1 mutanten werden vervolgens getest op kinase-activiteit naar MBP met dezelfde methode, deze keer gebruikmakend van GST-get...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kinases zijn een uiteenlopende familie van eiwitten die in talrijke contexten uitgebreide functionaliteit hebben ontwikkeld, en kinase-analyses zijn ongelooflijk bruikbaar bij het bestuderen van verschillende signalering eiwitten en hebben veel bijgedragen aan ons huidige begrip van cellulaire communicatie. In het bijzonder werd dezelfde basisassay gebruikt om twee disparate kinasen te karakteriseren ondanks grote verschillen in structuur en activiteit. WNK1 kinase bevat een atypische katalytische zak waar het kritische...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken alle huidige en voormalige leden van het Cobb laboratorium voor waardevol werk en discussies, en Dionne Ware voor administratieve bijstand. Deze studies werden ondersteund door National Institutes of Health Grant R37 DK34128 en Welch Foundation Grant I1243 aan MHC
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 | |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 | |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 | |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 | |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 | |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 | |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 | |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 | |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector | |
| BioMax Cassette 8 x 10" | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax MS Film 8" x 10" | Carestream Health | 829 4985 | |
| BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" | Carestream Health | 851 8706 | |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A | |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 | |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 | |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
Referenties
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33(2016).
- Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
- Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
- Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
- Cold Spring Harbor Protocols. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
- Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215(1999).
- Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
- Autoradiography. , Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. , 3 edn, Humana Press. (2009).
- Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
- McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
- Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11(2011).
- Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669(2013).
- Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
