Het doel van dit document en instructie video te beschrijven hoe bloot en verwijder de pig postmortem hersenen en hypofyse in intacte toestand, geschikt voor daaropvolgende macroscopische en histologische analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Blootstelling van het varken voor CNS Histologische analyse: A Manual voor onthoofding, Schedel openen en Brain verwijdering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Varkens zijn steeds populairder geworden in grote dieren translationeel neurowetenschappelijk onderzoek als een economisch en ethisch haalbaar alternatief voor niet-menselijke primaten. De grote omvang van de hersenen van het varken maakt het gebruik van conventionele klinische hersenen imagers en de directe gebruik en het testen van neurochirurgische procedures en apparatuur uit de menselijke kliniek. Verdere macroscopische en histologische analyse vereist echter postmortem blootstelling van het varken centrale zenuwstelsel (CZS) en daaropvolgende verwijdering hersenen. Dit is niet eenvoudig, aangezien de pig CNS wordt ingekapseld door een dikke, benige schedel en wervelkolom. Het doel van dit document en instructie video te beschrijven hoe bloot en verwijder de pig postmortem hersenen en de hypofyse in intacte toestand, geschikt voor daaropvolgende macroscopische en histologische analyse.
Inleiding
Translationele neurowetenschappen studies in varkens hebben steeds populairder geworden in de afgelopen twee decennia. De grote omvang van de varkenshersenen maakt het gebruik van conventionele klinische hersenen beeldschermen en direct gebruik en testen van neurochirurgische procedures en apparatuur uit de menselijke kliniek 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. In de laatste 20 jaar, varkens, minivarkens bijzonder (bijvoorbeeld minipig Göttingen), zijn gebruikt om neuromodulatory behandelingsmodaliteiten, zoals stamceltransplantatie te onderzoeken; virale vector transfectie; en diepe hersenstimulatie gericht ziekte van Parkinson, obesitas, depressie en ziekte van Alzheimer 2, 6,= "xref"> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Dit werd gevolgd door de ontwikkeling van stereotaxische chirurgische benaderingen van het CNS minipig 3, 18, 19, 20, 21 te manipuleren. De ingestelde CNS wijzigingen zijn geëvalueerd in levende dieren met behulp van brain imaging (PET 10, 13, 22, 24 en 23 MR), cystrometrie 11, 12, 25, gangbeeldanalyse17, neurologisch onderzoek 9, 17 en autopsie basis van histologie en stereologische analyse 14, 15, 17, 26, 27, 31. Echter, postmortem analyse vereist de blootstelling en verwijdering van het varken hersenen, die geen gemakkelijke taak, als dikke, benige schedel en een vezelig durale die rondom de varkenshersenen.
Het doel van dit papier en instructievideo is om te beschrijven hoe de postmortem varken hersenen en de hypofyse kunnen worden blootgesteld en afgevoerd in een intacte toestand in 15-20 min met behulp van niet-gemotoriseerde chirurgische instrumenten. De instructie video en fotografische afbeeldingen tonen mannelijke minipigs (leeftijd: 6 maanden, lichaamsgewicht: 20-25 kg) gebruikt voor een anatomische studie over de minipig hypofyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierlijke anesthesie en euthanesia werd uitgevoerd volgens "Principles of proefdier care" (NIH publicatie nr 86-23, herzien 1985) en door de Deense Raad voor dierlijke Research Ethics goedgekeurd.
1. Instrumenten
- Verzamel de instrumenten die in de video en in de tabel van Materialen vermeld.
2. Onthoofding
OPMERKING: Anesthesie werd geïnduceerd door een intramusculaire injectie van 5 ml midazolam (5 mg / ml) en 5 ml ketamine (25 mg / ml). 5-10 min later, als het dier diep verdoofd was, een oorader gecannuleerd en een dodelijke overdosis (100 mg / kg lichaamsgewicht) van natriumpentobarbital (200 mg / ml) werd intraveneus toegediend. Opdat het dier volledig was onderworpen aan euthanasie werd de interdigitale pijn reflex getest zoals getoond door Ettrup et al. (2011) 20. Volledige euthanization werd gewaarborgd zoals beschreven inde ethische bovenstaande verklaring gevolgd door een transcardiale perfusie met 5 liter isotonische zoutoplossing, zoals aangetoond door Ettrup et al. (2011) 20. Alle gedemonstreerd procedures worden uitgevoerd postmortem, zich verzet tegen de noodzaak voor het welzijn voorzorgsmaatregelen die nodig zijn voor de lange termijn anesthesie en postprocedurele overleving.
- Onthoofden het varken door een hoge cirkelvormige cervicale incisie via een chirurgische scalpel, net onder de onderkaak hoek (Figuur 1A).
- Nog steeds met de chirurgische scalpel, blijven de incisie voren door het zachte weefsel van de nek, met inbegrip van het strottenhoofd en de slokdarm, tot de benige wervelkolom wordt bereikt, ongeveer ter hoogte van de overgang craniocervicaal.
- Advance het snijden met een chirurgische scalpel uit de voorste zijde van de craniocervicaal knooppunt boven de voorste boog van atlas en door het voorste atlantooccipital membraan, waardoor het wervelkanaal en het ruggenmerg blootstellen (Figuur 1B). Tegelijkertijd vraagt een assistent voor het varken lichaam weg te trekken van het varken hoofd naar de toegang tussen de schedelbasis en de eerste halswervel verlichten.
- Blijven de chirurgische incisie door de durale zak en het ruggenmerg (figuur 1B). Pas goed zodat een volledige dwarsdoorsnede van het ruggenmerg bereikt.
Opmerking: Als de vorige stap kan ongewenste trekkracht op het ruggenmerg en de hersenen tijdens de volgende stappen van de onthoofding uit te voeren. - Krachtig verlengen cranocervical splitsing aan het sectieniveau (figuur 1C). Tegelijkertijd, gebruikt de chirurgische scalpel gedeelte resterende atlantooccipital ligamenten het gewricht los tussen het occipitale condyli en de bovenste scharnierende proces atlas. Scheid de pig kop uit het lichaam.
Figuur 1: minipig onthoofding. (A) nekincisie (pijl kaakhoek). (B) ingesneden atlantooccipital ligamenten en de dura omgeven ruggenmerg (SC) en schedelstructuur knooppunt (C1, anterieure boog van atlas, OC, occipitale condylus). (C) Het achterste deel van de atlantooccipital scharnier wordt vrijgegeven door een krachtige verlenging (pijlen) op sectieniveau. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
3. Opening Schedel
- Positioneer het varken hoofd op een tafel.
- Voeg een dorsale longitudinale incisie met een chirurgisch scalpel door de huid en het onderliggende zachte weefsel van de rug van de snuit, over de top van het hoofd, en naar beneden door het achterste deel vande occipitale regio.
- Bloot rug- en achterste deel van de schedel door verwijdering van het zachte weefsel zich lateraal van de initiële incisie met een chirurgisch scalpel.
- Laat de temporalis bilateraal van de schedel (Figuur 2A) met een chirurgische scalpel. Zorg ervoor dat de posterieure occipitale bot wordt gereinigd van zacht weefsel.
- Met de achterste ingang van het foramen magnum het schedelbeen verwijderen met een Kerrison botpons en bot rongeurs en bloot-dura bedekte cerebellum (Figuur 2B).
- Keer terug naar de blootgestelde voorste kant van de schedel en selecteer een ingangspunt in de frontale bot, vlak voor de ogen. Op dit moment gebruiken een bot beitel met een hamer om de schedel penetreren en voer de frontale sinus (figuur 2C).
- Met de omvang van de frontale sinus de dorsoposterior verwijderen van de schedel lamina met een bot rongeur of botpons bevorderen en bloot de binnenste dunnebenige schedel lamina die de hersenen (Figuur 2D).
- Open voorzichtig de binnenste benige schedel lamina anterieur met een hamer en een beitel bot op de dura vallen hersenen (figuur 2E) bloot te leggen.
- Blijven de botverwijdering zijdelings via een been beitel en een bot rongeur door de temporale en pariëtale botten om de uiteindelijke dorsoposterior van de schedel, gelegen tussen het reeds belichte delen van de dura bedekte en kleine hersenen (figuur 2F) vrijgeven.
LET OP: Het is vaak mogelijk tijdens de laatste stap van deze procedure, de beitel gebruiken voor het openen van de resterende posterior schedelbot breken van de ene kant, net zoals men een deur opent.
Figuur 2: minipig schedel opening. (A) Blootstelling van de dorsoposterior schedeloppervlak, waaronder het verwijderen van de occipitale en temporale spieren. (B) Het verwijderen van het occipitale bot (CB,-dura bedekte cerebellum, OB, schedelbeen, OC, occipitale condylus en SC, ruggenmerg). (C) Een hamer en een beitel bot worden gebruikt om de schedel voren dringen en de frontale sinus ter hoogte van de ogen te voeren. (D) De mate van de frontale sinus (FS) wordt gebruikt om de buitenste dikke schedelbot (1) te verwijderen, het blootstellen van een binnenste dunne bot plaat (2) die de grote hersenen. (E) Het verwijderen van de dunne lamina bot, waardoor de dura-bedekte hersenen (pijl). (F) Tenslotte werd een hamer en een beitel bot gebruikt zijdelings sluiten de voorste en de achterste schedel openingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
4. Brain removal
- Gebruik chirurgische tang om de dura te tillen en het creëren van een zachte incisie dicht bij de veneuze superieure sagittale sinus met een fijne chirurgische scalpel (Figuur 3A).
- Gebruik micro-schaar of dura-mes om de dura die het dorsale oppervlak van de hersenen verder te openen.
OPMERKING: Speciale voorzichtigheid is geboden bij het verwijderen van de dura overeenkomt met de cerebellaire tentorium (figuur 3B) als het behoud van de durale blad voorkomt daaropvolgende verwijdering hersenen. - Positioneer het varken kop verticaal (figuur 3C).
- Met het bot beitel of dissector de ventroanterior hersenen vrijgeven stompe dissectie van de bulbus olfactorius van de dura bedekte bodem van de schedelholte (Figuur 3D).
- Met een fijne chirurgische scalpel gedeelte blootgestelde optische chiasma (figuur 3E). Bloot te leggen en deel de hypofyse stengel en de oculomotorische zenuwen.
- Maak de ventrale hersenstam door het snijden van de lower craniale zenuwen (figuur 3F) met dunne chirurgische scalpel. Waarborgen dat de durale cerebellaire tentorium volledig ingesneden (figuur 3B), omdat deze durale bladeren anderszins uit de hersenstam snijdt bij de introductie proces.
Figuur 3: minipig hersenen verwijderd. (A) Dural opening chirurgische pincet en een dura mes. (B) Wees voorzichtig volledig insnijden de durale blad (pijl), gelegen tussen de hersenen en de kleine hersenen. (C) Het varken kop verticaal geplaatst voor een betere visualisatie van schedelbasis structuren en zodat de zwaartekracht helpt bij het beoogde verplaatsing van de hersenen. (D) een dissector of bot beitel gebruikt om de olfactorische knobbel verlichten door het stompe gedeelte van de dura-covered schedelbasis. (E) De dissectie wordt voortgezet in een postérieure richting langs de schedelbasis voor belichting en snijden van de optische chiasma (pijl), trechtervormige steel en oculomotorische zenuwen. (F) De hersenen afgifte wordt aangevuld met het gedeelte van de onderste craniale zenuwen deze afwijken van het ventrale oppervlak van de hersenstam (III oculomotor zenuw, IV, trochlear zenuw, V, trigeminale zenuw en VI, nervus abducens). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
5. Hypofyse Verwijdering
- Identificeer de hypofyse stengel en de omringende durale blad (het diapragma sellae) in de schedel vloer (Figuur 4A).
- Insnijden de durale vel lateraal van de hypofyse steel met een fijne chirurgische scalpel (figuur 4B).
- Gebruik een dissector om de put vrij te gevenuitary en verwijder deze uit de hypofyse fossa (Figuur 4C).
Figuur 4: minipig hypofyse verwijderen. (A) De hypofyse fossa (*) wordt aangegeven in de schedel vloer (1, bulbus olfactorius, 2, optisch chiasma en PF, achterste schedelgroeve). (B) De durale afdekking (sellar diagphragm, (pijl)) zijdelings ingesneden. (C) De hypofyse (pijl) wordt vrijgegeven met een dissector en opgetild uit de hypofyse fossa. Schaalbalk (AC) = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het weefselmateriaal uitdroging te voorkomen, wordt aanbevolen om de verwijderde hersenen en hypofyse slaan in een pot gevuld met lijm of isotone zoutoplossing onmiddellijk na macroscopische analyse is uitgevoerd. Het weefselmateriaal kan worden opgeslagen in het fixeermiddel jaren, terwijl opslag in isotone zoutoplossing, zelfs in de koelkast, leidt tot weefselverval tijd.
De verwijderde hypofyse kan ook direct worden bevrore...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Meest experimentele neurologie studies worden uitgevoerd in kleine diersoorten, zoals muizen en ratten, waarbij toegang tot het CNS wordt vergemakkelijkt door een dunne schedel- en durale dikte. In grote proefdieren als varkens 1, 4, 8, schapen 32 en niet-humane primaten, de aanzienlijke dikte van deze structuren is het gebruik van robuuste instrumenten (tabel van materialen) en goede ingangspunten voor ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen met dankbaarheid de bekwame hulp van Mrs. Trine W. Mikkelsen, mevrouw Lise M. Fitting, en het personeel in Påskehøjgaard. De Deense Medical Research Council, de Lundbeck Foundation, en de Novo Nordisk Foundation financieel ondersteund de studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Heavy Scalpel Handle #4 | FST (Fine Science Tools) | 10008-13 | Goed voor huidsnede en verwijdering van zacht weefsel |
| Non-Sterile Scalpel Blades #23 | FST | 10023-00 | |
| Scalpel Handle #7 | FST | 10007-12 | Optimaal voor dura-incisie en precisiewerk |
| Non-Sterile Scalpel Blades #11 | FST | 10011-00 | |
| Surgical Forceps | FST | 11024-18 | De punt van de chirurgische forceps zorgt voor een stevige greep |
| Kerrison Bone Punch | Aesculap Neurosurgery | FF713R | Moet robuust zijn, bijtwoordgrootte 3-5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | MD615 | Moet robuust zijn, bijtwoordgrootte 15 x 5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | FO551R | Moet robuust zijn, bijtwoordgrootte 25 x 15 mm |
| Bone Chisel | Lawton | 67-0335 | De grootte van het beitelhoofd mag niet groter zijn dan 20 mm |
| Mallet (Hammer) | Millarco | 5624108 | Gewicht 300 g, lengte 30 cm, slagoppervlak van de kop 2 x 2 cm |
| Micro-Scissor | FST | 14002-14 | |
| Dissector | Aesculap Neurosurgery | OL165R | |
| Göttingen minipigs | Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denemarken | ||
| Euthanimal | pentobarbital | ||
| Ketamine | Pfizer | ||
| Midazolam | Hameln Pharmaceuticals |
Referenties
- Lind, M. N., Moustgaard, A., Jelsing, J., Vajta, G., Cumming, P., Hansen, A. K. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav Rev. 31, 728-751 (2007).
- Bjarkam, C. R., et al. Neuromodulation in a minipig model of Parkinson disease. British J Neurosurg. 22 (Suppl. 1), S9-S12 (2008).
- Bjarkam, C. R., Cancian, G., Glud, A. N., Ettrup, K. S., Østergaard, L., Sørensen, J. C. MRI-guided stereotaxic targeting in pigs based on a stereotaxic localizer box fitted with an isocentric frame and use of SurgiPlan computer-planning software. J Neurosci Methods. 183 (2), 119-126 (2009).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Bjarkam, C. R., et al. Safety and function of a new clinical intracerebral microinjection instrument for stem cells and therapeutics examined in the Göttingen minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 88 (1), 56-63 (2010).
- Fjord-Larsen, L., et al. Long-term delivery of nerve growth factor by encapsulated cell biodelivery in the minipig basal forebrain. Mol Therapy. 18 (12), 2164-2172 (2010).
- Sørensen, J. C., et al. Development of neuromodulation treatments in a large animal model - Do neurosurgeons dream of electric pigs? Prog Brain Res. 194, 97-103 (2011).
- Dolezalova, D., et al. Pig models of neurodegenerative disorders: utilization in cell replacement-based preclinical safety and efficacy studies. J Comp Neurol. 522 (12), 2784-2801 (2014).
- Mikkelsen, M., Moller, A., Jensen, L. H., Pedersen, A., Harajehi, J. B., Pakkenberg, H. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Danielsen, E. H., et al. The DaNEX study of embryonic mesencephalic, dopaminergic tissue grafted to a minipig model of Parkinson's disease: Preliminary findings of effect of MPTP poisoning on striatal dopaminergic markers. Cell Transplant. 9 (2), 247-259 (2000).
- Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Jørgensen, T. M., Djurhuus, J. C. Effects of high frequency deep brain stimulation on urine storage and voiding function in conscious minipigs. Neurourol Urodyn. 23 (3), 265-272 (2004).
- Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Djurhuus, J. C. Stereotactic electrical stimulation of the pontine micturition center in the pig. Br J Urol. 95, 886-889 (2005).
- Andersen, F., Watanabe, H., Bjarkam, C. R., Danielsen, E. H., Cumming, P. The DaNeX Study Group. Pig brain stereotaxic standard space: Mapping of cerebral blood flow normative values and effect of MPTP-lesioning. Brain Res Bull. 66 (1), 17-29 (2005).
- Glud, A. N., et al. Direct gene transfer in the minipig CNS using stereotaxic lentiviral microinjections. Acta Neurobiol Exp. 70 (3), 1-8 (2010).
- Glud, A. N., et al. Direct MRI-guided stereotaxic viral mediated gene transfer of alpha-synuclein in the minipig CNS. Acta Neurobiol Exp. 71 (4), 508-518 (2011).
- Ettrup, K. S., Sørensen, J. C., Rodell, A., Alstrup, A. K. O., Bjarkam, C. R. Hypothalamic deep brain stimulation influences autonomic and limbic circuitry involved in the regulation of aggression and cardiocerebrovascular control in the minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 90 (5), 281-291 (2012).
- Nielsen, M. S., et al. Continuous MPTP intoxication in the minipig results in chronic parkinsonian deficits. Acta Neurobiol Exp. 76, 198-210 (2016).
- Bjarkam, C. R., et al. A MRI-compatible stereotaxic localizer box enables high-precision stereotaxic procedures in pigs. J Neurosci Methods. 139 (2), 293-298 (2004).
- Bjarkam, C. R., Jorgensen, R. L., Jensen, K. N., Sunde, N. A. A., Sørensen, J. C. H. Deep brain stimulation electrode anchoring using BioGlue®, a protective electrode covering, and a titanium microplate. J Neurosci Methods. 168, 151-155 (2008).
- Ettrup, K. S., et al. Basic Surgical Techniques in the Minipig: Intubation, Transurethral Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion. J Vis Exp. (52), e2652(2011).
- Ettrup, K. S., Tornøe, J., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. A surgical device for minimally invasive implantation of experimental deep brain stimulation leads in large research animals. J Neurosci Methods. 200 (1), 41-46 (2011).
- Danielsen, E. H., et al. Positron emission tomography of living brain in minipigs and domestic pigs. Scand J Lab Anim Sci Suppl. 25 (1), 127-135 (1998).
- Røhl, L., et al. Time evolution of cerebral perfusion and ADC measured by MRI in a porcine stroke model. J Magn Reson Imaging. 15 (2), 123-129 (2002).
- Cumming, P., Gillings, N. M., Jensen, S. B., Bjarkam, C. R., Gjedde, A. Kinetics of the uptake and distribution of the dopamine D2/3 agonist (R)-N-[1-11C]n-propylnorapomorphine in brain of healthy and MPTP-poisoned Gottingen miniature pigs. Nucl Med Biol. 30 (5), 547-553 (2003).
- Jensen, K. N., Deding, D., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. Long-term implantation of deep brain stimulation electrodes in the pontine micturition centre of the minipig. Acta Neurochir. 151 (7), 785-794 (2009).
- Rosendal, F., et al. Does chronic low dose treatment with ciclosporin influence the brain? A histopathological study in pigs. Transplantation Proc. 37 (8), 3305-3308 (2005).
- Nielsen, M. S., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. The substantia nigra pars compacta of the minipig: An anatomical and stereological study. Brain Struct Funct. (4-5), 481-488 (2009).
- Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R., Simonsen, C. Z., Danielsen, E., Geneser, F. A. Oriented sectioning of irregular tissue blocks in relation to computerized scanning modalities. Results from the domestic pig brain. J Neurosci Methods. 104, 93-98 (2000).
- Bjarkam, C. R., Pedersen, M., Sørensen, J. C. New strategies for embedding, orientation and sectioning of small brain specimens enable direct correlation to MR-images, brain atlases, or use of unbiased stereology. J Neurosci Methods. 108, 153-159 (2001).
- Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Geneser, F. A. Distribution and morphology of serotonin-immunoreactive axons in the hippocampal region of the New Zealand white rabbit. I. Area dentata and hippocampus proper. Hippocampus. 13 (1), 21-37 (2003).
- Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Struct Funct. , e-pub ahead of print (2016).
- Boltze, J., Nitzsche, B., Geiger, K. D., Schoon, H. A. Histopathological investigation of different MCAO modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an ovine stroke model. Transl Stroke Res. 2, 279-293 (2011).
- Jortner, B. S. The return of the dark neuron. A histological artifact complicating contemporary neurotoxicologic evaluation. Neurotoxicology. 27, 628-634 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
