Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

CAPRRESI: Chimera Assembly Door Plasmide Recovery En Restriction Enzyme Site Insertion

11.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55526

⸱

25 juni 2017

 ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Oncomedic Incorporation, Ciudad de México, 3Laboratorio Internacional de Investigación sobre el Genoma Humano, Universidad Nacional Autónoma de México

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we chimera assemblage door plasmideherstel en restrictie-enzymplaatsinzending (CAPRRESI), een protocol gebaseerd op de invoeging van restrictie-enzymplaatsen in synoniem-DNA-sequenties en functioneel plasmideherstel. Dit protocol is een snelle en goedkope methode voor het smelten van proteïne-coderende genen.

Samenvatting

Hier presenteren we chimera assemblage door plasmide recovery en restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI profiteert van vele sterke punten van de oorspronkelijke plasmide herstel methode en introduceert restrictie enzym digestie om DNA ligatie reacties te vereenvoudigen (vereist voor chimera assemblage). Voor dit protocol, klonen gebruikers wildtype genen in hetzelfde plasmide (pUC18 of pUC19). Na de in silico selectie van aminozuursequentie gebieden waar chimera's moeten worden samengesteld, krijgen gebruikers alle synoniem-DNA-sequenties die ze coderen. Adhoc Perl scripts stellen gebruikers in staat om alle synonieme DNA sequenties te bepalen. Na deze stap zoekt een ander Perl-script naar restrictie-enzymplaatsen op alle synoniem-DNA-sequenties. Dit in silico analyse wordt ook uitgevoerd met behulp van het ampicilline resistentie gen ( ampR ) gevonden op pUC18 / 19 plasmiden. Gebruikers ontwerpen oligonucleotiden in synoniemregio's om wildtype- en ampR- genen door PCR te verstoren. Na obtAining en zuiverende complementaire DNA-fragmenten, wordt het verteren van restrictie-enzym verwezenlijkt. Chimera assemblage wordt bereikt door gelijke complementaire DNA fragmenten te ligeren. PUC18 / 19-vectoren worden geselecteerd voor CAPRRESI omdat ze technische voordelen bieden, zoals kleine grootte (2,686 basisparen), hoge kopieën, voordelige sequentie-reactie-eigenschappen en commerciële beschikbaarheid. Het gebruik van restrictie-enzymen voor chimera-assemblage elimineert de noodzaak van DNA-polymerasen die stompe producten leveren. CAPRRESI is een snelle en goedkope methode voor het smelten van proteïne-coderende genen.

Inleiding

Chimerische gensamenstelling is veel gebruikt in moleculaire biologie om eiwitfunctie en / of biotechnologische doeleinden te verklaren. Verschillende methoden bestaan ​​voor het smelten van genen, zoals overlappende PCR product amplificatie 1 , plasmide recovery 2 , homologe recombinatie 3 , CRISPR-Cas9 systemen 4 , site gerichte recombinatie 5 en Gibson assemblage 6 . Elk van deze biedt verschillende technische voordelen; Bijvoorbeeld de flexibiliteit van overlappende PCR-ontwerpen, de in vivo selectie van constructies tijdens plasmideherstel, of het hoge efficiëntie van CRISPR-Cas9 en Gibson systemen. Aan de andere kant kunnen sommige moeilijkheden optreden tijdens het uitvoeren van sommige van deze methoden; Bijvoorbeeld zijn de eerste twee benaderingen gebaseerd op stompe DNA-fragmenten, en ligatie van deze typen producten kan technisch uitdagend zijn in vergelijking met sticKy-ended ligatie. Site-gerichte recombinatie kan sporen van extra DNA-sequenties (littekens) op het origineel achterlaten, zoals in het CrexloP-systeem 5 . CRISPR-Cas9 kan in aanvulling op de doelplaats 4 soms andere genoomgebieden wijzigen.

Hier introduceren we chimera assemblage door plasmideherstel en restrictie-enzymplaatsinvoeging (CAPRRESI), een protocol voor het smelten van proteïne-coderende genen die de plasmideherstelmethode (PRM) combineren met de insertie van restrictie-enzymplaatsen op synoniem-DNA-sequenties, het verbeteren van de ligatie-efficiëntie . Om de aminozuursequentie integriteit te waarborgen, worden restrictie-enzymplaatsen ingevoegd op synoniem-DNA-sequentiestrektes. Onder de voordelen van CAPPRESI is dat het kan worden uitgevoerd met behulp van gewone laboratoriumreagentia / gereedschappen ( bijv . Enzymen, bevoegde cellen, oplossingen en thermocycler) en dat het snelle resultaten kan geven (wanneer de juiste enzymen worden gebruikt). Vertrouwen op beperkingEnzym sites die voortkomen uit synonieme DNA sequenties kunnen de selectie van de exacte fusiepunten binnen de eiwitten van belang beperken. In dergelijke gevallen moeten doelgenen worden gefuseerd met behulp van overlappende oligonucleotiden, en restrictie-enzymplaatsen moeten op het weerstandgen van de vector worden ingebracht.

CAPRRESI bestaat uit zeven eenvoudige stappen ( Figuur 1 ): 1) selectie van de kloningsvector, pUC18 of pUC196; 2) in silico analyse van de wildtype sequenties die gefuseerd moeten worden; 3) selectie van breekgebieden voor chimera assemblage en plasmid ontwrichting; 4) in silico generatie van synoniem-DNA sequenties die restrictie-enzym sites bevatten; 5) onafhankelijk klonen van de wildtype genen in het geselecteerde plasmide; 6) plasmidestoring door PCR, gevolgd door restrictie-enzymvertering; En 7) plasmideherstel met behulp van DNA-ligatie en bacteriële transformatie. Chimerische genen geproduceerd door deze techniek moeten worden gecontroleerd wIn sequentiebepaling.

De vectoren pUC18 / 19 bieden technische voordelen voor het klonen en chimera assemblage, zoals kleine grootte ( dwz 2,686 basisparen), hoge kopieën, voordelige sequentie-reactie-eigenschappen en commerciële beschikbaarheid 7 . Hier werd een Escherichia coli gastheer gebruikt om de chimera's te monteren en te behandelen, omdat bacteriële culturen goedkoop zijn en snel groeien. Gezien dit, zal verdere cloning van de fusiefragmenten in de uiteindelijke doelplasmiden nodig zijn ( bijv. Expressievectoren als pRK415 in bacteriën of pCMV in zoogdiercellen).

CAPRRESI werd getest op het fuseren van twee primaire sigma-factor genen: E. colirpoD en Rhizobium etlisigA . Primaire sigma factoren zijn RNA polymerase subunits die verantwoordelijk zijn voor transcriptie initiatie, en bestaan ​​uit vier domeinen ( dwz σ1, σ2, σ3 en σ4) 8 . De aminozuursequentie verlengtH van eiwitten gecodeerd door rpoD en sigA zijn respectievelijk 613 en 685. RpoD en SigA delen 48% identiteit (98% dekking). Deze primaire sigma factoren werden gesplitst in twee complementaire fragmenten tussen regio's σ2 en σ3. Twee chimere genen werden samengesteld volgens dit ontwerp: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) en chimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA-fusieproducten werden geverifieerd door sequencing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. CAPRRESI Protocol

OPMERKING: Figuur 1 staat voor het algemene CAPRRESI protocol. Deze techniek is gebaseerd op een silico- ontwerp en de daaropvolgende constructie van de gewenste chimeras.

  1. Selectie van het kloneringsplasmide, pUC18 of pUC19.
    1. Selecteer de pUC vector die het beste past bij de technische eisen.
      OPMERKING: Beide vectoren hebben dezelfde volgorde, behalve de oriëntatie van de meervoudige kloneringsplaats. Dit is belangrijk voor het ontwerpen van oligonucleotiden en de PCR plasmidestoring.
  2. In silico analyse van de wildtype genen en pUC18 / 19 sequenties.
    1. Verkrijg de DNA sequenties van de wildtype genen en sla ze op in een FASTA formaat bestand ( bv genes.fas).
      OPMERKING: De sequenties van pUC18 / 19 vectoren bevinden zich in het pUC.fas bestand ( Figuur 1 , stap 1).
    2. Bepaal welke beperking enzYmes snijd de wildtype genen en pUC18 / 19 sequenties niet door het script REsearch.pl te draaien. Alternatief, voer een zoekopdracht met restrictie-enzym site uit met een online tool ( Figuur 1 , stap 2).
      1. Typ het volgende in een terminal:
        Perl REsearch.pl genes.fas
        Perl REsearch.pl pUC.fas
        OPMERKING: Deze commando's maken de volgende uitvoerbestanden: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas en pUC_re.fas.
      2. Selecteer de juiste restrictie-enzymen voor het klonen van de wildtype genen in de meerdere kloneringsplaats van de gekozen pUC18 / 19-vector door de genes_re.fas- en pUC.fas-bestanden te vergelijken. Kies de oriëntatie van het inzetstuk in relatie tot het ampicilline resistentie gen ( ampR ) van de pUC18 / 19 vector.
    3. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden om het coderende gebied van de wildtype genen (externe oligonucleotiden) te amplificeren. Inclusief de juiste restrictie-enzymplaats bij elk 5'-uiteindeVan de oligonucleotiden; Hiermee wordt de invoeghoek geformuleerd.
      1. Inclusief een functionele ribosoom bindingsplaats in de voorwaartse oligonucleotiden.
      2. Leg beide wildtype genen in dezelfde richting in de vector in.
  3. Selectie van de breekgebieden voor chimera assemblage en plasmid ontwrichting.
    1. Verkrijg de aminozuursequentie van de wildtype en de ampR genen door het translate.pl script te gebruiken ( Figuur 1 , stap 3).
      1. Typ het volgende in een terminal:
        Perl translate.pl genes.fas
        Perl translate.pl ampR.fas
        OPMERKING: dit script creëert de volgende uitvoerbestanden: genes_aa.fas en ampR_aa.fas.
    2. Globaal uitlijnen de twee wildtype aminozuursequenties met een passende software ( bijvoorbeeld MUSCLE) 9 .
    3. Selecteer de gewenste pauze gebieden (3-6 aminozuren) voor chimera asMbly op basis van de volgorde uitlijning. Sla ze op in een bestand in FASTA-formaat ( bijv . , Regions.fas).
    4. Bepaal de DNA sequenties die codeert voor het geselecteerde aminozuur op beide wildtype genen.
  4. In silico generatie van synoniem DNA sequenties die restrictie-enzym sites bevatten.
    1. Verkrijg alle synoniem-DNA-sequenties die codeert voor elke aminozuursequentie die is geselecteerd als breekstreken ( Figuur 1 , stap 4); Deze sequenties werden opgeslagen in het regions.fas bestand.
      1. Typ het volgende in een terminal:
        Perl synonym.pl regions.fas
        OPMERKING: dit script zal het output_bestand regions_syn.fas maken.
    2. Zoek naar restrictie-enzymplaatsen die gevonden worden op synoniem-DNA-sequenties.
      1. Typ het volgende in een terminal: perl REsynonym.pl regions_syn.fas
        OPMERKING: dit script zal het output_bestand regions_syn-re.fas maken.
    3. Kies een restrictie-enzym dat wordt gedeeld tussen synonieme sequenties van beide wildtype genen; Deze site zal worden gebruikt om chimeren te construeren via restrictie enzym digestie. Controleer dat het gekozen restrictie-enzym geen van de wildtype genen noch de pUC18 / 19 vectorsequenties snijdt.
      1. Vergelijk de restrictie-enzymen die gevonden zijn in de genes_re.fas-, pUC_re.fas- en regions_syn-re.fas-bestanden.
    4. In silico vervangt de originelen voor hun synoniem DNA sequenties op de overeenkomstige loci op beide wildtype genen. Voeg synoniem-DNA-sequenties toe in het wildtype sequentiebestand (genes.fas).
    5. Krijg de aminozuursequentie van genen die aanwezig zijn op het genes.fas bestand ( perl translate.pl genes.fas ).
    6. Richt de aminozuursequenties die zijn vertaald van wildtype- en synoniem-DNA-sequenties uit. Controleer of beide sequenties hetzelfde zijn.
    7. Herhaal alle stappen van dit gedeelte met het aanwezige ampR- gen op de pUC18 / 19 vector.
      OPMERKING: Het doel is om het ampR- gen (bestand ampR.fas) te verstoren in twee complementaire onderdelen. Het restrictie-enzym dat is geselecteerd om het ampR- gen te verstoren, moet verschillen van die welke gebruikt wordt voor chimera-assemblage.
  5. Onafhankelijke kloning van de twee wildtype genen in de geselecteerde pUC18 / 19 vector (Figuur 1, stap 3).
    1. Zuiver het gekozen pUC18 / 19 plasmide DNA met behulp van een plasmide DNA zuiveringsset.
      1. Bijvoorbeeld transformeer E. coli DH5a met pUC18 plasmide en groei de transformanten 's nachts bij 37 ° C op vaste LB-0,3 mg / ml ampicilline (Amp). Kies een transformantkolonie, injecteer een nieuwe LB-0.3 mg / mL Amp-plaat, en groei het overnacht bij 37 ° C.
      2. Neem deel uit van de vorige cultuur en groei het in vloeibare LB-0.3 mg / mL Amp gedurende 6-8 uur bij 37 ° C. Extracteer het plasmide-DNA met behulp van een kit.
    2. PCR amplificeert wildtype genen uit het totale genomische DNA met behulp van de appropRiate externe oligonucleotiden. Gebruik zo mogelijk een hoogwaardig DNA-polymerase. Selecteer het DNA-polymerase dat de opbrengst maximaliseert. Voer PCR uit volgens de richtlijnen van de fabrikant en de smeltemperatuur van de oligonucleotiden.
      1. Run PCR cycli, afhankelijk van het DNA polymerase, amplicon grootte, template en oligonucleotiden gebruikt. Om bijvoorbeeld rpoD DNA te amplificeren, berekent u een 50 μL reactie: 5 μl 10x buffer, 2 μl 50 mM MgS04, 1 μl 10 mM dNTP-mix, 2 μl van elk 10 μM oligonucleotide (tabel 2), 2 ΜL template DNA ( E. coli DH5a totaal DNA), 35,8 μl ultrazuiver water en 0,2 μl hoogwaardig DNA-polymerase. Voer de volgende PCR cycli uit: 1 minuut bij 94 ° C voor de initiële denaturatie gevolgd door 30 cycli van amplificatie (30 s bij 94 ° C tot denaturatie, 30 s bij 60 ° C om de oligonucleotiden te ontlasten en 2 min bij 68 ° C uit te breiden).
      2. Oplossen 1,2 g vanAgarose in 100 ml dubbel gedestilleerd water door ze te verwarmen in de magnetron. Monteer een gelbak en kam en zet ze in de horizontale gelaster. Vul de gelbak met de gesmolten agaroseoplossing en laat het stollen. Verwijder de kam.
      3. Plaats de gel in de elektroforese kamer. Vulkamer met 1x Tris-acetaat-EDTA buffer. Laad 50 μl PCR-producten in de gelputten. Elektroforeseer de monsters ( bijv . Bij 110 V gedurende 1 uur).
      4. Na elektroforese vlek de gel in 100 ml dubbel gedestilleerd water met 100 μl 1 mg / ml ethidiumbromide oplossing gedurende 10 minuten met langzaam schudden. Was de gel in tweedestilleerde water gedurende nog eens 10 minuten in trage schudden; Gebruik een horizontale shaker.
        Let op: Ethidiumbromide is een giftige verbinding; Draag beschermende handschoenen en een katoen laboratoriumjas.
      5. Reinig wildtype gen DNA uit de overeenkomstige banden van de gel met behulp van een kit. Visualiseer de bands door de gekleurde gel in een UV-kamer te plaatsen (Aanbevolen golflengte: 300 nm). Bewaar de blootstelling van de gel tot een minimum. Gebruik een DNA-zuiveringsset en volg de instructies van de fabrikant.
        Let op: UV-straling is gevaarlijk; Draag een beschermend schild, een bril en een katoenlaboratoriumjas.
    3. Digest gezuiverde wildtype genen en pUC18 / 19 plasmide DNA met de restrictie enzymen volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik zo snel mogelijk spijsverteringsenzymen. Bijvoorbeeld verteer 6 μL pUC18 DNA (300 ng / μL) in 10 μl ultrauw water, 2 μl 10X buffer, 1 μl Kpn I restrictie enzym en 1 μl Xba I restrictie enzym. Laat de reactie gedurende 30 minuten bij 37 ° C achter.
      1. De restrictie-enzymen inactiveren volgens de richtlijnen van de fabrikant. Bijvoorbeeld, de dubbele spijsvertering reactie Kpn I- Xba I bij 80 ° C gedurende 5 minuten inactiveren.
    4. Mix insert: vector DNA bij een volumetrische ratiO van 3: 1. Volg de instructies van de fabrikant voor een ligatie reactie. Gebruik zo snel mogelijke ligatie enzymen (laat de reactie bij 25 ° C gedurende 10 minuten).
      OPMERKING: Typisch is de DNA-concentratie na zuivering met behulp van de kits goed genoeg voor spijsvertering en ligatie reacties. Voeg bijvoorbeeld 6 μL rpoD DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μl), 3 μl pUC18 DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μl), 10 μl 2x buffer, 1 μl ultrapure Water en 1 μl T4 DNA ligase. Laat de ligatie reactie bij 25 ° C gedurende 10 minuten.
    5. Transformeer de E. coli DH5a met 2-4 μl van de ligeringsreactie, zoals beschreven in het Aanvullende Materialen. Platte de getransformeerde cellen in solide LB / Amp / X-gal / IPTG platen. Laat de platen overnacht bij 37 ° C.
    6. Selecteer witkleurige transformant E. coli kolonies en streep ze op een nieuwe LB / Amp plaat. Laat de borden overnacht bij 37 ° C liggen.
    7. Voer een koloniale PCR uit om kandidaten te kiezen voor het sequentiëren van de reactie, zoals beschreven in het Aanvullende Materialen. Extracteer plasmide DNA uit kandidaten. Alternatief verteer kandidaat plasmide DNA met dezelfde restrictie enzymen gebruikt voor het klonen van de inserts.
    8. Sequentie kandidaat constructies met een sequencing service provider 10 . Monteer de sequentie in silico met behulp van een DNA assembler 11 ( Figuur 1 , stap 5).
  6. Plasmidafbreking door PCR, gevolgd door restrictie-enzymvertering.
    1. Ontwerp in silico voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden bij pauze gebieden voor respectievelijk wildtype en ampR genen. Vervang in silico het wildtype fragment voor de overeenkomstige synoniem-DNA-sequentie (verkregen in stap 1.4).
      OPMERKING: Deze synoniem-DNA-sequentie bevat een restrictie-enzymplaats. Voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden overlappen bij tHij restrictie enzym site. Oligonucleotiden moeten variëren van 21-27 nucleotiden, eindigen met een cytosine of guanine, en bevatten een restrictie-enzymplaats. Een voorwaartse oligonucleotide heeft dezelfde sequentie als zijn doelgebied op het template DNA. Een omgekeerd oligonucleotide is de omgekeerde complementaire sequentie van het doelgebied op het template DNA.
    2. Gebruik de twee wildtype genconstructies als het DNA-sjabloon voor PCR-reacties ( bijv. PUC18 rpoD en pUC18 sigA ). Verkrijg twee complementaire delen van elke constructie (pUC18 rpoD σ1 -σ2, pUC18 rpoD σ3 -σ4, pUC18 sigA σ1 -σ2 en pUC18 sigA σ3-σ4) ( Figuur 1 , stap 6).
    3. Laad DNA-monsters in een agarosegel 1-1,2% [w / v]. De PCR-producten scheiden van de DNA-sjabloon door elektroforese ( bijv. 110 V gedurende 1 uur). Alternatief, verteer de PCR-reacties met Dpn I om de DNA-sjabloon te breken.
      OPMERKING: DpnIk enzym herken slechts gemethyleerde DNA sequenties (5'-GATC-3 ').
      1. Zuiver de monsters met behulp van een DNA zuiveringsset. Volg de richtlijnen van de fabrikant.
    4. Dubbele verteer alle complementaire DNA-fragmenten met de juiste restrictie-enzymen volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik, indien mogelijk, snel-verterende restrictie-enzymen. Dubbele verteer het pUC18rpoDσ1-σ2 DNA fragment met Afl II en Spe I met behulp van het protocol van de fabrikant. Laat de spijsverteringsreactie bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
    5. De restrictie-enzymen inactiveren volgens de richtlijnen van de fabrikant. Bijvoorbeeld, inactiveer Afl II- Spe I bij 80 ° C gedurende 20 minuten.
  7. Plasmideherstel met behulp van DNA-ligatie en bacteriële transformatie.
    1. Meng de juiste DNA-fragmenten in een volumetrische verhouding van 1: 1 om het gewenste chimere gen te assembleren ( Figuur1, stap 7).
      OPMERKING: Op deze manier wordt de integriteit van het ampR- gen hersteld, waardoor een functioneel eiwit wordt geproduceerd.
      1. Meng bijvoorbeeld 4 μL pUC18 rpoD σ1 -σ2 DNA (verteerd met Afl II- Spe I, 150 ng / μl), 4 μl pUC18 sigA σ3-σ4 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μl), 10 μl 2x buffer, 2 μl ultrapure water en 1 μl T4 DNA ligase; De DNA-concentratie na de zuivering van de kit is goed genoeg voor de spijsvertering en de daaropvolgende ligatie. Laat de ligeringsreactie bij 25 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Transformeer E. coli DH5a met 3-5 μl van de chimera assemblage ligatie reactie (Aanvullende Materialen). Groei de transformantcellen in LB / Amp / X-gal / IPTG-platen overnacht bij 37 ° C overnacht.
    3. Selecteer witkleurige transformant E. coli kolonies en streep ze op een nieuwe LB / Amp plaat. Laat de borden overnacht op 37° C.
    4. Voer een kolonie-PCR uit om kandidaten te kiezen voor een sequentierespons, zoals beschreven in de aanvullende materialen. Visualiseer bands in een 1-1,2% (w / v) agarosegel door elektroforese te verrichten (beschreven in stap 2.3.2.1).
    5. Kweek culturen van positieve kandidaten. Extract plasmide DNA van hen met behulp van een plasmide DNA zuivering kit.

2. Sequence Kandidaat Chimere Constructies

  1. Zorg ervoor dat de kwaliteit van het plasmide-DNA goed genoeg is voor de sequentiereactie door richtlijnen van de sequentie dienstverlener te volgen. Extract DNA met behulp van zuiverings kits. Bijvoorbeeld, op de internetpagina van de sequentieverlener, speciale aandacht besteden aan de aanbevolen DNA-concentratie voor de monsters. Verkrijg de concentratie van monsters met behulp van een DNA-kwantificeringsinstrument.
  2. Sequentie kandidaat chimere constructies met een sequencing service provider 10 .
  3. Assemble se Quencing leest met een in silico DNA assembler 11 .
  4. Uitgelijnd gemonteerd versus in silico- ontworpen chimere sequenties met behulp van sequentie-uitlijngereedschappen 9 , 12 . Controleer of het chimere gen succesvol is gesmolten.

3. Voorbereidingen maken

OPMERKING: Alle stappen die levende cellen betreffen, dienen in een schone laminarstroomkap met de Bunsen-brander te worden uitgevoerd.

  1. Het produceren van E. coli DH5a-bevoegde cellen.
    1. Om E. coli -competente cellen te produceren, volgt u gepubliceerde protocollen 13 of zie de aanvullende materialen . Alternatief gebruik commercieel beschikbare bevoegde cellen.
  2. Transformeren van E. coli DH5a-bevoegde cellen.
    1. Voor de chemische transformatie van E. coli culturen, volg de gepubliceerde protocollenClass = "xref"> 13 of zie de aanvullende materialen . Alternatief gebruik elektroporatie voor bacteriële transformatie. Als er gebruik wordt gemaakt van commercieel beschikbare bevoegde cellen, volg de richtlijnen van de fabrikant.
  3. Het zuiveren van genomisch en plasmide DNA van E. coli DH5a.
    1. Voer nucleïnezuurxtractie uit, zoals vermeld in de aanvullende materialen , met gebruik van commercieel verkrijgbare kits of volgende gepubliceerde protocollen 13 .
  4. Voer kolonie-PCR uit.
    1. Gebruik deze techniek om kandidaat-transformantkolonies te identificeren voor de volgende sequentiereactie.
      OPMERKING: Deze methode vertegenwoordigt geen definitieve verificatie van de integriteit van de sequenties. Een gedetailleerde beschrijving van deze techniek is beschikbaar in de aanvullende materialen .
  5. De oplossingen voorbereiden.
    1. Zien Tabel 1 voor meer informatie over het oplossen van de oplossing.
  6. Download de scripts en volgordebestanden die nodig zijn voor het CAPRRESI-protocol.
    1. Download genbank bestanden die de volledige genoomsequentie van de gewenste soort bevatten, verwijder de DNA sequentie van het gekozen gen met behulp van een genoom browser en sla het op in fasta bestandsformaat. Download de Perl-scripts die nodig zijn voor het CAPRRESI-protocol. Bewaar de scripts en de volgordebestanden in dezelfde map.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont CAPRRESI. Met behulp van deze methode werden twee chimere genen samengesteld door de domeinen van twee bacteriële primaire sigma factoren ( dwz E. coli RpoD en R. etli SigA) uit te wisselen. De DNA sequenties van de rpoD- en sigA- genen werden verkregen met behulp van de Artemis Genome Browser 14 van respectievelijk GenBank genoombestanden NC_000913 en NC_007761. De DNA sequentie van de pUC18 vect...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CAPRRESI is ontworpen als een alternatief voor de PRM 2 . De originele PRM is een krachtige techniek; Het maakt het mogelijk de DNA-sequenties te combineren langs elk deel van de geselecteerde genen. Voor PRM moeten wildtype genen in hetzelfde plasmide worden gekloneerd. Daarna worden oligonucleotiden ontworpen binnen wildtype en antibiotica resistentie genen gevonden op het plasmide. Plasmidafbreking wordt bereikt door PCR met behulp van stompe, hoogwaardige DNA-polymerasen en eerder ontworpen o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia en Tecnología, CONACYT, México (subsidie ​​nummer 154833) en Universidad Nacional Autónoma de México. De auteurs bedanken Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos en Soledad Juárez voor hun administratief en technisch advies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Platinum Taq DNA polymerase High FidelityThermo Fisher11304011Produces een mix van blunt/3’-A overhang ended PCR producten
High pure plasmid isolation kitRoche11754785001Gebruikt voor alle plasmide zuiveringsreacties
High pure PCR product purification kitRoche11732676001Gebruikt voor alle PCR zuiveringsreacties uit agarose gels
AflII restrictie-enzymNew England BiolabsR0520LHerkent sequentie 5’-CTTAAG-3’ en snijdt bij 37 °C
KpnI-HF restrictie-enzymNew England BiolabsR3142LHerkent sequentie 5’-GGTACC-3’ en snijdt bij 37 °C
SpeI-HF restrictie-enzymNew England BiolabsR3133LHerkent sequentie 5’-ACTAGT-3’ en snijdt bij 37 °C
XbaI restrictie-enzymNew England BiolabsR0145LHerkent sequentie 5’-TCTAGA-3’ en snijdt bij 37 °C
Ampicilline natriumzoutSigma AldrichA0166-5GAntibiotica
NalidixinezuurSigma AldrichN8878-5GAntibiotica
GistextractSigma AldrichY1625-1KGBacteriecultuur
Caseïne peptonSigma Aldrich70171-500GBacteriecultuur
NaClSigma AldrichS9888-1KGNatriumchloride
AgarSigma Aldrich05040-1KGBacteriecultuur
XbaI restrictie-enzymThermo FisherFD0684Snel verteerd XbaI enzym
KpnI restrictie-enzymThermo FisherFD0524Snel verteerd KpnI enzym
Quick Ligation KitNew England BiolabsM2200SSnel DNA ligatiekit
AflII restrictie-enzymThermo FisherFD0834Snel verteerd AflII enzym
SpeI restrictie-enzymThermo FisherFD1253Snel verteerd SpeI enzym

Referenties

  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
  3. Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  5. Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
  6. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  7. Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
  8. Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
  9. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  10. Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp (2016).
  11. Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: http://www.chevreux.org/thesis/index.html 1-161 (2005).
  12. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
  14. Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Synonieme DNA-sequentiesanalyse met Perl-scriptontwerp van oligonucleotidenPCR-amplificatiegelzuiveringDNA-ligatie
CAPRRESI: Chimera Assembly Door Plasmide Recovery En Restriction Enzyme Site Insertion
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.