In Vitro Methoden voor het vergelijken van Target Binding en CDC Inductie Tussen Therapeutische Antilichamen: Toepassingen in Biosimilarity Analysis

Summary

Dit protocol beschrijft de in vitro vergelijking van twee belangrijke functionele kenmerken van rituximab: target binding en complement-dependent cytotoxicity (CDC) inductie. De methoden werden gebruikt voor een vergelijking tussen referentie rituximab en een rituximab biosimilar. Deze analyses kunnen worden gebruikt bij biosimilar ontwikkeling of als kwaliteitscontrole in hun productie.

Abstract

Therapeutische monoklonale antilichamen (mAbs) zijn op de behandeling van verschillende ziekten, waaronder kanker betrokken. De ontwikkeling van de biosimilar mAbs door farmaceutische bedrijven is een markt kans, maar het is ook een strategie om de drug de toegankelijkheid te verhogen en-therapie bijbehorende kosten te verlagen. De protocollen hier beschreven beschrijven de evaluatie van target binding en CDC inductie door rituximab in Daudi cellen. Deze twee functies vereisen verschillende structurele gebieden van het antilichaam en het klinische effect geïnduceerd door rituximab relevant zijn. De protocollen maken de zij-aan-zij vergelijking van een referentie rituximab en rituximab biosimilair gebracht. De geëvalueerde producten toonden verschillen, zowel in target binden en CDC inductie, wat suggereert dat er onderliggende fysisch-chemische verschillen en het benadrukken van de noodzaak om de gevolgen van die verschillen in de klinische setting te analyseren. De hier beschreven methoden vormen eenvoudig en goedkoop in vitro </ Em> modellen voor de evaluatie van de activiteit van rituximab biosimilars. Zo kunnen ze nuttig zijn bij biosimilar ontwikkeling, evenals voor kwaliteitscontrole bij biosimilar productie. Bovendien kunnen de gepresenteerde methoden worden geëxtrapoleerd aan andere therapeutische mAbs.

Introduction

Therapeutische antilichamen zijn recombinante monoklonale antilichamen (mAbs) ontwikkeld voor de behandeling van verschillende pathologieën, waaronder kanker, auto-immuun en chronische ziekten, neurologische stoornissen en anderen ¹ . Momenteel heeft de FDA goedkeuring verleend aan meer dan 40 therapeutische mAbs, en er wordt verwacht dat de markt de komende jaren zal bereiken.

Rituximab is een chimerisch monoklonaal IgG1-antilichaam met hoge affiniteit, goedgekeurd voor de behandeling van CD20 ⁺ B-cel niet-Hodgkin's lymfoom (NHL), CD20 ⁺ folliculaire NHL, chronische lymfocytische leukemie en reumatoïde artritis ^{2 , 3} . De herkenning van CD20, die overexpressieert in B-cellen, door rituximab induceert apoptose; Complement activatie; En antilichaamafhankelijke cel gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) ³ . De octrooien van dit geneesmiddel verlopen in Europa en in de VS in 2013 en 2016, Respectievelijk. Zo ontwikkelen farmaceutische bedrijven wereldwijd rituximabbiosimilars. Zoals bij een ander geneesmiddel voor menselijke consumptie, biosimilars vereisen goedkeuring van regelgevende agentschappen. Internationale richtlijnen wijzen erop dat biosimilariteit voor mAb's moet worden aangetoond door de fysicochemische eigenschappen, farmacokinetiek, werkzaamheid en veiligheid van de nieuwe en referentieproducten ^{4 te} vergelijken.

Bijgevolg moeten de methoden die in dergelijke vergelijkingen worden gebruikt, de structurele en functionele eigenschappen van de mAb's beoordelen, met name die met klinische relevantie. Daartoe tonen in vitro analyses verschillende voordelen ten opzichte van in vivo experimenten (beoordeeld in Chapman et al. ) ⁵ : i) in vitro studies zijn gevoeliger voor verschillen tussen de voorgestelde biosimilar en het referentieproduct; Ii) in vivo studies moeten worden uitgevoerd in relevante soorten, die voor veel mAbs zijnniet-menselijke primaten; en iii) omdat het werkingsmechanisme, preklinische toxicologie en klinische effecten van het referentieproduct zijn welbekend in vivo studies met biosimilaire kunnen aanvullende nuttige informatie wordt gegeven. Dienovereenkomstig, Begeleiding van de Europese Unie voor biosimilars laat kandidaten om klinische proeven op basis van robuuste in vitro data alleen ⁶ in te voeren.

Hier presenteren we twee snelle, economische en simpele testen die de biologische activiteit van rituximab te evalueren met behulp van CD20 ⁺ gekweekte cellen. Deze tests kunnen worden opgenomen als onderdeel van de vergelijkbaarheid oefening voor rituximab biosimilar kandidaten.

Protocol

1. Evaluatie van Target Binding met flowcytometrie

1. Bereiding van biologische materialen en reagentia
   1. Zorg 500 ml RPMI kweekmedium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (H-IFBS).
   2. Lymphoma (Daudi) cellen cultuur Daudi Burkitt's en Daudi GFP ⁺ cellen met behulp van RPMI en ^75-cm2 kweekflessen. Handhaaf de kweken bij 37 ° C in een 5% _CO2 bevochtigde atmosfeer totdat ze bereiken 6 - 9 x 10 ⁵ cellen / ml.
   3. Voeg 50 ml vlekken buffer door verdunning van 1/100 H-IFBS in PBS; Deze buffer is stabiel bij 2-8 ° C gedurende ten minste één maand.
   4. Bereid de testoplossingen voor referentie en biosimilar mAbs. Voeg ten 1: 2 seriële verdunningen (500 pl elk) in buffer kleuring, uitgaande van 5 ug / ml.
   5. Met kleuringsbuffer menselijk IgG (isotype controle) verdund tot 5 ug / ml en PE-Cy5 muis-anti-humaan IgG (secundair antilichaam) aan de conCentratie voorgesteld door de fabrikant.
   6. Bereid 4% paraformaldehyde in PBS (fixatiebuffer).
2. Doelbinding
   1. Verzamel de Daudi en Daudi GFP ⁺ cel suspensies van de 75 cm ² kweek flessen en overbrengen ze naar een 15 ml centrifuge buis. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
   2. Was de cellen door 5 ml PBS toe te voegen en de cel suspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten centrifugeren.
   3. Resuspendeer de cellen in PBS en voer een celtelling en levensvatbaarheidsanalyse met trypan blauw uit. Gebruik culturen met cellevendigheidsniveaus ≥ 95% voor de analyse.
   4. Verdun de cel suspensie naar 4 x 106 cellen / ml met koude kleuring buffer.
   5. Voeg in 1,5 ml microcentrifugebuizen 50 μL van de celsuspensie toe aan 100 μL van de verschillende testconcentraties van de referentie of biosimilar mAbs. Inclusief replicaten voor elke experimentele conditie.
   6. Bereid extra buizen voor deisotype controle (humaan IgG1 plaats van rituximab) en negatieve controle (secundair antilichaam zonder primair antilichaam).
   7. Incubeer bij 4 ° C gedurende 20-30 min.
   8. Was de cellen door toevoeging van 1 ml PBS en centrifugeren van de celsuspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 10 ° C. Verwijder het supernatant.
   9. Suspendeer de cellen in 100 ul van het secundaire antilichaam en incubeer gedurende 20-30 min bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
   10. Was de cellen tweemaal met PBS en suspendeer deze in 200 ul fixatiebuffer.
   11. Analyseer de cellen op een flowcytometer.
       Opmerking: Het signaal blijft stabiel gedurende verscheidene dagen indien de monsters bij 4 ° C worden bewaard en beschermd tegen licht.
3. data acquisitie
   1. Open twee dot-plots in een werkblad van de flowcytometer besturingssoftware. Stel de FSC-A versus FSC-H in de eerste en FSC-A versus SSA-A in het tweede. Open een histogram voor de PE-Cy5 kanaal.
   2. In de FSC-A versus FSC-H plot, maak een poort (R1) singlet events ( Figuur 1A ).
   3. Stel de R1-populatie in de FSC-A versus SSA-A-stip en maak vervolgens een nieuwe poort (R2) die doelcellen selecteert ( Figuur 1B ). Stel de R2-bevolking in het PE-Cy5-intensiteitshistogram in om de frequentieverdeling van de cellen te bekijken.
   4. Pas de onderste fluorescentie-intensiteit (FI) -grens voor het PE-Cy5-kanaal aan met behulp van de negatieve en isotype-besturing ( Figuur 1C ).
   5. Verkrijg 10.000 gebeurtenissen binnen R2 van het monster met de hogere concentratie van het referentieproduct. FI van deze steekproef moet de hoogst verwachte zijn ( Figuur 1C ).
   6. Verkrijg de rest van de monsters.
   7. Voor elk monster, ontvang de mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) in het PE-Cy5-kanaal.
   8. Voor monsters met de referentie of biosimilar mAb, bereken het verschil tussen monster MFI en die van de isotype control (ΔMFI).

2. Beoordeling van CDC

1. Bereiding van biologische materialen en reagentia
   1. Bereid celkweekmedium en cultuur Daudi en Daudi GFP ⁺ cellen, zoals hierboven beschreven (stappen 1.1.1 - 1.1.2).
      OPMERKING: Daarnaast is de CDC test vereist serum-vrij RPMI.
   2. Verdund normaal menselijk serum complement (NHSC) 1: 2 met serumvrij RPMI. Bereid 2,5 ml.
   3. Bereid 1 ml met warmte geïnactiveerde (30 min / 56 ° C) NHSC 1: 2 verdund met RPMI.
   4. Bereid testreeksen oplossingen voor de referentie en biosimilar mAbs in serumvrij RPMI. Voeg ten verdunningen (200 pl elk) 1-0,025 gg / ml.
2. CDC-assay
   1. Verzamel de Daudi en Daudi GFP ⁺ cellen uit de kweken en kwantificeren van de cellevensvatbaarheid (zie stap 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Bereid een celsuspensie met 4 x 10 ⁵ cellen / ml in serumvrij RPMI.
   3. Toevoegen50 μl cel suspensie aan 50 μl van elke referentie of biosimilar mAb test concentratie in 96-putjes conische (V) -bottom microplaten. Inclusief replicaten voor elke experimentele conditie.
   4. Bijkomende putjes voorbereiden voor de negatieve controle ( dwz zonder mAb), basale sterftebeheersing ( bijv. Warmte-geïnactiveerde NHSC in aanwezigheid van mAb), en positieve controle kleuren ( dat wil zeggen cellen blootgesteld aan 50 μL 70% EtOH).
   5. Incubeer de cellen gedurende 20 - 30 min bij 37 ° C in een 5% CO ₂ bevochtigde atmosfeer.
   6. Voeg 50 μL NHSC (verdund 1: 2) toe aan elke put en incuberen de opsoniseerde cellen gedurende 2,5 uur bij 37 ° C in een 5% CO ₂ bevochtigde atmosfeer. Gebruik warmte-geïnactiveerde NHSC in de basale sterfte controle bronnen.
   7. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 10 ° C. Gooi de supernatant weg.
   8. Was de cellen door 150 μl PBS toe te voegen en de cel suspensie gedurende 5 minuten bij 400 xg en 10 ° C centrifugeren. discard het supernatant.
   9. Vlekken op de monsters met 7-amino-actinomycine (7-AAD), zoals eerder beschreven ^{7, 8.}
   10. Analyseer de cellen op een flowcytometer op dezelfde dag.
3. data acquisitie
   1. Open twee dot-plots in een werkblad van de flowcytometer besturingssoftware. Stel de plots als in stap 1.3.1 - 1.3.3 (figuur 2A-B). Maak een derde grafiek die een dot-plot voor GFP versus 7-AAD de R2 populatie.
   2. Definieer de passende FI grenzen met de Daudi-cellen, Daudi GFP ⁺ cellen en dood positieve controle (Figuur 2C).
   3. Voor elk monster meet het percentage van 7-AAD ⁺ doelcellen. Verwerven ten minste 5000 gebeurtenissen uit R2.
   4. Bereken de specifieke mAb geïnduceerde cytotoxiciteit door het aftrekken van het percentage 7-AAD ⁺ in de basale dood besturing van het percentage gevonden in monsters met verschillenConcentraties van mAbs ( Figuur 2D ).

3. Biosimilarity Analysis

1. Voer de concentratie- en reactiewaarden in in een grafische software.
2. Grafieken genereren en niet-lineaire regressies berekenen met de volgende overwegingen: i) gebruik de log-transformatie van de mAb-concentratie als "X"; Ii) gebruik het variabele helling wiskundige model (Y = minimale respons + (maximale respons - minimale respons) / 1 + 10 ^ ((LogEC ₅₀ -X) * Hill helling)); En iii) de bodemwaarden tot nul beperken, omdat de basale reactie is afgetrokken.
   OPMERKING: Curves met een symmetrische sigmoïdale vorm worden verwacht.
3. Vergelijk beide niet-lineaire pasjes met een globale fit met behulp van een F-test (veel grafische software bevat deze functie).
   OPMERKING: Dergelijke tests stellen als de nulhypothese vast dat de maximale respons, logEC ₅₀ en de Hill-helling hetzelfde zijn voor de twee datasets, die overeenkomt met deBiologische vraag die bestemd is om te worden aangepakt.

Results

Met behulp van de hierboven beschreven protocollen werden de doelbinding en de CDC-inductie van referentie-rituximab in parallel vergeleken met die van een biosimilar rituximab, geproduceerd en in de handel verkrijgbaar in Azië.

In Daudi cellen gebonden beide mAbs CD20 op een concentratieafhankelijke wijze ( Figuur 1D ). Niet-lineaire regressies van bindende gegevens vertoonden een r2 van 0.978 en 0.848 voor r...

Discussion

Het octrooivertreden van een therapeutisch mAb bevordert de ontwikkeling van biosimilaren. Zo is er behoefte aan eenvoudige methoden die verschillen kunnen identificeren in klinisch relevante activiteiten van deze producten. CD20 ⁺ gekweekte cellen werden gebruikt voor de evaluatie van twee belangrijke functionele kenmerken van rituximab: target binding en CDC inductie. De vroegere activiteit vereist de herkenning van CD20 door het Fab-gebied van het mAb, terwijl de laatste vooral afhankelijk is van de intera...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Wijzig het medium afhankelijk van de cellijn
Trypan Blue oplossing	Sigma	T8154	0,4%, vloeibaar, sterieel gefilterd, geschikt voor celkweek
Daudi Burkitt's Lymphoma Cellen	ATCC	CCL-213	Je kunt de cellijn aanpassen afhankelijk van het antilichaam van belang
Fetaal bovien serum (FBS)	GIBCO	16000-044	Je kunt de bron van serum aanpassen afhankelijk van de vereisten van de cellijn
Normaal Humaan Serum Complement	Quidel	A113	Het is daarom geschikt voor gebruik in biocompatibiliteitsexperimenten, inclusief medicijnontwikkeling, biomaterialentesten en andere toepassingen
7AA-D	BDPharmigen	559925	Je kunt een breed scala aan kleuropties gebruiken, compatibel met de meeste instrumentconfiguraties voor het analyseren van levensvatbaarheid.
PECy5 Muis Anti-mens IgG	BDPharmigen	551497	Verander fluorochroom afhankelijk van de filter en laser van je flowcytometer
Menselijke IgG Isotype Controle	ThermoFisher Scientific	07-7102	Verander afhankelijk van mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixatie Buffer (1 - 4% formaldehyde of paraformaldehyde)
PBS pH 7.4 10x (Fosfaat buffer saline)	GIBCO	70011-044	Fosfaatbuffer zonder Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] en endotoxine vrij.
Celcultuur platen 96 wel, V-bodem	Corning	29442-068	12 x 75 mm ronde bodem testbuisjes of 96-wel V- of U-bodem microtiterplaten
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Referentieproduct
Rituximab	Indiaas	—	Biosimilar product
15- of 50-mL conische centrifugeerbuisjes	Corning	430290 of 430052	—
Pipet tips	Eppendorf	—	Meerdere volumeconfiguraties zijn noodzakelijk
Pipetten	Eppendorf	—	Instelbare volume pipetten zijn noodzakelijk
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Gekoelde variabele snelheid centrifuge (4 tot 25 °C) met snelheden variërend van 10 tot 30.130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III of andere flow cytometer
Olympus optische en lichtmicroscoop	Olympus	—	Om celgroei te kwantificeren en evalueren
Incubator	SANYO	—	Incubator voor temperatuur en CO2 controle om cellen te kweken
Biologische Veiligheidscabinet	CHC BIOLUS	—	Biologische veiligheidskast die wordt gebruikt om de onderzoeker, het product en het milieu te beschermen.