Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Summary

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Abstract

Monolaag celcultuur niet adequaat model van de in vivo gedrag van weefsels, die complexe cel-cel en cel-matrix interacties omvat. Driedimensionale (3D) celkweektechnieken een recente innovatie ontwikkeld om de tekortkomingen van hechtende celkweek pakken. Hoewel verschillende technieken voor het genereren van weefsel analogen in vitro ontwikkeld, deze werkwijzen zijn vaak complex, duur om, vereisen gespecialiseerde apparatuur en meestal beperkt door verenigbaarheid met slechts bepaalde celtypen. We beschrijven hier een snelle en flexibele protocol voor het aggregeren cellen tot multicellulaire sferoïden 3D consistente grootte die compatibel is met een groei van verschillende tumor en normale cellijnen. Wij gebruiken variërende concentraties serum en methylcellulose (MC) om verankering-onafhankelijke sferoïde generatie bevorderen en op zeer reproduceerbare wijze de vorming van celmonolagen. Optimale omstandigheden voor individual cellijnen kunnen worden verwezenlijkt door de MC of serumconcentraties in het bolvormige formatie medium. De 3D sferoïden gegenereerd kan worden verzameld voor gebruik in een breed scala van toepassingen, waaronder cell signaling of gene expression studies, testgeneesmiddel screening, of de studie van cellulaire processen zoals tumorcel invasie en migratie. Het protocol wordt ook direct aangepast om klonale sferoïden van enkelvoudige cellen genereren, en kan worden aangepast om verankering-onafhankelijke groei en anoikis weerstand beoordelen. Overall, ons protocol bevat een gemakkelijk aanpasbaar werkwijze voor het genereren en gebruik 3D cellen sferoïden om de 3D micromilieu van weefsels recapituleren en het model van de in vivo groei van normale en tumorcellen.

Introduction

Biologisch relevante beoordeling van het gedrag van tumorcellen is een uitdaging met behulp van traditionele tweedimensionale (2D) celcultuur methoden, deels omdat deze niet voldoende afgestemd op het cel micro-omgeving gevonden in vivo. Alternatieve benaderingen waarin extracellulaire matrixcomponenten in de cultuur (bijvoorbeeld Boyden kamer assays) zijn fysiologisch representatief voor de in vivo weefselomgeving. Echter kunnen deze worden beperkt tot beoordeling van individuele gedrag van cellen en kan het complex in vivo combinaties van cel-matrix en cel-cel interacties die bijdragen aan weefsel of tumorgroei ^{1, 2, 3} niet herhalen.

Het gebruik van multicellulaire sferoïden is een recente aanpak die nauwkeuriger reproduceert de compacte architectuur van in vivo celgroei ^1,4. Sferoïden kunnen worden gebruikt om cel-matrix interacties van normale cellen te onderzoeken, maar kan ook als tumor analogen kenmerken van tumorprogressie, zoals metastatische groei of geneesmiddelresistentie ⁴ modelleren.

Sferoïden worden gevormd door de proliferatie van afzonderlijke cellen ingebed in een matrix ^5, of sneller, door het bevorderen van de aggregatie van meerdere cellen aan een cluster cellen (bv opknoping druppel, centrifugatiewerkwijzen) ^{6, 7} vormen. Bestaande cel aggregatie technieken kunnen kostbare materialen of gespecialiseerde apparatuur nodig. Bovendien hebben deze bolletjes hebben een breed scala aan afmetingen en morfologieën en kan moeilijk te produceren in grote hoeveelheden, het vergelijken van kweekomstandigheden of behandelingen moeilijk. Tenslotte kunnen sferoïden die door deze werkwijzen moeilijk te isoleren uit het eiwitmateriaal extracellaire matrix waarin ze zijn ingebed voor gebruik in andere toepassingen.

Hier beschrijven we een robuuste en gemakkelijk aanpasbaar celaggregatie methodologie voor de snelle vorming van gelijkvormige cellen sferoïden gebruikmaking van commercieel verkrijgbare U-bottom cell afstotend platen en een inert adhesiebevorderende matrix, methylcellulose. Eenmaal gevormd, worden deze multicellulaire sferoïden eenvoudig worden geïsoleerd voor gebruik in een breed scala van toepassingen. Het protocol is ook gemakkelijk aangepast sferoïden door middel van celproliferatie, die kunnen worden gebruikt om andere celprocessen beoordelen genereren. Hier tonen wij celinvasie assays gekwantificeerd door immunofluorescentie kleuring en een anoikis assay, zoals bijvoorbeeld toepassingen van deze twee sferoïde vorming protocollen.

Protocol

LET OP: Alle reagentia en hulpstoffen worden opgenomen in de Materials List.

1. Sferoïde productie door Cell Aggregation

1. Methylcellulose oplossing: Bereid 100 ml 100 mg / ml methylcellulose.
   1. Warmte 50 ml ultrapuur H ₂ O tot 80 ° C. Voeg 10 g methylcellulose poeder en schud totdat de deeltjes gelijkmatig worden verspreid.
   2. Breng eindvolume met koude ultrapuur H ₂ O en roer bij 4 ° C totdat de oplossing helder wordt, stro gekleurd en bevat geen zichtbare vaste stoffen.
   3. Passeren door een 0,45 urn filter om onopgeloste vaste stoffen te verwijderen. Bereide oplossing worden hoeveelheden verdeeld en maximaal 12 maanden bewaard bij 4 ° C.
      OPMERKING: Methylcellulose vormt een niet-cytotoxisch, inert, suspendeermiddel tot cel-cel adhesie te verbeteren en ontmoedigen de vorming van een hechtende monolaag. Methyl cellulose is oplosbaar in water en weg kan volgende koba worden gewassenoid generatie.
2. Sferoïde formatie medium
   LET OP: Bereid sferoïde vorming medium onmiddellijk voor gebruik. Niet bewaren.
   1. Methylcellulose verdunde oplossing van 1-5 mg / ml in het juiste kweekmedium.
   2. Passeren door een 0,22 pm filter te steriliseren en te verwijderen onopgeloste vaste stoffen.
3. Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
   1. Verdun tot 1x en passeren door een 0,45 pm filter voor gebruik. Bereide oplossing kan onbeperkt worden bewaard bij kamertemperatuur.
4. Cel sferoïde productie (figuur 1)
   OPMERKING: Bereid alle reagentia vooraf. Het is belangrijk om besmetting van oplossingen door stof, vezels of andere onoplosbare deeltjes te voorkomen. De aanwezigheid van deze contaminanten zal aantasten sferoïde vorming. Kweekmedium en andere oplossingen moeten worden door een 0,45 urn filter om deze deeltjes te verwijderen wanneer poslijk. Gebruik geen katoen gefiltreerd pipetten bij het overbrengen van oplossingen als deze extra vezels kunnen introduceren.
   1. Cultuur celmonolagen tot 70% confluentie in het juiste kweekmedium aangevuld met 10% serum. Aspireren kweekmedium en spoel met 1x PBS om vuil te verwijderen. Voeg 3 ml trypsine-EDTA (0,05% trypsine) dissociatie buffer een 10 cm celkweekschaal en incubeer cellen bij 37 ° C en _5% CO2.
   2. Inspecteer cellen onder de microscoop bij 10x vergroting onthechting te bevestigen. Neutraliseren dissociatie buffer met 7 ml-serum aangevuld kweekmedium.
   3. Centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 10 min zachtjes pellet cellen.
   4. Verwijder supernatant. Resuspendeer celpellet in 1 ml bolvormige formatie medium met behulp van een P1000 pipet met een filter tip.
      NB: De celsuspensie moet vrij zijn van klonten zijn.
      1. Naar cel pellet vermaal, drukt u op de pipet tip tegen de bodem van de buis onder een lichte hoek, terwijlpipetteren naar cel pellet te scheren. Vermijd tritureren meer dan 3-5 keer deze cellen kan beschadigen. Pipet langzaam en niet gehele inhoud van de pipet tip verdrijven om te voorkomen dat het creëren van bubbels.
   5. Aantal cellen met een hemocytometer en verdunde celsuspensie tot 1 x 10 ⁴ cellen / ml.
      OPMERKING: Het aantal cellen kan worden geoptimaliseerd om sferoïden van verschillende grootte te genereren. Trypan blauw kleuring van beschadigde cellen kunnen worden gebruikt om de levensvatbaarheid van geresuspendeerde cellen bevestigen.
   6. Overdracht celsuspensie in een steriele, stofvrije multichannel pipet reservoir en het gebruik van filter tips om 100 ul af te geven in elk putje van een 96-wells U-bodem cel-afstotend plaat.
      1. Spoel het reservoir met gefilterd ultrapuur H ₂ O om stof en vezels te verwijderen.
      2. Meng de celsuspensie periodiek tijdens enten voorkomen cellen zich afzet op de bodem van het reservoir. Om te voorkomen dat het creëren van bubbels, gebruik maken van een omgekeerde pipetteertechniek tijdens het mengen en dispensing.
   7. Overdrachtsplaten weefselkweek incubator (37 ° C en _5% CO2) en dagelijks controleer sferoïde vorming. De cellen moeten naar de bodem van elk putje in 6 uur en in het algemeen samen te voegen tot een sferoïde binnen 24-48 h (figuur 2).
   8. Ter bevestiging van de succesvolle sferoïde formatie, gebruik dan een p10 tip en voorzichtig pipet medium over de bolvormige inachtneming onder een microscoop bij 10x vergroting. Behoorlijk gevormd sferoïden zullen los te maken van de plaat en roll, bevestigen van hun 3D-structuur.
      OPMERKING: Methylcellulose en serum concentraties worden bepaald door titratie voor elke cellijn vorming van een sferoïde opbrengst per putje. Voorwaarden op deze wijze geoptimaliseerd voor geselecteerde cellijnen zijn getoond in tabel 1, en voorbeelden van de sferoïden gevormd in figuur 2B. Sferoïden worden gekweekt langer dan aanbevolen, maar ze groter worden ze groeien steeds moeilijkerte hanteren zonder fragmentatie. Als cellen vormen een monolaag, satelliet sferoïden, of niet naar de bodem van de put, moet de concentratie van methylcellulose en serum verder worden aangepast voor optimale sferoïde vorming (Figuur 3B). Niet sferoïden bevat verontreinigingen zoals vezels of stof (figuur 3A) te gebruiken. Voorgevormde sferoïden kunnen worden behandeld met verbindingen van belang, zoals groeifactoren, live cell vlekken of remmers voor analyse.

2. Sferoïde Invasion Assay (figuur 4)

1. geneutraliseerd collageen
   1. Koel alle vloeistoffen tot 4 ° C en houd op ijs bij het werken met collageen om ongewenste polymerisatie te voorkomen.
   2. Bereid verse 0,1 M en 0,01 M oplossingen van NaOH en verse 0,1 M HCl in ultrapuur H ₂ O. Pass alle oplossingen door middel van 0,22 pm filters.
   3. Meng bovine type 1 collageen (3,1 mg / ml voorraad), 0,01 M NaOH en 10x PBS (8: 1: 1 volumeverhouding) en op pH 7,4 met koud 0,1 M NaOH en HCl. De eindconcentratie van collageen is 2,5 mg / ml.
   4. Bereid voldoende geneutraliseerd collageen om de afbeeldingsvat vullen tot een diepte van 2-3 mm. Een minimum van 100 ul vereist voor elk putje van de 8-well tissue kweekkamer slide in materialen opgesomd.
2. Inbedding sferoïden in collageen (figuur 4)
   1. Bedek de bodem van elk putje van een 8-well weefselkweek kamer dia met een minimum van 50 pi geneutraliseerde collageen.
      1. Gebruik reverse pipetteertechniek om te voorkomen dat bellen in het collageen. Gebruik de pipet tip om het collageen gelijkmatig verdeeld over het oppervlak goed.
         LET OP: Deze collageen basislaag zal bolletjes in suspensie te houden en is typisch 1-2 mm dik. De basislaag minimaliseert vorming van een meniscus op de bovenkant collageenlaag. Als de basislaag is te dun, kan sferoïden contact maken met de bodem van de kamer glijbaan envormen een cel monolaag.
   2. Plaats de kamer schuif, en een 35 mm weefselkweekplaat gevuld met ultrapuur H ₂ O, in een 10 cm weefselkweek schaaltje. Incubeer bij 37 ° C totdat het collageen wordt gepolymeriseerd, typisch 1 uur. Store resterende geneutraliseerd collageen op ijs.
      OPMERKING: De watergevulde 35 mm schotel zal vocht zorgen en uitdroogt. De kamer slide moet deze vochtkast verandert gedurende de meting blijven. Het collageen basislaag kan worden gedurende de nacht polymeriseren. Langere incubaties meestal tot gevolg dat stijver gel.
   3. Met behulp van een p1,000 filter tip, verzamelen voorgevormde sferoïden (stap 1.4.7) van de 96-well U-bodem cel-afstotend plaat 1,5 ml snap top buizen. Pipet langzaam en vermijd herhaalde of krachtig pipetteren om vloeistof-afschuiving van bolvormige deeltjes te minimaliseren. Meerdere sferoïden worden samengevoegd in een enkele buis voor overdracht naar een putje van de 8-well tissue kweekkamer slide.
   4. Centrifugeer de verzamelde sferoïden in een tabletop microcentrifuge bij 2000 xg gedurende 2-5 s en verwijder supernatant met behulp van een p200 pipet. Vermijd centrifugeren langer dan nodig is, omdat dit kan ertoe leiden dat de bolletjes breekt of samenklonteren.
      LET OP: Na het pipetteren van het grootste deel van de bovenstaande, de buis kan worden omgekeerd voorzichtig over een schone papieren handdoek om weg lont overtollige vloeistof. Sta niet toe dat bolvormige deeltjes te drogen.
   5. Met behulp van een breed boring P200 tip, zachtjes resuspendeer sferoïden in 50 ul geneutraliseerd collageen. Doe dit voor elke buis van de verzamelde sferoïden voordat er sferoïden worden overgebracht in de kamer dia. Houd bolvormige deeltjes die zijn gesuspendeerd in geneutraliseerd collageen op ijs pas klaar voor overdracht naar de kamer dia's.
   6. Verwijder kamer dia uit incubator en zorgvuldig pipet de bolvormige collageen-mengsel op de top van collageen basislaag. Incubeer bij 37 ° C en _5% CO2 totdat collageen wordt gepolymeriseerd.
      1. Heeft gehele inhoud van de pipet niet afzien om te voorkomen dat het creëren van bubbels. Dropwise pipetteren vermindert de kans op verstoring van de collageen basislaag.
   7. Voeg langzaam minste 100 ul verwarmd kweekmedium gewenste chemoattractanten, remmers of andere behandelingen aan elk putje van de kamer schuif. Het collageen laag met bolletjes kan scheuren als vloeistof op het te heftig wordt gepipetteerd. Kweekmedium langzaam kan worden afgegeven aan de zijkant van een goed om te voorkomen dat het verstoren van de collageen.
   8. Incubeer kamer glijbaan bij 37 ° C en 5% CO ₂ tot celinvasie mogelijk. Invasie in het omringende collageen kan worden waargenomen door helderveld of fluorescentiebeeldvorming en gekwantificeerd door een verscheidenheid van methoden waarbij epifluorescentie, confocale microscopie of lichtwaaier.

3. Kwantificering van Invasion: Helderveld Microscopy

1. Op gezette tijdstippen, het collageen-ingebedde bolletjes bij 10x vergroting met behulp van een helderveld microscoop (stap 2.2.8).
   LET OP: Voorlangere termijn levende cellen experimenten, een verwarmde microscoop podium en CO ₂ gereguleerde kamer kan worden gebruikt om sferoïden bij 37 ° C en 5% CO ₂ tijdens beeldvorming handhaven.
2. Kwantificeren invasiviteit gebruik van software zoals ImageJ het aantal cellen invasie in de omringende collageen en de gemiddelde afstand binnengedrongen op elk tijdstip te meten.

4. Kwantificering van Invasion: fluorescentiemicroscopie met Live Cell Stain

1. Na stap 2.2.8, vullen het medium in de kamer dia met een fluorescentiekleurstof zoals DAPI, calceïne AM, of andere cel bijhouden verbinding wenselijk de cellijn volgens de instructies van de fabrikant.
   Opmerking: Voor kwantificering van invasiviteit, homogene kleuring gehele bolvormige niet essentieel. Voor toepassingen die diepere penetratie van de vlek, langere incubatie (> 3 uur) nodig zijn.
2. Verwijder de vlek en te vervangen door 500 ul warm 1x PBS. Incubate bij 37 ° C gedurende 10 minuten om de overmaat kleuring te verwijderen. Herhaal dit een minimum van twee keer.
3. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop, verwerven optische doorsneden door de binnenvallende sferoïden.
   LET OP: Langdurige blootstelling aan laserlicht moet worden geminimaliseerd tijdens repetitieve beeldvorming om fototoxiciteit en fotobleken te beperken.
4. Gebruik software zoals ImageJ een Z-projectie, die kan worden gebruikt om de totale oppervlakte van de sferoïde kwantificeren genereren aantal binnendringende cellen en afstanden binnengedrongen in de collageenmatrix.
5. Als voorbeeld, om de invasie te kwantificeren, pas het beeld drempel naar de achtergrond te sluiten, met de nadruk alleen de bolvormige en binnenvallende cellen, en hun gebied te meten. Het gebied van het origineel bolvormige kan worden afgetrokken van dit totaal aan invasiviteit kwantificeren.

5. Kwantificering van Invasion: Immunofluorescentie

LET OP: Alle oplossingen en buffers moeten worden doorgegeven door een 0,45 pm filter voor gebruik om remove vuil, die een negatieve kleuring kan beïnvloeden.

1. Bereid PBS ⁺ wasbuffer. Bereid 1x PBS en voeg _CaCl2 en _MgCl2 tot een eindconcentratie van 0,1 mM. Do buffer Autoclaveer na _CaCl2 en _MgCl2 toegevoegd. Oplossing kan filter-gesteriliseerd en opgeslagen bij kamertemperatuur.
2. Bereid neutraal gebufferde formaline (NBF) fixatie buffer. Voeg 5 druppels 1 M NaOH tot 0,6 g paraformaldehyde. Breng 20 ml met PBS ⁺ en incubeer bij 60 ° C totdat paraformaldehyde opgelost (ongeveer 1 uur). Afkoelen tot kamertemperatuur en breng de pH op 7,4 met 1 M HCl.
   OPMERKING: NBF fixatie buffer moet worden voorbereid onmiddellijk voor gebruik.
3. Bereid runderserumalbumine (BSA) blokkerende buffer. Oplossen BSA in PBS ⁺ 3% w / v. Oplossing kan worden gesteriliseerd filter en gedurende enkele dagen bewaard bij 4 ° C maar wordt best vers bereid. Niet verwarmen.
4. Bereid Permeabilisatie buffer. Verdun Triton X-100tot 0,2% v / v in PBS ^+.
   LET OP: Permeabilisatie buffer dient onmiddellijk te worden voorbereid voor gebruik.
5. Optioneel bereiden MOWIOL montage medium. Combineer 2.4 g MOWIOL, 6 g glycerol en 6 ml ultrapuur H ₂ O. Meng gedurende 3 h in een rotator bij kamertemperatuur. Voeg 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Incubeer onder menging bij 50 ° C gedurende 10 minuten.
   1. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 15 min om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Add anti-bleekmiddel, zoals 2,5% DABCO. Bewaren in 500 gl aliquots bij -20 ° C.
6. Immunofluorescentiekleuring van sferoïden (figuur 5)
   LET OP: Gebruik een pipet om langzaam toe te voegen of te verwijderen van vloeistoffen uit kamer dia. Vermijd het gebruik van een afzuiger, omdat dit de collageen laag kan verstoren.
   1. Bereid sferoïden en verankeren in collageen gevulde kamer dia's, zoals beschreven in de punten 1-2.
      OPMERKING: Collageen autofluorescentie kan worden geminimaliseerd door dunne lagen of kleine hoeveelheden collagen.
   2. Verwijder zoveel kweekmedium mogelijk vanaf elke kamer dia.
   3. Kort spoelen collageen laag met 500 pi PBS ⁺ wasbuffer om resten van het medium te verwijderen.
   4. Voeg 500 ul vers PBS ⁺ wasbuffer aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten tot sferoïden wassen. Herhaal dit twee keer.
   5. Vervang PBS ⁺ wasbuffer met 500 pi NBF fixatie buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 - 25 min.
   6. Verwijder NBF fixatie buffer en spoel met 500 pi PBS ⁺ wasbuffer. Wassen 5 minuten met verse PBS ⁺ wasbuffer minstens 3 keer.
      OPMERKING: Vaste sferoïden kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C in PBS ⁺ verse wasbuffer gedurende enkele dagen. 0,01% natriumazide worden toegevoegd aan de wasbuffer microbiële groei tijdens opslag te remmen.
   7. Vervang PBS ⁺ wasbuffer met 500 pi permeabilisatie buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-15 min.
   8. vervangen permeabilisatie buffer met 500 ul BSA blokkerende buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
      1. Optioneel verwijderen BSA blokkerende buffer. Gebruik scalpel of schaar, accijns sferoïden en het omliggende 3 mm x 3 mm gebied van de collageenlaag. Met behulp van een breed boring P1000 tip, los het uitgesneden blok van collageen door zachtjes te spoelen met verse BSA blokkerende buffer. Transfer collageen blok naar 1,5 ml buis.
      2. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 2 minuten en verwijder supernatant. De buis kan voorzichtig worden omgekeerd op schone papieren handdoek om weg lont overtollige vloeistof.
   9. Voeg primair antilichaam tegen sferoïden en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voeg voldoende hoeveelheid primair antilichaam zodanig dat de gehele collageenlaag gelijkmatig wordt ondergedompeld. De optionele bovenstaande stappen (5.6.8.1-5.6.8.2) gewoonlijk staan ​​het gebruik van kleinere hoeveelheden antilichaam.
   10. Dompel kamer dia in een container met ten minste 10 ml PBS ⁺ wash buffer gedurende 10 minuten te wassen. Herhaal dit een minimum van twee keer.
       1. Facultatief bij sferoïden werden uit collageenlaag eerder (Stap 5.6.8.1), voeg minste 1 mL PBS ⁺ wasbuffer aan de 1,5 ml buis en voorzichtig schudden. Laat het geheel minimaal 10 minuten.
       2. Verwijder zoveel PBS ⁺ wasbuffer mogelijk en herhaald wassen met PBS ⁺ wasbuffer minste tweemaal. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende enkele minuten aan collageen blokkeren pellet.
          LET OP: Clean buitenkant van de kamer dia door bestrijken met 70% ethanol voor onder te dompelen in wasbuffer.
   11. Herhaal stap 5.6.9-5.6.10 met behulp van passende secundaire antilichaam.
       NB: Als sferoïden direct werden gekleurd in de beeldvorming vat, ga dan naar stap 5.6.13.
   12. Facultatief bij sferoïden werden uit collageenlaag eerder (Stap 5.6.8.1), schone objectglaasjes en confocale microscopie compatibel dekglaasjes met 70% ethanol.
       1. Verwijder zoveel wasbuffer mogelijk van het collageen blok en resuspendeer in ultrapuur H ₂ O. Voer deze stap onmiddellijk voor de montage. Do-lood blokken niet laten weken in water.
       2. Met behulp van fijne getipt tang, pakt rand van collageen blok en transfer naar glasplaatje.
       3. Met behulp van de tang om het collageen in zijn plaats te houden, gebruik dan een schoon wattenstaafje om overtollige vloeistof lont uit het collageen blok, zorg ervoor dat niet aan het collageen direct raken.
          LET OP: Als collageen wordt vast aan wattenstaafje kan voorzichtig worden verwijderd, hetzij met behulp van een tang, of door onderdompeling in water.
   13. Met behulp van reverse pipetteertechniek, afzien van 100 ul MOWIOL montage medium op de collageen blok en plaats dekglaasje over het monster.
       1. Gebruik een wattenstaafje of keukenpapier om overtollig MOWIOL montage medium en water lont uit van onder het dekglaasje.
       2. Laat MOWIOL montage medium om 's nachts te harden bij 4 °C. Seal randen van dekglaasje met nagellak.
   14. Afbeelding gekleurd bolletjes met behulp van confocale of fluorescentiemicroscopie om lokalisatie van eiwitten van belang, de vorming van invasieve structuren, enz. (Figuren 5B, 5C) observeren.
       LET OP: Stained bolletjes moeten worden beschermd tegen licht om fotobleken te voorkomen.

6. anoikis Assay

OPMERKING: De sferoïde vorming protocol geeft ruimte aan verankering-onafhankelijke groei en anoikis weerstand kwantificeren in verschillende celtypen.

1. Zaaien cellen voor anoikis assay (figuur 6)
   1. Volg de instructies voor de bolvormige productie in punt 1.4 maar gebruik een minimum van 30 mg / ml methylcellulose om sferoïde vorming medium te bereiden.
      OPMERKING: Wanneer opgewarmd, moet 30 mg / ml methylcellulose een dikke gel die cellen in suspensie houdt produceren.
   2. Incubeer cellen gedurende enkele dagen tot weken endenk, regelmatig bij 10x vergroting met behulp van een microscoop. Cellen die anoikis te weerstaan ​​prolifereren en vormen kolonies.
   3. Kwantificeren anoikis door het meten van het aantal en de grootte van de kolonies gevormd in elk putje.
      Opmerking: wanneer kolonies zijn gevormd, kunnen ze worden gewassen om de methylcellulose verwijderd en gebruikt voor sferoïde gebaseerde testen, zoals beschreven.

Results

We beschrijven een flexibele en efficiënte methode om discrete bolletjes met behulp van mobiele-afstotende platen en sferoïde vorming media waaraan MC genereren. Onder de geschikte omstandigheden MC en serum, individuele cellen regelen en klonteren in het midden van de put sferoïden met minimale hechting aan de putbodem vormen. Met dit protocol werden sferoïden gevormd uit verschillende cellijnen (figuur 2B). Titratie van MC serumconcentratie is vereist voor elke cellijn...

Discussion

We presenteren een snelle en flexibele werkwijze voor het vervaardigen van 3D cel sferoïden de architectuur van weefsels in vivo met behulp van goedkope en algemeen verkrijgbare reagentia modelleren. Ons protocol maakt gebruik van de niet-cytotoxische en adhesie-bevorderende eigenschappen van MC ^{8, 9} naar cel aggregatie bemiddelen en cel monolaag de vorming van een minimum te beperken. Unlike eiwit gebaseerde matrices geïsoleerd uit dierlijke bronnen, M...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Gebaten voor PBS+ wasbuffer; PBS+ wasbuffer niet autoclaveren na toevoeging van calciumchloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Gebaten voor PBS+ wasbuffer; PBS+ wasbuffer niet autoclaveren na toevoeging van magnesiumchloride
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Voor sfeervorming
96-well U-bodem Cel-afstotende plaat	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle-medium	Sigma-Aldrich	D5546	Voor het kweken van SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cellijnen
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	Voor het kweken van TT cellijn
Fetaal runder serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter voor gebruik om deeltjesverontreinigingen te verwijderen
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Bereid in water tot 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	Voor het kweken van HCT-116, BxPC-3 cellijnen
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociatiebuffer
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Voor invasie-assay
Runder type I collageen	Corning Incorporated	354231	Stock 3,1 mg/mL; Onder gebruik op ijs bewaren
DMEM Fenolroodvrij Lage Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Minder achtergrondfluorescentie vergeleken met fenolrood gesupplementeerd medium
Gliacelkalijn Afgeleide Neurotrofe Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Voor immunofluorescentiemicroscopie
#1.5 Dekglazen	Electron Microscopy Sciences	72225-01	Voor het monteren van uitgesneden sferoïden
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Gebaten om actine te kleuren bij 1:200
Runder serumalbumine	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Gebaten in BSA blokkeerbuffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Gebaten in MOWIOL montagemedium
ImageJ Software	Freeware, NIH	-	Gebaten voor beeldanalyse
Microslides	VWR International	48312-024	Voor het monteren van uitgesneden sferoïden
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Gebaten in MOWIOL montagemedium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Gebaten in fixeerbuffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Gebaten in permeabilisatiebuffer