Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation

Samenvatting

Elektroporatie van de volgende generatie is een efficiënte methode om humane Th17-cellen te transfecteren met kleine RNA's om genexpressie en celgedrag te veranderen.

Samenvatting

CD4⁺ T-cellen kunnen differentiëren in verschillende subsets van effectieve T-helpercellen, afhankelijk van de omringende cytokine-milieu. Th17-cellen kunnen worden gegenereerd uit naïeve CD4⁺ T-cellen in vitro door ze te activeren in aanwezigheid van de polariserende cytokinen IL-1β, IL-6, IL-23 en TGF-β. Th17-cellen orkestreren de immuniteit tegen extracellulaire bacteriën en schimmels, maar hun abnormale activiteit is ook geassocieerd met verschillende auto-immuun- en ontstekingsziekten. Th17-cellen worden geïdentificeerd door de chemokine-receptor CCR6 en gedefinieerd door hun belangrijkste transcriptiefactor, RORγt, en karakteristieke effectorcytokine, IL-17A. Geoptimaliseerde kweekcondities voor differentiatie van Th17-cellen vergemakkelijken mechanistische studies van humane T-celbiologie in een gecontroleerde omgeving. Ze bieden ook een setting voor het bestuderen van de belangrijkheid van specifieke genen en genexpressieprogramma's door middel van RNA-interferentie of de introductie van microRNA (miRNA)-mimics of -remmers. Dit protocol biedt een gemakkelijk te gebruiken, reproduceerbare en zeer efficiënte methode voor tijdelijke transfectie van differentiërende primaire humane Th17-cellen met kleine RNA's met behulp van een elektroporatie-apparaat van de volgende generatie.

Inleiding

CD4 ⁺ T-cellen zijn cruciaal orchestrators van de adaptieve immuunrespons. Naïeve CD4 ⁺ T-cellen kunnen ontwikkelen in verschillende effector T-cellen (bijv Th1, Th2, Th17, enz.), Elk met hun eigen set van karakteristieke cytokinen en transcriptiefactoren, afhankelijk van de plaatselijke micromilieu ^1. Het geslacht besluiten dat T-cellen vormen cruciaal zijn voor beschermend immuniteit en tolerantie voor zichzelf. Th17 cellen zijn een subgroep van T-cellen bekend extracellulaire bacteriën en schimmels te bestrijden, maar hun verkeerde reacties zijn ook betrokken bij de pathogenese van multiple autoimmuun- en ontstekingsziekten zoals multiple sclerose en psoriasis ^{2, 3.} Th17 humane cellen kunnen worden gegenereerd uit naïeve CD4 ⁺ T-cellen in vitro door hen met een geschikte polariserende omgeving ^4. Vario ons combinaties van de cytokines IL-1β, IL-23, TGF-P en IL-6 zijn gebruikt voor de ontwikkeling van de menselijke Th17 cellen. Menselijke Th17 cellen brengen CCR6, een chemokine receptor die gewoonlijk wordt gebruikt om deze celpopulatie en worden omschreven met hun belangrijkste transcriptiefactor RORγt (gecodeerd door RORC) ^{5, 6.} Th17 cellen hebben de mogelijkheid om meerdere cytokinen tot expressie brengen, maar IL-17A is de lijn definiëren effector cytokine geproduceerd door deze cellen. Onderzochten we de expressie van alle drie Th17 geassocieerde markers (CCR6, RORγt, IL-17A) om de robuustheid van onze menselijke Th17 differentiatie in vitro assay te evalueren. Daarnaast hebben we gekweekte humane CD4 ⁺ -T-cellen onder niet-polariserende omstandigheden waarbij geen cytokinen of blokkerende antilichamen die aan het kweekmedium toegevoegd om als negatieve controle omdat expressie van deze markers Th17 laag of afwezig moeten zijn.

ve_content "> Een manier om normale humane T-celontwikkeling en biologie studie is om genexpressie te manipuleren tijdens de ontwikkeling. Korte interfererende RNA (siRNA) zijn synthetische kleine RNA moleculen die eiwitcoderende mRNA targeten en kan worden toegepast om genexpressie te verlagen . MicroRNAs (miRNA's) zijn endogene niet-coderende kleine RNAs bekend genexpressie posttranscriptioneel. miRNAs bleken een belangrijke rol in zowel muizen- als humane T-cel biologie spelen, met inbegrip van Th17 cellen ^{7, 8, 9.} de is essentieel voor betrouwbare werkwijzen voor het manipuleren van kleine RNA in humane T-cellen hun effecten op genexpressie en uiteindelijk menselijke T-celbiologie bestuderen. we beschrijven hier een eenvoudig te gebruiken, consistent en betrouwbaar protocol dat we hebben ontwikkeld voor het inbrengen kleine synthetische RNAs en afgesloten nucleïnezuren (LNA's, chemisch gemodificeerde nucleïnezuren met verhoogde stabiliteit)in immuuncellen, en in het bijzonder in de menselijke Th17 cellen.

Er zijn verscheidene alternatieve werkwijzen voor het inbrengen kleine RNA's in zoogdiercellen, die in het algemeen in chemische, biologische of fysische categorieën ¹⁰ vallen. Gewoonlijk gebruikte chemische werkwijzen, waaronder op lipiden gebaseerde transfecties en calciumfosfaat transfectie, afhankelijk maken van chemisch-DNA-complexen die efficiënter door cellen genomen. Over het algemeen chemische werkwijzen niet zo efficiënt voor de transfectie van primaire T-cellen. De meest voorkomende biologische methode is om een virale vector (bijvoorbeeld retrovirus of lentivirus), dat direct ingevoegd vreemde RNA in een gastheer als onderdeel van zijn natuurlijke replicatiecyclus gebruiken. Virale transductie duurt kenmerkend langer in beslag, vooral wanneer men factoren in de tijd voor moleculaire klonering van provirale plasmiden. Daarnaast kunnen virale vectoren transductie potentieel schadelijk voor de onderzoekers. Elektroporatie is een fysiek methode induceren membraan permeabilisatie door het onderwerpen van cellen aan hoogspanningspulsen, waarbij nucleïnezuren transiënt voeren in de cel waar ze inwerken op hun doel. Traditionele elektroporatie instrumenten waren niet effectief voor het transfecteren primaire lymfocyten. Toch is geoptimaliseerd next generation elektroporatie bewezen in staat T-cellen te transfecteren met zeer hoge efficiëntie, in het bijzonder wanneer het materiaal te transfecteren klein RNA. De term generatie losjes gebruikt om de twee nieuwere platforms (bijvoorbeeld neon, Amaxa) door traditionele elektroporatie machines differentiëren. Bovendien is deze werkwijze gemakkelijk schaalbaar voor matige doorvoer screenings met tot ongeveer 120 kleine RNAs in een enkel experiment, vaak met gevalideerde synthetische reagentia. Belangrijker is dat succesvolle transfecties worden bereikt in slechts 16 uur na T-celactivering. Het nadeel van deze methode is echter dat zij niet tot stabiele genomische incorporatiop, en is daarom van voorbijgaande aard. Daarom is de extra inspanning een stabiel expressieconstruct dat kan worden verpakt in een virale vector en met succes tot expressie gebracht in T-cellen wanneer langdurige expressie van een kleine RNA nodig maken waard.

We hebben een nieuwe generatie transfectie (bijvoorbeeld Neon) gebruikt om diverse synthetische enkel- of dubbelstrengs RNA of LNA oligonucleotide gereedschappen leveren voor verschillende doeleinden ^{11, 12, 13.} Efficiënte RNA interferentie kan worden geïnduceerd in primaire muis en menselijke T-cellen met behulp van dubbelstrengs korte interfererende RNA (siRNA). Dit protocol beschrijft geoptimaliseerde omstandigheden voor het gebruik van deze techniek in humane cellen Th17. In aanvulling op siRNA, kunnen in de handel verkrijgbare synthetische miRNA bootst en remmers worden gebruikt om miRNA winst en verlies van functie te bestuderen. miRNA bootst dubbelstrengs RNA-moleculen, vergelijkbaar met siRNA, maar designed met de sequentie van endogeen mature miRNAs. miRNA-remmers worden chemisch gemodificeerde RNA en / of LNA gebaseerd enkelstrengs oligonucleotiden die binden aan natief miRNAs en hun functie antagoniseren. We hebben ontdekt dat elk van deze instrumenten effectief kan worden gebruikt in gekweekte primaire T-lymfocyten, met inbegrip van maar niet beperkt tot de menselijke Th17 cellen.

Protocol

Dit protocol houdt zich aan richtlijnen UCSF's voor de menselijke onderzoek ethiek.

1. Bereiding van T Celkweek, isolatie van CD4 ⁺ T-cellen en Th17 Polarisatie

1. Op dag 0, laag 6-well weefselkweek platen met 1,5 ml per putje van anti-humaan CD3 (2 ug / ml) en anti-humaan CD28 (4 ug / ml) in PBS met calcium en magnesium ten minste 2 uur bij 37 ° C.
   1. Alternatief, laag de platen overnacht bij 4 ° C. Wikkel platen in parafilm.
2. De kabel voorbereiden bloed mononucleaire cellen (CBMCs) door dichtheidsgradiënt centrifugatie instructies van de fabrikant.
   LET OP: Ga voorzichtig te werk en zorgen voor een goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) wordt gedragen bij het hanteren van menselijk bloed om elk risico van blootstelling aan door bloed overgedragen ziekteverwekkers te voorkomen.
3. Nadat de mononucleaire cellen zijn geïsoleerd en gewassen, het uitvoeren van de menselijke CD4 ⁺ T-cellen de isolatie door negatieve Selectie behulp van een commerciële menselijke CD4 ⁺ T-cel kit.
   LET OP: Als er rode bloedcellen besmetting na mononucleaire cel isolatie, kan een optionele lysis van rode bloedcellen voorafgaand aan de CD4 ⁺ T-cel isolatie stappen worden uitgevoerd. Resuspendeer de mononucleaire cellen in 1 ml isolatie buffer (2% FBS in PBS). Voeg 5 ml 1x lyserende oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 5 ml isolatiebuffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren.
   1. Resuspendeer de mononucleaire cellen bij een dichtheid van 50 x 10 ⁶ per 500 pi bij de isolatie buffer in een nieuwe buis van 5 ml.
   2. Voeg 100 ul van FBS en 100 pi van het antilichaam mix per buis vervolgens elke buis incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten op een schudapparaat goed te mengen.
   3. Na de incubatie, voeg 3-4 ml isolatie buffer om de cellen te wassen. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 8 min bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Zorgvuldig aspireren de supernatant.
   4. Tijdens deze rotatie, pre-wassen van de magnetische bolletjes. Breng de gewenste hoeveelheid magnetische korrels in een nieuwe buis (gebruikt bij 1: 1 met de cellen) en voeg een gelijk volume isolatiebuffer de parels te wassen. Meng goed met een 1 ml micropipet en plaats vervolgens de slang in de magneet gedurende ten minste 1 min. zuig het supernatant voorzichtig. Resuspendeer de magnetische korrels in hetzelfde volume aanvankelijk voorafgaand overgedragen aan de was.
   5. Resuspendeer de cellen in elke buis met 500 pl van de isolatiebuffer en voeg 500 ul van voorgewassen magnetische korrels.
   6. Incubeer de cellen met de magnetische korrels gedurende 15 minuten op een rondschudapparaat bij kamertemperatuur (18 ° C tot 25 ° C) goed te mengen.
   7. Na de incubatie grondig pipet de cellen met een 1 ml micropipet ten minste 10 maal. voeg 3-4 ml isolatiebuffer en zet elke buis in de magneet gedurende 2 minuten.
   8. Zorgvuldig overdracht van de negatief geselecteerde CD4 ⁺ T-cellen die zijn inhet supernatant naar een nieuwe buis.
4. Zodra CD4 ⁺ T-cel isolatie is voltooid, tel de cellen met een hemocytometer en houden de cellen op ijs.
5. Was de met antilichaam beklede platen tweemaal met PBS. Voeg daarna 1,5 ml 2x mix van Th17-polariserende medium aan elk putje: anti-humaan IFN-y (20 gg / ml), anti-humaan IL-4 (20 ng / ml), humaan TGF- (10 ng / ml), humaan IL-1β (40 ng / ml), humaan IL-23 (40 ng / ml), humaan IL-6 (50 ng / mL) alle verdund in serumvrij basismedium (aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat en 100 pM 2-mercaptoethanol).
   OPMERKING: Transfectie en RNA interferentie werkt in serum-bevattende media. Het doel van het gebruik serumvrij medium met dit protocol is het beter IL-17A productie.
6. Centrifugeer de humane CD4 ⁺ -T-cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Zorgvuldig aspireren de supernatmier. Resuspendeer dan de cellen in serumvrij basismedium en de plaat van de cellen bij een dichtheid van 3 x 10 ⁶ in 1,5 mL per putje zodat het uiteindelijke volume 3 ml per putje en polariserende cytokinen zijn nu op een 1 x eindconcentratie.
   1. Plaats de platen in 5% _CO2, 37 ° C incubator gedurende twee dagen.

2. Elektroporatie van in vitro gepolariseerde Menselijke cellen Th17

1. Op dag 2, laag 48-putjes weefselkweekplaten met 250 pl per putje van anti-humaan CD3 (2 ug / ml) en anti-humaan CD28 (4 ug / ml) in PBS met calcium en magnesium ten minste 2 uur bij 37 ° C.
   1. Alternatief, laag de platen overnacht bij 4 ° C. Wikkel platen in parafilm.
2. Bereiden kleine RNAs voor transfectie. Voor elke transfectie aliquot 1 ui van een 5 pM voorraadoplossing van siRNA in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Omvatten geschikte chemie aangepaste kleine RNA control. Houd alle buizen op ijs.
3. Was de met antilichaam beklede platen tweemaal met PBS. Voeg vervolgens 500 pi 1X Th17-polariserende medium aan elk putje: anti-humaan IFN-y (10 ug / ml), anti-humaan IL-4 (10 ng / ml), humaan TGF (5 ng / ml), humaan IL 1β (20 ng / ml), humaan IL-23 (20 ng / ml), humaan IL-6 (25 ng / mL) alle verdund in serumvrij basismedium (aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat en 100 pM 2-mercaptoethanol).
4. Nadat de kweekplaten en transfectie reagentia bereid, resuspendeer de cellen met een 1 ml micropipet voorzichtig pipetteren maar zorgen dat alle cellen worden losgemaakt van de bodem van de putjes. de cellen zwembad in een conische buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
   LET OP: Voor perioden cultuur langer dan de vier-daagse protocol hierin worden gepresenteerd, moeten de cellen worden ongeveer getransfecteerd om de 3 dagen met behulp van hetzelfde protocol. Stap 20,4 moet echter worden gewijzigd sinds het behandeld met verschillende kleine RNAs cellen niet worden samengevoegd. Alle omstandigheden getest moeten worden verzameld, geteld, en afzonderlijk getransfecteerd.
5. Zorgvuldig aspireren het supernatans, en resuspendeer de cellen in ten minste 1 ml PBS te wassen. Tel de live-Th17 cellen (bijvoorbeeld met een hemocytometer met behulp van Trypan Blue uitsluiting van de levensvatbaarheid te beoordelen) en breng de cellen om een microcentrifugebuis.
6. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
7. Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de cellen vervolgens met de meegeleverde hersuspensiebuffer van het transfectie 10 pi kit in een dichtheid van 2,5-4 x 10 ⁷ cellen per ml. Houd cellen bij kamertemperatuur.
   LET OP: Als richtlijn, proberen om slechts zoveel cellen bereiden binnen 30 minuten kan worden getransfecteerd. Meerdere batches kunnen worden vergeleken.
8. Voeg 9 pl van cellen aan 1 pl kleine RNA in elke MicroCentrifuge buis. Pipet keer om de cellen en kleine RNAs voor transfectie mix vervolgens geladen in de pipet elektrodepunt.
   OPMERKING: Gewoonlijk voeg 9,5 pi celsuspensie te zorgen voor voldoende het mengsel te voorkomen waardoor de bellen in de pipet elektrodepunt voor transfectie.
9. Vul het voorzien cuvette met 3 ml kamertemperatuur elektrolytische Buffer E. Plaats de cuvet in de pipet station en plaats van de pipet in positie in de cuvette.
10. Onmiddellijk elektroporatie elke 10 pi mix van cellen en kleine RNA met de volgende parameters: 1,500-1,550 pulsspanning V, pulsbreedte 10 ms en 3 pulsen totaal de transfectie apparaat.
11. Na de elektroporatie is voltooid, direct het celmengsel voeg 500 ul 1X Th17-polariserende media in bereide putjes van een kweekplaat. Plaats platen in een 5% _CO2, 37 ° C incubator gedurende twee dagen.
    OPMERKING: Was de pipet elektrode tip door pipetterenop en neer in PBS tussen elke transfectie.

3. Oogst Menselijke cellen Th17

1. Resuspendeer de cellen in de cultuur media met een micropipet, pipetteren voorzichtig maar ervoor te zorgen dat alle cellen worden losgemaakt van de bodem van de putten. Bereid de cellen voor functionele en / of genexpressie-assays.
   OPMERKING: Routinematig worden genoeg cellen verkregen van een enkel putje van getransfecteerde Th17 cellen, bestemd voor flowcytometrische analyse van oppervlaktemerker en intracellulaire cytokine kleuring en transcriptiefactor of voor de bereiding van RNA voor genexpressie analyse.

Resultaten

De eerste stap om de ontwikkeling van een betrouwbaar systeem met succes elektroporatie humane Th17 cellen werd krachtig in vitro gedifferentieerde humane Th17 celculturen te genereren. T-cellen gekweekt onder Th17-polariserende uitgedrukte chemokine receptor CCR6 en de transcriptiefactor RORγt (Figuur 1A, links). Deze merkers werden niet tot expressie gebracht wanneer T-cellen werden gekweekt onder niet-polariserende (THN) omstandigheden (figuur 1A,

Discussie

Dit protocol verschaft een verbeterde werkwijze voor het afleveren van kleine RNA's in humane cellen Th17. Hoewel menselijke cellen Th17 hier gebruikt, kan deze werkwijze elektroporatie van kleine RNA's worden gebruikt met andere primaire menselijke T-helper-subsets, zoals Th1, Th2 en Tregs. Het is niet goed gewerkt voor naïeve CD4 ⁺ T-cellen, zodat de cellen moeten worden geactiveerd in cultuur voorafgaand aan transfectie. Voor dit protocol, we eerst geoptimaliseerd in vitro kweeksysteem bet...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	Voor intracellulaire transcriptiefactor flow cytometry kleuring
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Moet worden gemaakt 1x oplossing met gedistilleerd water voor gebruik