Recombinant Proteïne Expressie, Kristallisatie en Biofysische Studies van a Bacillus -conserveerd nucleotide pyrophosphorylase, BcMazG

Samenvatting

Bacillus anthracis is het verplichte pathogeen van dodelijke inhalatie miltbrand, zodat studies van zijn genen en eiwitten strikt gereguleerd zijn. Een alternatieve benadering is het bestuderen van orthologische genen. We beschrijven biofysicochemische studies van een B. anthracis ortholog in B. cereus , bc1531, die minimale experimentele apparatuur vereisen en ernstige veiligheidsproblemen ontbreken.

Samenvatting

Om veiligheidsbeperkingen en -regulaties te overwinnen bij het bestuderen van genen en eiwitten van echte pathogenen, kunnen hun homologen worden bestudeerd. Bacillus anthracis is een verplicht pathogeen dat dodelijke inhalatie miltbrand veroorzaakt. Bacillus cereus wordt beschouwd als een bruikbaar model voor het bestuderen van B. anthracis door zijn nauwe evolutionaire relatie. De gencluster ba1554 - ba1558 van B. anthracis wordt sterk bewaard met het bc1531 - bc1535 cluster in B. cereus , evenals met het bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, wat de kritische rol van de geassocieerde genen in het Bacillus genus aangeeft. Dit manuscript beschrijft methoden voor het bereiden en karakteriseren van een eiwitproduct van het eerste gen ( ba1554 ) van het gencluster in B. anthracis met behulp van een recombinant eiwit van zijn ortholoog in B. cereus , bc1531.

Inleiding

Recombinant eiwit expressie wordt veel gebruikt om problemen die verband houden met natuurlijke eiwitbronnen, zoals beperkte eiwithoeveelheden en schadelijke verontreiniging te overwinnen. Bovendien kan bij studies van pathogene genen en eiwitten een alternatieve laboratoriumstam die geen aanvullende veiligheidsmaatregelen vereist, worden gebruikt. Bacillus cereus is bijvoorbeeld een bruikbaar model voor het bestuderen van Bacillus anthracis door hun nauwe evolutionaire relatie ¹ .

B. anthracis is een verplicht pathogeen dat dodelijke inademende miltvuur veroorzaakt bij mensen en vee en kan potentieel als bioweapon worden gebruikt ² . Zo worden laboratoriumstudies op B. anthracis strikt gereguleerd door de Amerikaanse Centers for Disease Control, waarbij biosafety niveau 3 (BSL-3) praktijken vereist worden, waarbij wordt bepaald dat het laboratoriumgebied gescheiden wordt met negatieve kamerdruk. In tegenstelling tot B. anthracis , B. cereus is gecategoriseerd als een BSL-1-agent en heeft derhalve minimale veiligheidskwesties. B. cereus is een opportunistisch pathogeen dat bij infectie voedselvergiftiging veroorzaakt die zonder medische hulp kan worden behandeld. Aangezien B. cereus veel kritische genen deelt met B. anthracis , kunnen de functies van B. anthracis eiwitten worden bestudeerd onder toepassing van de bijbehorende homologen van B. cereus ¹ .

De ba1554 - ba1558 gencluster van B. anthracis is sterk bewaard met het bc1531 - bc1535 cluster Van B. cereus , evenals met het bt1364-bt1368 cluster van Bacillus thuringiensis , in termen van genorganisatie en sequentie. Bovendien zijn de eerste genen ( ba1554 , bc1531 en bt1364 ) van de respectieve clusters absoluut behouden ( dwz 100% nucleotide sequentie identiteit), implicietNg een kritische rol van het genproduct in de Bacillus- soort. Vanwege de ligging in deze genclusters was ba1554 verkeerd geïdentificeerd als een vermoedelijke transcriptie regelaar ³ . Echter, aminozuursequentie analyse van het ba1554 product geeft aan dat het behoort tot de MazG familie, die nucleotide pyrofoshydrolase activiteit heeft en niet geassocieerd wordt met transcriptiefactor activiteit ^{4 , 5} . Hoewel eiwitten die behoren tot de MazG-familie verschillend zijn met betrekking tot de totale sequentie en lengte, delen ze een gemeenschappelijk MazG-domein van 100 resten, gekenmerkt door een EXXE _12-28 EXXD-motief ("X" staat voor elk aminozuurresidu en het getal Geeft het aantal X residuen aan).

Het MazG domein vertoont niet altijd direct een bepaalde katalytische activiteit. Een MazG lid van Escherichia coli (EcMazG) bezit twee MazG domeinen, maar opHet C-terminale MazG-domein is enzymatisch actief ⁶ . Bovendien varieert de substraat specificiteit van MazG enzymen van niet-specifieke nucleoside trifosfaten (voor EcMazG) naar specifieke dCTP / dATP (voor integrin-geassocieerde MazG) en dUTP (voor dUTPases) ^{6 , 7 , 8 , 9} . Daarom zijn biofysicochemische analyses van het BA1554-eiwit nodig om zijn NTPase-activiteit te bevestigen en zijn substraatspecificiteit te ontcijferen.

Hier geven we een stap-voor-stap protocol dat de meeste laboratoria zonder een BSL-3-faciliteit kunnen volgen om het eiwitproduct van het B. cereus bc1531- gen te karakteriseren , dat is een ortholoog van B. anthracis ba1554 , op het moleculaire niveau. In het kort werd recombinant BC1531 (rBC1531) uitgedrukt in E. coli en gezuiverd met behulp van een affiniteitstabel. Voor röntgenkristallografische experimenten, de kristallijZation voorwaarden van het rBC1531 eiwit werden gescreend en geoptimaliseerd. Om de enzymatische activiteit van rBC1531 te beoordelen, werd de NTPase-activiteit kleurimetrisch gecontroleerd om radioactief gemerkte nucleotiden die conventioneel zijn gebruikt te vermijden. Tenslotte maakten analyses van de verkregen biofysicochemische gegevens ons de oligomerisatietoestand en de katalytische parameters van rBC1531 mogelijk, evenals om röntgendiffractiedata van het rBC1531 kristal te verkrijgen.

Protocol

1. Recombinant eiwitproductie en zuivering van rBC1531

1. Bereiding van een recombinant BC1531 eiwit (rBC1531) -expressie plasmide
   1. Bereid het genomisch DNA van B. cereus ^{10 op} .
   2. Versterk het bc1531- gen uit een sjabloon van B. cereus genomisch DNA door polymerase kettingreactie (PCR), met behulp van voorwaartse en omgekeerde primers (zie de Materials List) om respectievelijk ¹⁰ Bam HI- en Sal I-restrictie-enzymplaatsen te creëren.
   3. Digest het PCR-product en een gemodificeerde pET49b-vector (pET49bm) onder gebruikmaking van Bam HI en Sal I, zoals beschreven ¹¹ .
   4. Meng het verteerde PCR-product en vector (3: 1 verhouding) van stap 1.1.3 met behulp van T4 DNA ligase in een 10 μl reactie, zoals beschreven ¹¹ . Incubeer bij 30 ° C bij 18 ° C.
   5. Pipetteer 3 μL van de ligeringsreactie in 50 μl chemicaLly bevoegde E. coli DH5a cellen in een buis. Meng zachtjes door pipettering omhoog en omlaag en plaats 30 minuten op ijs. Warmte schok gedurende 45 s bij 42 ° C. Voeg 1 ml Luria-Bertani (LB) medium toe en groei de cellen terwijl u krachtig schudt (250 rpm, 37 ° C, 45 min).
   6. Neem 100 μL van de getransformeerde cellen uit stap 1.1.6 en verspreid ze op de LB-agarplaten met 100 μg / ml kanamycine (Kan). Incubeer gedurende ~ 18 uur bij 37 ° C.
   7. Kies kolonies met behulp van een steriele punt en groei de cellen in 3 ml LB medium met 100 μg / ml Kan; Schud krachtig (250 rpm, 37 ° C, 18 uur).
   8. Bereid plasmide-DNA op met behulp van een alkalische-SDS lysis methode, zoals beschreven ¹⁰ .
   9. Bevestig de nucleotidesequentie van het rBC1531-expressieconstruct met behulp van DNA sequentiebepaling ¹² .
2. Overexpressie van het rBC1531 eiwit
   1. Re-transformeer de E. coli BL21 (DE3) stam met rBC1531-expRonde plasmide, zoals beschreven in stappen 1.1.5-1.1.6, voor overexpressie.
   2. Selecteer een kolonie en groei het in 10 ml LB-medium dat 50 μg / ml Kan (LB + Kan) bevat; Schud krachtig gedurende 18 uur bij 37 ° C.
   3. Inoculeer 10 ml nachtcultuur in 1 L LB + Kan-medium en groei bij 37 ° C tot de OD ₆₀₀ (optische dichtheid bij 600 nm) bereikt ~ 0,7.
   4. Onderdompel de cultuur in ijskoud water gedurende ~ 15 min om de temperatuur af te koelen tot 18 ° C en voeg isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan de kweek bij een uiteindelijke concentratie van 1 mM voor recombinant eiwituitdrukking. Vergroot de cultuur bij 18 ° C gedurende een extra ~ 16-18 uur.
3. Zuivering van rBC1531
   1. Oog de cellen door centrifugeren (5.000 xg, 4 ° C, 30 min). Gooi de supernatant voorzichtig weg om de cellen niet te storen. De cellen opnieuw opschorten in 50 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing die 10 mM imidazool bevat.
   2. Lyse de cellen twee keer door sonicatie op ijs om de oververhitting van de cellysaten te voorkomen (tijd: 2 min 30 s; cyclus op: 5 s; fiets uit: 10 s; amplitude: 38%).
   3. Verwijder het cellysaat door centrifugeren (~ 25.000 xg, 4 ° C, 30 min).
   4. Meng 3 ml nikkelkralen en 60 ml PBS die 10 mM imidazool bevatten en zwaartekrachtstroom de extra buffer om de geëquilibreerde nikkelkralen in een 2,5 x 10 cm glazen chromatografie kolom af te lossen.
   5. Pipet om de supernatant van stap 1.3.3 naar de kolom over te brengen met voorgeëquilibreerde nikkelkralen en gedurende 2 uur bij 4 ° C bij een spoedwiel bij een lage snelheid (~ 20 rpm) incuberen.
   6. Laat het supernatant door de zwaartekracht afvoeren en de nikkelkrullen in de kolom drie keer wassen met 100 ml PBS die 10 mM imidazool bevat.
   7. Verwijder rBC1531 eiwit door 4 x 5 ml PBS te gebruiken die 250 mM imidazool bevat.
   8. Neem 15 μl van de elutie uit stap 1.3.7 en laat het op 15% SDS-PAGE lopen. Visualiseer de eiwitbanden opDe gel met behulp van Coomassie blue staining ¹⁰ .
4. Verwijdering van de affiniteits tags van het rBC1531 eiwit door trombine proteolyse
   1. Pipetteer de fracties in de dialysebuis (molecuulgewicht afgesneden: 3 kDa) en plaats de buis in een beker die 4 L trombine-splitsings-compatibele buffer bevat (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl en 1,5 mM P-mercaptoethanol) Bij 4 ° C overnacht.
   2. Pipetteer de fracties en breng ze over naar een conische buis.
   3. Meet de absorptie bij 280 nm en schat de rBC1531 eiwitconcentratie, zoals beschreven ¹³ .
   4. Neem 50 μg rBC1531 in een 0,5 ml buis en voeg verschillende hoeveelheden trombine toe ( dwz 2, 1, 0,6 en 0,3 eenheden). Incubeer de rBC1531 en trombine reacties bij 20 ° C gedurende ~ 3 uur om de minste hoeveelheid trombine te bepalen die nodig is om de N-terminale affiniteitstik te splitsen.
   5. Voer de rBC1531 en trombine reacties op een 15%SDS-PAGE en bepaal de laagste hoeveelheid trombine ( bijv. 0,3 eenheden trombine per 50 μg rBC1531) die de N-terminale affiniteitstabel volledig verteert en een tag-free rBC1531 produceren.
   6. Voeg 10 mg rBC1531 eiwit en 60 eenheden trombine toe aan een 15 ml buis en incubeer bij ~ 3 uur bij 20 ° C voor de trombine-proteolyse reactie.
   7. Breng gel-filtratienormen aan op een kolom met grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) om een ​​standaardkromme van molecuulgewichten en elueringsvolumes te bereiden, zoals beschreven ¹³ .
   8. Plaats het trombine verteerde rBC1531 eiwit uit stap 1.4.6 in een centrifugale filterbuis (molecuulgewicht afgesneden: 3 kDa) en centrifuge bij 3.000 g bij 4 ° C om te reduceren tot een volume van minder dan 5 ml.
   9. Breng het geconcentreerde rBC1531-eiwit aan op de SEC-kolom en geef 60 geëlueerde fracties in 0,5 ml per buis ¹³ .
   10. Neem 15 μL van elke fractie, voer ze op een 15% SDS-PAGE en staiN de gel met behulp van Coomassie-kleuroplossing (0,15% (w / v) Coomassie brilliant blue, 40% (v / v) methanol en 10% (v / v ijsazijn) zoals beschreven ¹⁰ .
   11. Pipetteer de fracties die rBC1531 bevatten en verzamelen ze in een buis.

2. Kristallisatie Screening en Optimalisatie van rBC1531

1. Screeningsomstandigheden voor rBC1531 proteïne kristallisatie
   1. Concentreer de rBC1531 van stap 1.4.11 tot ~ 18.5 mg / ml met behulp van een centrifugaalfilterbuis, zoals beschreven in stap 1.4.8.
   2. Voeg 50 μl van elke kristallisatie-screeningsoplossing (zie sectie 2.2) ^{14 toe} aan de putten van kristallisatieplaten met 96 putjes. Plaats 0,5 μl van de 18,5 mg / ml rBC1531 eiwitoplossing op een zitbank. Meng de eiwitoplossing met 0,5 μl van de putoplossing en herhaal het proces voor de gehele plaat.
   3. Bedek de plaat met een heldere lijmfolie.Plaats de 96-putjesplaten bij 18 ° C en laat dampdiffusie toe.
   4. Scan de druppels bij 20-40X vergroting met een lichtmicroscoop om de kristalvorming dagelijks gedurende 2-3 weken te controleren.
   5. Verzamel röntgendiffractiedata ¹² met behulp van de verkregen rBC1531 proteïne kristallen.
2. Optimalisatie van rBC1531 kristallisatie condities
   1. Bereid 500 μL van de geselecteerde initiële kristallisatie conditie oplossing ( bijv. 0,1 M natriumcacodylaat, pH 6,5 en 1,0 M natriumcitraat) en vul een 24-putjes kristallisatieplaat voor de zittingdruppel.
   2. Voeg 0,5 μl van de 18,5 mg / mL rBC1531 eiwitoplossing toe aan een zitbank, meng met 0,5 μL van de putoplossing en bedek de plaat onmiddellijk met een heldere lijmfolie. Leg de plaat bij 18 ° C.
   3. Volg de kristalgroei gedurende een week onder een lichtmicroscoop.
   4. Optimaliseer verschillende kristallisatieomstandigheden door de pH te variëren ( dwz., PH 5,5-6,8) van 0,1 M cacodylaat en door het veranderen van de zoutconcentratie ( dat wil zeggen 0,9-1,2 M) natriumcitraat om enkelvoudige kristallen te verkrijgen. Monitor kristalgroei gedurende ~ 1 week en verzamel röntgendiffractiedata ¹² .

3. Karakterisering van de nucleoside triphosphatase (NTPase) Activiteit van rBC1531

1. Validatie van het anorganische fosfaatafhankelijke colorimetrische onderzoek
   1. Bereid een voorraad pyrofosfaat (100 mM) op en verdun deze tot de uiteindelijke concentraties van 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 en 250 μM in 200 μl reactiebuffer (20 mM HEPES, pH 7,4; 150 MM NaCl en 2 mM MgCl2) in duplicaatplaten met 96 putjes. Gebruik de eerste plaat als controle (dit bevat geen pyrofosfatase). Zorg ervoor dat de tweede plaat pyrofosfatase bevat als werkplaat, zoals aangegeven in stap 3.1.2.
   2. Voeg 0,01 eenheid Saccharomyces cerevisiae anorganische pYrofosfatase (1 μl) aan de putten van de werkplaat en incubeer bij 20 ° C gedurende 30-60 minuten.
   3. Bereid de molybdaatzuuroplossing door mengsels van ammoniummolybdaat (0,86% v / v) en ascorbinezuur (14% v / v) oplossingen in een 7: 3-verhouding. Voeg 16 μL molybdaatzuuroplossing toe aan zowel de werk- en controlebronnen en wacht gedurende 15 minuten.
   4. Lees de optische _dichtheid bij 690 nm (OD _690nm ).
2. Colorimetrische NTPase-analyse
   1. Bereid een voorraad van 100 mM nucleoside trifosfaat (NTP) substraat op en verdun tot de gewenste concentratie ( bijv. 0, 0,2, 4,4, 11,22,44,88 of 132 μM) in 180 μl assaybuffer (20 mM HEPES, PH 7,4, 150 mM NaCl en 2 mM MgCl2).
   2. Voeg 20 μg rBC1531 (1,5 mM) toe en de NTP substrates van stap 3.2.1 tot 200 μl per reactie in een 96-putjesplaat en pipette omhoog en omlaag om goed te mengen. Bedek de plaat met deksel en plaats deze in een 37 ° C incubator gedurende 30 minutenOm de substraathydrolyse reactie uit te voeren.
   3. Breng de plaat over op een waterbad van 70 ° C en laat het gedurende 15 minuten staan ​​om rBC1531-gemedieerde katalytische reacties te stoppen.
   4. Voeg 0,01 eenheid S. cerevisiae anorganische pyrofosfatase (1 μL) toe aan elke bron van de reactieplaat (uit stap 3.2.3) en incubeer bij 20 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 16 μL molybdaatzuuroplossing toe aan de reactieplaat om de kleur te ontwikkelen (~ 15 min). Lees bij OD _690nm .
   5. Analyseer met behulp van de Michaelis-Menten vergelijking, zoals beschreven ¹² .

Resultaten

Karakterisering van het eiwit van belang in deze studie begon door het bereiden van een voldoende hoeveelheid recombinant B. cereus bc1531 (rBC1531) eiwit, bij voorkeur meer dan meerdere milligram. Het DNA fragment dat codeert voor het BC1531 eiwit werd bereid door PCR met behulp van het genomische DNA van B. cereus als een sjabloon, omdat het orthologische genen identiek aan ba1554 bevat . RBC1531 werd overexpresseerd als een oplosbaar eiwit in E. coli

Discussie

Studies van echte pathogenen zijn beperkt vanwege veiligheidsbeperkingen en -voorschriften. Als alternatief kunnen pathogenen worden bestudeerd met behulp van evolutionair verwante niet-pathogenen of minder pathogene soorten. Het ba1554 gen wordt beschouwd als een kritiek gen in B. anthracis. Gelukkig is er een identiek gen aanwezig in niet-klinische B. cereus. Dus zonder ernstige veiligheidsbezwaren kan recombinant BC1531-eiwit worden gebruikt voor biofysische en enzymatische karakterisering. ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bacillus cereus ATCC14579	Korean Collection for Tissue Culture	3624
Genomic DNA prep kit	GeneAll	106-101	Genoom DNA-voorbereiding
Forward primer	Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA	BamHI site is onderstreept
Reverse primer	Macrogen	CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI site is onderstreept
nPfu-Forte	Enzynomics	P410	PCR polymerase
BamHI	Enzynomics	R003S
SalI	Enzynomics	R009S
pET49b expressievector	Novagen	71463	Expressievector werd gemodificeerd om affiniteitstags en BamHI/SalI sites toe te voegen10
T4 DNA ligase	Enzynomics	M001S
Dialysmemembraan	Thermofisher	18265017
Droogblokverwarmer	JSR	JSBL-02T
LB bouillon (Luria-Bertani)	LPS solution	LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton, Dickinson and Company
Kanamycin	LPS solution	KAN025
Mini-prep kit	Favorgen	FAPDE300	Plasmid DNA-voorbereiding
BL21(DE3) Competente cel	Novagen	69450-3CN
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Fisher BioReagents	50-213-378
Natriumchloride	Daejung	7548-4100	PBS-materiaal
Kaliumchloride	Daejung	6566-4405	PBS-materiaal
Kaliumfosfaat	Bio Basic Inc	PB0445	PBS-materiaal
Natriumfosfaat	Bio Basic Inc	S0404	PBS-materiaal
Imidazool	Bio Basic Inc	IB0277
Sonicator	Sonics	VCX 130
Ni-NTA agaros	Qiagen	30210	Nikkelkraal
Rotator	Finepcr	AG
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-rad	1610374	SDS-PAGE-eiwitstandaard
Coonmassie Brilliant Blue R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	Coomassie-kleuringsoplossing
Methylalcohol	Samchun chemical	M0585	Coomassie-kleuringsoplossing
Azijnzuur	Daejung	1002-4105	Coomassie-kleuringsoplossing
Dialysmemembraan	Thermofisher	68035
2-Mercaptoethanol	Sigma-aldrich	M6250
Thrombine	Merckmillipore	605157-1KUCN	Bereid aliquoten van 20 μL (1 eenheid per μL) en bewaar bij 70 °C en ontdooi voor gebruik
Superdex 200 16/600	General Electric	28989335	Grootte-exclusiechromatografie
Gelfiltratiestandaard	Bio-rad	151-1901
Centrifugeerfilter	Amicon	UFC800396
Kristallisatieplaten	Hampton research	HR3-083	96-well zittende druppelplaat
De JCSG kern suite I-IV	Qiagen	130924-130927	Kristallisatiescreeningsoplossing
Microscoop	Nikon	SMZ745T
Cryschem platen	Hampton research	HR3-158	24-well zittende druppelplaat
Anorganische pyrofosfatase	Sigma	10108987001
Ammoniummolybdaatoplossing	Sigma	13106-76-8
L-ascorbinezuur	Sigma	50-81-7
NTP-substraat	Startagene	200415-51
Spectrofotometer	Biotek	SynergyH1	microplate-lezer
GraphPad Prism 5	GraphPad	Prism 5 voor Window