Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

13.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55586

⸱

8 april 2017

 ,  ,  , 
1Cancer & Stem Cell Biology Programme, Duke-NUS Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Samenvatting

De ontwikkeling van programmeerbare genoom-editing tools is het gebruik van reverse genetics om de rol van specifieke genoomsequenties spelen in het functioneren van cellen en hele organismen te begrijpen vergemakkelijkt. Deze oorzaak is enorm geholpen door de recente invoering van de CRISPR / Cas9 systeem een ​​veelzijdige tool waarmee onderzoekers het genoom en transcriptoom manipuleren om, onder andere, knock-out, knock down, of knock in genen in een gerichte manier. Ten behoeve van kloppen van een gen, CRISPR / Cas9 gemedieerde dubbelstrengsbreuken werven de niet-homologe-DNA-end verbinden herstelweg de leesraamverschuivingsinducerende veroorzaken insertie of deletie van nucleotiden te introduceren in de rust plaats. Echter kan een individuele geleider RNA ongewenste off-target veroorzaken, en deze uit te sluiten, het gebruik van meervoudige geleider RNAs nodig. Deze veelheid aan doelen betekent ook dat een hoog volume screening van klonen vereist, wat op zijn beurt roept de toepassing van een efdoende high-throughput techniek om de knock-out klonen genotype. Huidige genotyperingstechnieken ofwel lijden aan inherente beperkingen of maakt hoge kosten, vandaar waardoor ze ongeschikt zijn voor high-throughput doeleinden. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor het gebruik van fluorescente PCR, die genomisch DNA gebruikt uit ruw cellysaat als sjabloon en oplossen van de PCR-fragmenten via capillaire gelelektroforese. Deze techniek is nauwkeurig genoeg om een ​​basenpaar verschil tussen fragmenten differentiëren en derhalve toereikend is dat de aanwezigheid of afwezigheid van een frameshift in de coderende sequentie van het doelgen. Deze nauwkeurige kennis effectief verzet zich tegen de noodzaak van een bevestigende sequencing stap en stelt gebruikers in staat om tijd en kosten te besparen in het proces. Bovendien is deze techniek bewezen veelzijdig genotypering diverse zoogdiercellen uit verschillende weefsels oorsprong doelwit van gids-RNA's tegen talrijke genen, zoals hier en elders getoond.

Inleiding

Reverse genetische benaderingen zijn toegestaan ​​wetenschappers om de effecten van specifieke veranderingen ontrafelen in het genoom van de cel of het hele organisme. Bijvoorbeeld kan de expressie van een bepaald gen worden verzwakt door gen knockdown 1, 2 (partiële reductie) of gen knockout 3, 4 (complete ablatie) om het effect dat dit heeft op de functie van de cel of het bepalen ontwikkeling van het organisme.

Genknockout experimenten gemakkelijker omdat de introductie van sequentiespecifieke programmeerbare nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (talens) worden. Echter, de relatief recente karakterisering van de geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindroom repeat (CRISPR) / Cas9 systeem is het zeer eenvoudig voor elk laboratorium de hele wereld om gen uit te voeren gemaakte knockout experimenten. In wezen is de CRISPR / Cas9 bestaat uit twee essentiële componenten-één hulplijn RNA (sgRNA), die herkent en bindt via basis complementariteit met een specifieke sequentie in het genoom, en een endonuclease genoemd Cas9. Na de specifieke binding en werking van het sgRNA-Cas9 complex op genomisch DNA is dubbelstrengs splitsing van DNA. Dit op zijn beurt activeert de DNA-schade reactiemechanisme in de cel, die vervolgens via de niet-homologe-end-joining (NHEJ) of homologe recombinatie (HR) banen wordt hersteld. Aangezien de NHEJ herstelmechanisme (maar niet de HR mechanisme) resulteert vaak in de willekeurige insertie of deletie van nucleotiden op de plaats van reparatie, waardoor insertie / deletie (indel) mutaties, kan dit leiden tot het leesraam van een exon te verschuiven. Dit kan vervolgens leiden tot de knock-out van het gen door vroegtijdige terminatie van translatie en-nonsense gemedieerde verval 5, 6,7.

Ondanks het gemak verschaft door de invoering van de CRISPR / Cas9 systeem kloppen van een gen, genotypering klonen van doelcellen loopt stuk, vooral in een high-throughput instelling 8, 9. Bestaande technieken ofwel enige hinder inherente beperkingen of financieel kostbaar. Bijvoorbeeld, de inspecteur of T7E1 assay, welke een enzymatische test die mismatches detecteert DNA duplexen 10, niet in staat onderscheid te maken tussen wildtype klonen en homozygote mutanten (klonen waarvan de allelen identiek gemuteerd) aangezien deze klonen identieke allelen en derhalve geen mismatches aanwezig in de DNA-sequentie 11. Bovendien, het gebruik van Sanger sequentiebepaling, die wordt beschouwd als de gouden standaard voor het genotyperen van mutante klonen, in een hoge-doorvoer opstelling is ongewenst vanwege de hoge kosten. Hier presenteren we een detailed protocol van de fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese techniek, die de beperkingen van de andere bestaande genotyperingstechnieken kan omzeilen en is vooral nuttig bij het uitvoeren van een high-throughput screen van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Deze methode is technisch eenvoudig uit te voeren en bespaart tijd en kosten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Het verkrijgen van CRISPR / Cas9-gerichte Single-cell Clones

  1. Zaad HepG2-cellen op een plaat met 6 putjes bij 500.000 cellen per putje in 2 ml antibiotica-vrij Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Transfecteren cellen met plasmide co-expressie Cas9 en specifieke sgRNA tegen het gen van belang onder toepassing van een geschikt transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Zo sgRNA kunnen worden gekloneerd in de pSpCas9 (BB) -2A-GFP vector, zoals eerder beschreven 4.
  3. Vervang het kweekmedium 4-16 h na transfectie met 2 ml vers antibioticumvrij medium.
  4. Ongeveer 48 uur na transfectie, verzamelen enkele celsuspensie door trypsinizing de cellen.
    1. Trypsinize de cellen in 0,2 ml 0,25% trypsine-EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg 1 ml medium en resuspendeer thoroughly.
  5. Sorteren van de cellen gedurende GFP-positieve klonen, zoals hierboven beschreven 12, en vervolgens ongeveer 3500 cellen.
  6. Plaat de GFP-positieve cellen gesorteerd op 10 cm schalen bij 500, 1000 en 2000 cellen per schaaltje in 8 ml penicilline / streptomycine, aangevuld cultuurmedium. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
  7. Handhaaf de cellen bij 37 ° C en 5% CO2, het medium vervangen elke vijf dagen, totdat ze uitgroeien tot eencellige kolonies groot genoeg zichtbaar zijn voor het blote oog. Voor de meeste kanker cellijnen, dit duurt ongeveer twee weken vanaf de eerste dag van plating.
  8. Wanneer de kolonies van de juiste grootte (dat wil zeggen, zichtbaar voor het blote oog), transfer individuele kolonies aan putjes van een 96-putjes plaat met 200 pl DMEM aangevuld met 10% FBS.
    1. Zuig het eencellige kolonies onder gebruikmaking van een 200 pl pipet met een klein volume medium. Resuspendeer de cellen grondig individuele putten door tritureren meerdere malen.
  9. Handhaaf de cellen bij 37 ° C en 5% CO2, het medium vervangen elke vijf dagen, totdat 50 bereikt - 90% confluentie. Voor de meeste kankercellijnen, dit duurt ongeveer 24-48 uur.

2. extraheren ruwe Genomisch DNA via een directe lysiswerkwijze

  1. Wanneer de cellen bereikt 50-90% confluentie verwijder zoveel van het kweekmedium uit de putjes mogelijk via meerdere kanalen afzuiging of meerkanaals pipet.
  2. Voeg 25 ul van 0,05% trypsine-EDTA (zonder fenolrood) in elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 7 minuten.
  3. Resuspendeer de getrypsiniseerd cellen grondig door en neer te pipetteren meerdere malen. Controleer de cellen onder een microscoop om ervoor te zorgen dat ze worden losgemaakt van het kunststof oppervlak.
  4. Een kopie van de afzonderlijke klonen door overdracht van ongeveer 5 pl van de enkele-celsuspensie aan een lege 96 putjes plate. Voeg 200 ul kweekmedium aan elk putje en de cellen handhaven totdat positieve klonen worden geïdentificeerd met behulp van fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese (zie hieronder). Serieel de cellen 10 cm schalen of andere schaal van keuze vergroten (zie hoofdstuk 7).
  5. Voeg 5 ul van de eencellige suspensie uit stap 2,3-10 pl zelfgemaakte directe lysis buffer (10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,15% SDS, en 0,3% Tween-20) 12 in een 96-wells PCR-plaat en meng door op en neer pipetteren meerdere malen. Centrifugeer kort (om de vloeistof naar de bodem van de putjes te brengen).
  6. Voeg 200 ul kweekmedium om de resterende ~ 15 pi celsuspensie uit stap 2.3 en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2, met het repliceren van stap 2.4.
  7. Onderwerp het lysaten van stap 2.5 met de volgende thermische cyclus programma om volledige lysis van de cellen en vrijmaking van genomisch DNA garanderen: 65 ° C gedurende 30 en 8 ° C gedurende 30 s, 65 ° C gedurende 1,5 min, 97 ° C gedurende 3 min, 8 ° C gedurende 1 min, 65 ° C gedurende 3 min, 97 ° C gedurende 1 min, 65 ° C gedurende 1 min en 80 ° C gedurende 10 minuten. Centrifugeer de lysaten kort.
  8. Verdun de lysaten door toevoeging van 40 pl nuclease-vrij water te brengen met behulp van een vortex mixer. Centrifuge kort. De verdunde lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of voor meerdere maanden bewaard bij -20 ° C zonder noemenswaardig kwaliteitsverlies.

3. Het uitvoeren Fluorescent PCR CRISPR / Cas9 Target amplificeren

  1. Ontwerp twee fluorofoor-gelabelde voorwaartse primers (zowel gelabeld aan het 5'-uiteinde) voor elke CRISPR / Cas9 doelgebied; knipplaatsen die verder dan 300 bp van elkaar moeten worden beschouwd als twee afzonderlijke doelgebieden (bijvoorbeeld groene fluorofoor gelabelde primer voor irrelevante wildtype controle en blauw-fluorofoor gelabelde primer voor CRISPR / Cas9 gerichte klonen, zie Tabel Materia ls).
    1. Procure deze gelabelde voorwaartse primers en een ongemerkt reverse primer dienovereenkomstig. Merk op dat primers kunnen worden ontworpen met behulp van een middel bij uitstek is en dat de amplicons 200 zou moeten zijn - 500 bp lang.
  2. Voer PCR zoals eerder 12 beschreven doelgebieden met behulp van de gelabelde primers te versterken.
    1. Met 3 pi van de verdunde lysaten van stap 2.8 op een 20-ul reactie (zie tabel 1) en de volgende thermische cyclus programma: 94 ° C gedurende 10 minuten (1 cyclus); 94 ° C gedurende 10 s, 64 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 1 min (4 cycli); 94 ° C gedurende 10 s, 61 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 1 min (4 cycli); 94 ° C gedurende 10 s, 58 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 1 min (4 cycli); 94 ° C gedurende 10 s, 55 ° C gedurende 30 s en 68 ° C gedurende 1 min (35 cycli).
  3. Resolve 5 pi van de PCR amplicons op een 1% agarose gel om te controleren op grootte en relatieve hoeveelheid ampliconsss = "xref"> 12.
    LET OP: Het uitvoeren van deze stap voor alle monsters wordt aangemoedigd, maar niet noodzakelijk; oplossen van een gekozen aantal monsters voldoende is om de hoeveelheid amplicons die in de monsters in het algemeen schatten.

4. Voorbereiden Monsters voor Capillaire gelelektroforese

  1. Verdunde amplicons van wildtype (niet-gerichte oudercellen) en CRISPR / Cas9-target DNA in nuclease-vrij water tot ongeveer 2,5 ng / ul. Zorg ervoor dat voldoende wildtype DNA-monster te verdunnen tot elk target DNA monster worden toegevoegd (minimaal 0,5 gl verdunde wildtype monster per monster gericht is vereist).
  2. Meng de verdunde en wildtype target DNA monsters in gelijke verhouding (bijv meng 1 pi van wildtype monster met 1 pl gerichte monster).
  3. Voeg 1 ul van het gemengde amplicons 8,7 uL gedeïoniseerd formamide en 0,3 ui kleurstof gemerkte groottestandaard in een 96-well PCR plaat die met de genetische is eenalyzer.
    Opmerking: Het gebruik van een hoofdmengsel van het formamide en groottestandaard (dwz een bereiding van een voormengsel van het formamide en de standaardmaat in een 29: 1 verhouding voor de toevoeging van amplicons gestandaardiseerde bedragen waarborgen) aanbevolen.
  4. Goed af, de plaat en verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende 3 min met behulp van een PCR-thermocycler.
  5. Plaats de plaat op het ijs onmiddellijk na de verwarmingsstap en incubeer gedurende ten minste 3 min.

5. Het uitvoeren van capillaire Gel elektroforese op een Genetic Analyzer

  1. Opgericht assayparameters, instrument protocol en formaat bellen protocol de capillaire gelelektroforese software verbonden met een genetische analyse.
    OPMERKING: Deze stap is alleen nodig voor de eerste elektroforese run; het programma kan worden opgeslagen voor later gebruik. Voor de volgende runs, ga direct naar stap 5.2.
    1. Klik op de "Create New Plate" icoon op de software dashboard.
    2. Geeft de run een dummy naam en selecteer de volgende opties: aantal putten, 96; Plate Type, Fragment; Capillaire lengte, 50 cm; en Polymer, POP7. Klik op de "Assign Plate Content" knop.
    3. Onder "Testen," klik "Create New Assay"; een nieuw paneel zal verschijnen.
    4. Noem de test "FPCR-CGE Assay" en controleer of "Application Type" juist is ingesteld als "Fragment."
    5. Stel het instrument protocol door te klikken op de knop "Create New" onder "Instrument protocol."
      1. Instellen of kiezen uit de volgende opties en parameters in de daarvoor bestemde gebieden: Application Type, Fragment; Capillaire lengte, 50 cm; Polymer, POP7; Dye Set, G5; Run Module, FragmentAnalysis; Protocol Naam, FPCR-CGE Instrument Protocol; Oventemperatuur 60 ° C; Run Voltage 19,5 kV; Pre-run Voltage, 15 kV; Injectie voltage 1,6 kV; Run Time, 1.330 s; Pre-run Time, 180 s; Injectie Time, 15 s; en Data Delay, 1 s.
    6. click op de "Toepassen op Assay" knop en daarna op de "Opslaan in Library" knop om het programma op te slaan. Sluit het venster om door te gaan.
    7. Het opzetten van een-size bellen protocol door te klikken op de knop "Create New" onder "Sizecalling protocol."
      1. Instellen of kiezen uit de volgende opties en parameters in de daarvoor bestemde gebieden: Protocol Naam, FPCR-CGE Sizecalling Protocol; Maat standard, GS500 (-250) LIZ; Size-beller, SizeCaller v1.1.0; Analyse Instellingen, -; Analyse Range, Full; Sizing Range, Full; Size Calling Method, Lokale Southern; Primer Peak, Present; Blauw, Groen, Oranje TV, (controleren); Minimum piekhoogte, 175 voor alle kanalen; Gebruik Smoothing, None; Gebruik Baselining (Baseline Window (Pts)), (controleren) 51; Minimumpiek halve breedte, 2; Peak Window Size, 15; Polynomial Degree, 3; Slope Threshold Peak Start, 0.0; Slope Threshold Peak End, 0.0; QC Instellingen, -; Afmeting Kwaliteit, -; Mislukken als waarde <0,25; Pass als waarde <0,75; Veronderstel lineariteit van 0 bp tot 800 bp; en bedienen Pull-up Markeren Pull-up ratio ≤ 0,1 en Pull-Up Scan ≤ 1.
    8. Klik op de "Apply om Assay" knop en daarna op de "Opslaan in Library" knop om het programma op te slaan. Sluit het venster om door te gaan.
    9. Zorg ervoor dat de test wordt opgeslagen door te klikken op de knop "Opslaan in Library" eens te meer en verlaat het paneel door te klikken op de knop "Sluiten".
    10. Terug op de "Toewijzen Plate Contents" pagina, klik op de link "Create New File Name Convention" onder "File Name verdragen."
    11. Noem het programma "FPCR-CGE File Name."
    12. Onder "Beschikbare attributen," selecteert u de gewenste attributen die zal verschijnen in de bestandsnaam (zoals "Data Run", "Time of Run," "Nou Position" en "Sample Name"). Kies het gewenste bestand locatie waar de resultaten van de run wordt opgeslagen.
    13. Klik op de knop "Toepassen op Assay" en vervolgensde "Opslaan in Library" knop om het programma op te slaan. Sluit het venster om door te gaan.
    14. Terug op de "Toewijzen Plate Contents" pagina, klik op de "Create New Results Group" link onder "Results groepen."
    15. Noem het programma "FPCR-CGE Resultaten groepen."
    16. Onder "Beschikbare attributen," selecteert u de gewenste attributen die zal verschijnen in de bestandsnaam (zoals "Assay Name"). Kies het gewenste bestand locatie waar de resultaten van de run wordt opgeslagen.
    17. Klik op de "Apply om Assay" knop en daarna op de "Opslaan in Library" knop om het programma op te slaan. Sluit het venster om door te gaan.
  2. Stel het programma voor een elektroforese gerund door de onderstaande stappen.
    1. Ga naar het dashboard en klik op het icoon "Create New Plate".
    2. Noem de run zoals gewenst (voor de overzichtelijkheid bevat de datum, cellijn en gennaam). Selecteer de volgende opties: aantal putten, 96; Plate Type, Fragment; Capillaire lengte, 50 cm; en Polymer, POP7. Klik op de "Assign Plate Content" knop.
    3. Label elk putje van het monster naar wens (bijvoorbeeld een monster kan worden genoemd "NC" aan te geven dat de put een negatieve controle).
    4. Onder de "Testen", "File Name verdragen," en "Results groepen" dozen, klik op de "Link toevoegen uit bibliotheek" en selecteer de programma's gemaakt in stap 5.1.3 tot 5.1.17.
    5. Markeer al de putten te analyseren en selecteert u de relevante programma's onder "Testen", "File Name verdragen," en "Resultaten groepen" door de vakjes naast hen.
  3. Voordat de plaat op het plateau van de genetische analysator Breng de rubberen afdichting op de plaat met 96 putjes en zet de afgedichte plaat in de plastic behuizing die bij de genetische analyse.
  4. Duw de "Tray" knop aan de voorzijde van de genetische analysator en wanneer de schaal rede pijn voor de apparatuur Open de deur en laad het omhulde plaat op het plateau. Zorgen dat de plaat is vergrendeld en sluit de deur.
  5. Klik op de "Link Plaat voor Run" knop.
  6. In de pagina "Load Platen voor Run", doen een laatste controle om ervoor te zorgen dat alle reagentia en omstandigheden correct en in orde zijn.
  7. Klik op de knop "Start Run". Elke serie van 24 monsters (de eerste 3x8 putjes van de plaat met 96 putjes) in minder dan 55 minuten in beslag.

6. Analyse van de elektroferogram tot basenpaar verschillen bepalen

  1. Wanneer de capillaire gel elektroforese is voltooid, opent de analysesoftware om de resultaten te analyseren.
  2. Klik op het icoon "Samples Toevoegen aan Project" en zoek naar de map met de run-bestanden. Recall vanaf stap 5.1.12 de toegewezen locatie van de resultaten bestanden.
  3. Selecteer alle resultaten bestanden van elke injectie in de voltooide run en click op de "Add to List" knop; de namen van deze bestanden beginnen met "Inj" en bevatten de details van de run.
  4. Klik op de knop "toevoegen en analyseren" om verder te gaan met de analyse.
  5. Selecteer alle monsters in de aanloop door te klikken op de eerste monster en de cursor te slepen tot op het laatste monster en klik vervolgens op het pictogram "Beeldscherm Plots".
  6. Om de kwaliteit van de grootte standaard controleren, opent u de oranje-kanaal van de resultaten door het controleren van het oranje icoontje en het vinkje in de rest van de gekleurde pictogrammen; dit is belangrijk om ervoor te zorgen dat de grootte-roeping is nauwkeurig en betrouwbaar.
  7. De pieken die overeenkomen met de fragmenten verkregen uit de irrelevante controle en de beoogde klonen weergeven, de blauwe en groene pictogrammen uitlezingen openen van deze kanalen.
  8. Plaats de cursor op de horizontale as van de eerste resultaten plot en klik met de rechtermuisknop en kies "Full View." Scroll naar beneden om alle resultaten in één oogopslag te bekijken om te bepalenals er een groot probleem met de run. Om in te zoomen op een specifiek bereik van waarden met de rechtermuisknop op de muis op de betreffende as van de plot, kiest u "Zoom To ...," en de sleutel in het bereik van de waarden van belang.
    LET OP: Een potentieel groot probleem is dat alle monsters leveren lage intensiteit pieken. Dit is meestal het gevolg van de langdurige opslag van met fluorofoor gelabelde amplicons voor de capillaire elektroforese of over-verdunning van amplicons, die gemakkelijk kan worden verholpen door herhaling van de PCR stap of door verdunning van de amplicons bij een lagere verdunningsfactor resp.
  9. Om de resultaten op te slaan, volgt u de onderstaande stappen.
    1. Zorg ervoor dat de blauwe en groene kanalen worden geselecteerd en klik op het icoon "Sizing Table".
    2. Sla de tabel van waarden in tabs gescheiden tekst (.txt) door het openen van "File" en kiezen voor "Export Table." Noem het bestand dienovereenkomstig en selecteer het bestand locatie naar keuze.
    3. Om het perceel op te slaans van de run in PDF-formaat, ga naar "File" en klik op de optie "Print". Kies de relevante PDF schrijver en druk op "Print". Noem het bestand dienovereenkomstig en selecteer het bestand locatie naar keuze.
  10. Het verschil in de grootte van de fragmenten verkregen uit wildtype-gerichte controle en de CRISPR / Cas9-gerichte klonen te berekenen, volgt de onderstaande stappen.
    1. Open de gescheiden tekst (.txt) tab uit stap 6.9.2 met een spreadsheet-programma. De tabel moet deze vier belangrijke kolommen zijn onder meer: ​​"Dye / Monster Peak" (wat wijst op een blauwe of groene kanaal), "Sample File Name" (de eerste tekens geven de put of sample naam), "Size" (met vermelding van de omvang van de fragment genaamd) en "Lengte" (waarin de fluorescentie-intensiteit van de piek).
    2. Om enkel uit relevante pieken, uit te sluiten degenen die niet in de verwachte grootte.
      OPMERKING: Typisch, indel mutaties zelden resulteren in meerdan een 100-bp verschil in grootte; dus pieken waarvan de grootte verschilt met meer dan 100 bp van het wild-type controle piek (dominante piek in het groene kanaal) worden uitgesloten. Dit kan eenvoudig worden gedaan met behulp van de "Between" optie onder de functie "Voorwaardelijke opmaak" in de spreadsheet.
    3. Om niet-specifieke pieken, die niet te onderscheiden van de achtergrond niveau te verwijderen, gebruik dan de "Less Than" optie onder de functie "Voorwaardelijke opmaak" in de spreadsheet programma om pieken, waarvan de hoogte lager is dan 2.000 eenheden uit te sluiten. Deze grenswaarde is empirisch bepaald en kan derhalve worden aangepast indien geschikt geacht.
    4. Bereken het verschil in fragmentgrootte tussen elk van de resulterende pieken in het blauwe kanaal (CRISPR / Cas9-gerichte klonen) en de enige piek in het groene kanaal (ongerichte wildtype controle) door het aftrekken van de laatste van de eerste.
      LET OP: Het is belangrijk om waarde die aan elke capillaire elektrofo gebruikenESIS monster, want er kunnen inter-sample verschillen in de fragmentgrootte van het wildtype controle.
    5. De waarden afgerond tot het dichtstbijzijnde gehele getal het aantal baseparen die zijn ingebracht in of verwijderd uit, indien aanwezig, de genomische sequentie in kwestie bepalen. Bij kloppen van een gen van belang, selecteer klonen waarvan indel mutaties geen veelvouden van 3 bp zodat er frameshift in de coderende sequentie.

7. Verificatie van de Knockout Status van Clones

  1. Breiden knockout individuele klonen van de plaat met 96 putjes (van stap 2.4 en 2.6) van een 24-wells plaat met trypsinizing de cellen met behulp van 25 pl 0,25% trypsine-EDTA en incuberen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
  2. Voeg 125 ul medium (DMEM aangevuld met 10% FBS) aan de cellen getrypsiniseerd en resuspendeer grondig.
  3. Breng de celsuspensie aan een 15 ml buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder zoveel van het medium mogelijk middels vacuümzuigen of een pipet, resuspendeer de celpellet in 500 ui medium en breng de celsuspensie aan een putje van een 24-wells plaat. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 totdat de cellen confluentie bereiken 80-90%.
  5. Vouw de afzonderlijke klonen in serie uit de 24-wells plaat met een 6-wells plaat en de 6-well plaat op 10 cm schaal wanneer ze 80 bereikt - 90% confluentie door stap 7,1-7,4, met de volgende hoeveelheden: 50 pi van 0,25% trypsine-EDTA en 150 ul medium (voor het expanderen van de 24-well plaat om de 6-well plaat) en 200 pi van 0,25% trypsine-EDTA en 1 ml medium (voor het expanderen van de 6- putplaat de 10-cm schaaltje).
  6. Oogst de klonen wanneer zij 80 bereiken - 90% confluentie door trypsinizing de cellen met behulp van 1 ml 0,25% trypsine-EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
  7. Voeg 5 ml medium (DMEM aangevuld met 10% FBS) met het getrypsiniseerd cellen en resuspend grondig.
  8. Breng de celsuspensie gelijkelijk in twee 15-mL buizen centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijdert het medium zoveel mogelijk. Een deel van de cellen is voor genoom DNA extractie en de andere is op totaal eiwit-extractie.
  9. Ter verificatie via Sanger sequentiebepaling de stappen hieronder beschreven.
    1. Extract genomisch DNA uit de klonen zoals eerder 12 beschreven.
    2. Voer PCR-amplificatie van de regio die de CRISPR / Cas9 target site, zoals beschreven in paragraaf 3.2, maar gebruik ongelabelde primers. Gebruik geen gelabelde primers voor deze stap, omdat de fluorescentie van het label zal interfereren met de daaropvolgende Sanger sequencing stap.
    3. Zuiver de amplicons met een PCR clean-up kit, zoals hiervoor 12 beschreven.
    4. Type de gezuiverde amplicons met de PCR primers gebruikt in stap 7.9.2 om het genotype van de klonen vast te stellen, zoals beschreven previously 12.
  10. Ter verificatie via Western blotanalyse extract totaal eiwit van de wildtype cellen en gerichte klonen, zoals hierboven 12 beschreven.
    1. Uitvoeren van Western blot analyse met geschikte antilichamen tegen het eiwit van het doelgen, zoals hiervoor 12 is beschreven; echte knockout kloon mist de expressie van het eiwit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese techniek beschreven wordt verwacht toepasbaar op elk getarget gebied in het genoom worden in vrijwel elke cellijn die vatbaar is voor vreemd DNA afgifte. We hebben eerder de toepassing ervan aangetoond door zich te richten drie genen in een colorectale kanker cellijn 12. Hier tonen we de werkzaamheid in genotypering van een hepatocellulair carcinoom cellijn, HEPG2, gericht, met een CRISPR / Cas9 te bouwen tegen de Pr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het uitspelen van een specifiek gen in een model cellijn keuze heeft routine voor het ophelderen van de rol die het gen speelt in die specifieke cellulaire context te worden. In feite, verschillende genoom-brede schermen zijn beschikbaar die de CRISPR / Cas9 systeem vrijwel alle bekende menselijke genen gericht in het genoom 14, 15, 16. Met deze grote schermen (of zelfs kleine targeting van individuele genen van belang), is het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken mevrouw Tan Shi Min, mevrouw Helen Ong, en Dr. Zhao Yi voor het helpen met de capillaire gelelektroforese experimenten. Dit werk werd ondersteund door NMRC / IRG verlenen NMRC / 1314/2011 en MOE ACRF Tier 2 Fund subsidie ​​MOE2011-T2-1-051.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HEPG2-cellenATCCHB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)Thermo Fisher ScientificSH30022.01
HyClone Foetale boviene serumThermo Fisher ScientificSV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmidAddgenePX458
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027
Trypsine-EDTA (0,25%), fenol roodThermo Fisher Scientific25200056
Trypsine-EDTA (0,5%), geen fenol roodThermo Fisher Scientific15400054
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
HyClone Water, moleculaire biologie kwaliteitGE HealthcareSH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonukleotide (sense)AITbiotechGeenVolgorde: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonukleotide (anti-sense)AITbiotechGeenVolgorde: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Ongelabelde PCR-amplificatie voorwaartse primerAITbiotechGeenVolgorde: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; deze primer wordt ook gebruikt om PCR-versterkte allelen te sequencen
6-FAM-gelabelde fluorescente PCR voorwaartse primerAITbiotechGeenVolgorde: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-gelabelde fluorescente PCR voorwaartse primerAITbiotechGeenVolgorde: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Ongelabelde PCR reverse primerAITbiotechGeenVolgorde: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core KitQIAGEN201223
Hi-Di FormamideThermo Fisher Scientific4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size StandardThermo Fisher Scientific4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific4306737
3500xL Genetic AnalyzerThermo Fisher Scientific4405633
3500 Series 2 programmaThermo Fisher Scientific4476988
Gene Mapper 5 programmaThermo Fisher Scientific4475073
Gentra Puregene Cell KitQIAGEN1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromegaA9282
NAP1L1 Antilichaam (N-term)AbgentAP1920b
Kernmatrix Eiwit p84 antilichaam [5E10]GeneTexGTX70220
Peroxidase AffiniPure Geit Anti-Konijn IgGJackson ImmunoResearch111-035-144
Peroxidase AffiniPure Schaap Anti-Muis IgGJackson ImmunoResearch515-035-003

Referenties

  1. Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312(2016).
  2. O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
  3. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
  6. Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
  7. Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
  8. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  9. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
  10. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
  11. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
  12. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587(2015).
  13. Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
  14. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  15. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
  16. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
  17. Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
  18. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
  19. Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861(2012).
  20. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632(2014).
  21. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CRISPR Cas9 knock outhigh throughput genotyperingdetectie van indel mutatiesprimerontwerpcellysaat templatefragmentgrootteanalyseSanger sequencingWestern blot analyse
Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.