Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM's) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA's)

Samenvatting

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Samenvatting

Cardiomyocyten kunnen nu worden afgeleid met hoge efficiëntie van zowel humane embryonale als humane geïnduceerde-Pluripotente Stamcellen (hPSC). HPSC-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM's) worden steeds meer erkend als grote waarde voor het modelleren van hart- en vaatziekten bij mensen, vooral aritmie syndromen. Zij hebben ook relevantie aangetoond als in vitro systemen voor het voorspellen van drugresponsen, waardoor ze potentieel bruikbaar zijn voor drugscreening en -ontdekking, veiligheidsfarmacologie en eventueel uiteindelijk voor gepersonaliseerde medicijnen. Dit zou worden vergemakkelijkt door hPSC-CM's af te leiden van patiënten of gevoelige individuen als hiPSCs. Voor alle toepassingen is nauwkeurige meting en analyse van hPSC-CM elektrische eigenschappen essentieel om veranderingen te identificeren door hartmoleculaire mutaties en / of geneesmiddelen die ionkanalen richten en kan plotselinge hartsterfte veroorzaken. Vergeleken met handmatige patchclamp, bieden multi-electrode array (MEA) apparaten het voordeel vanWaardoor opnamen van medium tot hoge doorvoer mogelijk zijn. Dit protocol beschrijft hoe 2D-celculturen van hPSC-CM's worden gescheiden naar kleine aggregaten en enkele cellen en plaatst ze op MEA's om hun spontane elektrische activiteit op te nemen als veldpotentieel. Methoden om de opgenomen gegevens te analyseren om specifieke parameters te extraheren, zoals de QT en de RR intervallen, worden hier ook beschreven. Wijzigingen in deze parameters zouden worden verwacht in hPSC-CM's die mutaties dragen die verantwoordelijk zijn voor hartritmestoornissen en na toevoeging van specifieke geneesmiddelen, waardoor detectie van degenen die een cardiotoxisch risico dragen, mogelijk zijn.

Inleiding

Menselijke Pluripotente Stamcellen (HPSC's) hebben de capaciteit om zichzelf te vernieuwen en vrijwel elk celtype van het menselijk lichaam te genereren door middel van differentiatie ^{1 , 2} . Gedetailleerde protocollen over het directie van differentiatie van hPSC's in verschillende hartlijnen (ventriculaire, atriale, pacemaker-achtige cardiomyocyten) zijn beschreven ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7} . Cardiomyocyten zijn elektrisch actieve cellen en gedetailleerde kennis van hun elektrofysiologische activiteit kan zeer informatief zijn voor het begrijpen van hartontwikkeling en ziekte ⁸ . Patiëntspecifieke hiPSC-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn succesvol gebruikt om de cellulaire, moleculaire en elektrische eigenschappen van verschillende hartritmestoornissen te modelleren en te bestuderen, waaronder Long QT Syndrome(LQTS) ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} , Brugada syndroom ¹⁴ en cathecolaminergische polymorfe ventriculaire tachycardie ^{15 , 16} . Bovendien zijn meerdere geneesmiddelen toegevoegd aan zieke hiPSC-CM's om therapeutische interventie te recapituleren en de cellulaire pathologische fenotypes ^{10 , 15 , 20 , 21 , 22} te redden. Meer recent werden screeningsplatformen op basis van WT hiPSC-CM's ontwikkeld, in reactie op de noodzaak van menselijke systemen tot de vroege fasen van de ontdekking van de geneesmiddelen ^{23 , 24 , 25} , aangezien knaagdierkardiomyocyten diep verschillen van huMan in ionkanaaluitdrukking en biofysica ²⁶ .

Hiervoor worden technologieën die geschikt zijn voor medium tot high-throughput applicatie ontwikkeld en geïmplementeerd. Deze omvatten optische opnamen van membraanpotentiaal, Ca ²⁺ transienten en spanningen, impedantiemetingen (als indirecte maatregel van celcontractiliteit) en extracellulaire veldpotentiaal (FP) metingen (zie bijlage ²⁴ voor review). Multi-electrode Arrays (MEA) apparaten maken het mogelijk om op te nemen van de elektrische golfvormsignalen (of FP's) die gegenereerd en gevormd worden door monolayers of kleine clusters van cardiomyocyten. FP-contour correleert met het cardiale actiepotentieel en tot op zekere hoogte met de elektrocardiogramopnamen (ECG) ²⁷ ; Ze tonen typisch een eerste snelle opschepping die overeenstemt met de Na ⁺ -instroming en membraan depolarisatie (R / Q piek), een langzame golf / plateau fase die waarschijnlijk overeenkomt met de Ca2 + instroom, en een repolarisatie fase die overeenstemt met een overheersende K ⁺ efflux (T piek). Perturbatie van de FP golfvorm kan gecorreleerd worden met veranderingen in specifieke actiepotentiaalfasen ²⁸ .

Hoewel patchclamp-opnamen van actiepotentia meer informatief kunnen zijn, vooral voor parameters als opstijgsnelheid en rustmembraanpotentieel, zijn manuele metingen niet uitvoerbaar voor experimenten op medium- en high-throughputschaal, terwijl de geautomatiseerde patchclamp pas onlangs is toegepast op hPSC -CMs ²⁹ . Aangezien langdurige opnamen op MEA zowel acute als chronische blootstelling aan verbindingen mogelijk maken, is het nu mogelijk om hPSC-CM-platforms te gebruiken voor drugscreening, ontdekking ^{24 , 30} en voor veiligheidsfarmacologie ^{31 , 32} . Dit houdt de belofte van toekomstige precisie of perso inGeneutraliseerde medicijnen ³³ .

Het doel van dit protocol is om de nodige informatie te verstrekken voor het dissociëren en plakken van hPSC-CM's op MEA-chips en het meten van hun FP. In deze procedure is elke stap geoptimaliseerd, waarbij optimale celoverleving en herstel na dissociatie, optimale celbevestiging op de MEA-plaat en gestandaardiseerde analyse en kwantificering van parameters wordt gewaarborgd. In het bijzonder worden de procedures voor extracellulaire FP opname, analyse van QT en RR intervallen en evaluatie van geneesmiddeleffecten uitgelegd en toegelicht.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen en reagentia

1. Bereid het hPSC-CM-kweekmedium met behulp van laaginsuline, boviene serumalbumine, polyvinylalcohol, essentiële lipiden (LI-BPEL) medium ^{34 , 35 , 36} door de reagentia die in tabel 1 zijn beschreven te combineren. Filter het medium door een 0,22 μm poriënfilter en houd deze bij maximaal 2 weken bij 4 ° C.
2. Bereid menselijke recombinante fibronectine voorraadoplossing door 1 mg menselijk recombinant fibronectine in 5 ml steriel gedestilleerd water te reconstrueren om 200 μg / ml concentratie te bereiken, evenwicht en op te slaan bij -80 ° C.
3. Bereid 1% (w / v) enzymwasmiddeloplossing voor (zie tabel van materialen ) om verwijdering van resterende cellen uit de microarraychip te helpen, door 1 g enzymwasmiddelpoeder in 100 ml warme (~ 40-45 ° C) op te lossen gedeïoniseerd water. Laat de oplossing afkoelen en opslaan bij 4 ° C fOf tot een jaar.

2. Sterilisatie van MEA Chips (Figuur 1A)

OPMERKING: Verscheidene verschillende configuraties van de MEA's zijn beschikbaar, met single- of multi-well formaten. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van de single chamber MEA met 60 opnamelektroden in een 8 x 8 roosteropstelling (zie tabel van materialen ). De elektrodediameter is 30 μm en de afstand tussen elektroden bedraagt ​​200 μm. Er is ook een referentieelektrode aanwezig.

1. Spoel de chip grondig met gedeïoniseerd water.
2. Zet de MEA-chips in een glazen Petri-schotel dat geautoclaveerd kan worden. Wikkel de schaal in aluminiumfolie.
3. Steriliseer de chips in een laboratoriumkookpan gedurende 6 minuten. Laat de afwas afkoelen alvorens te openen.
   OPMERKING: Alternatief kunnen de chips gesteriliseerd worden door ze gedurende 15-30 minuten in 1 ml 80% (v / v) ethanol bij RT te dompelen.
4. Plaats de chips in een celcultuurhoed en laat deOppervlak voor UV-licht gedurende ongeveer 30 minuten.

3. Coating van MEA Chips (Figuur 1B en 1C)

1. Plaats de schone chips in een standaard 10 cm Ø plastic steriele Petri schotel.
2. Voeg 8 ml steriel gedestilleerd water toe aan de Petri-schotel om een ​​bevochtigde kamer te vormen, die voorkomt dat het kleine volume cultuurmedium op de chip droogt wanneer deze in de incubator wordt geplaatst.
3. Gebruik op maat gemaakte polytetrafluorethyleen (PTFE) ringen ( Figuur 1B ) om plating van de cardiomyocyten in het midden van de chip te waarborgen, waar de elektrode array zich bevindt. (De PTFE-ringen zijn eerder opgeslagen in 80% ethanol.) In de kweekkap, verwijder de ringen uit de ethanol, plaats ze in een steriele Petri-schaal zonder een deksel en laat de ringen in de kap drogen.
4. Plaats een droge ring in een MEA-chip met vlamgesteriliseerde pincet ( Figuur 1C ).
   OPMERKING: Gebruik ook 80% ethanol om de pincet te wassen en laat het iN de weefselkweekkap voordat u ze gebruikt.
5. Doe een portie van menselijke recombinante fibronectine voorraad (200 μg / ml in gedestilleerd water) en verdund in PBS met Ca2 ⁺ en Mg2 ⁺ om een ​​werkoplossing van 40 μg / ml te verkrijgen. Bedek de elektroden door 50 μL 40 μg / ml fibronectine in de ring toe te voegen.
   OPMERKING: Coating met behulp van menselijk recombinant fibronectine zorgt voor optimale hPSC-CM attachment. Andere typen coatingsproteïnen, zoals mengsels van boviene fibronectine of extracellulaire matrix eiwitten kunnen echter worden gebruikt.
6. Sluit het deksel van de 10 cm Ø plastic Petri-schotel en verplaats de schotel met de MEA-chip zorgvuldig in de incubator. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur, of bij 4 ° C / N.
7. Breng de schotel met de MEA-chip over naar de celkweekkap. Voordat u de MEA-chip gebruikt, aspireren u de 50 μL fibronectine met een P200-pipet of een vacuümsysteem in de kap, zonder de PTFE-ring te verplaatsen. Gebruik plaTips voor deze stap. Zorg ervoor dat geen vaste voorwerpen (bijv. Pipettipsjes) aan de binnenkant van de schotel raken, omdat dit de elektroden kan beschadigen.
   OPMERKING: dit verlengt het leven van MEA-chips.
8. Voeg 950 μL LI-BPEL medium (zie tabel 1 en tabel ) zachtjes toe, zorg ervoor dat het gelijkmatig verdeeld is en dat de ring niet drijft. Breng de schotel terug naar de incubator.

4. Dissociatie en Plating van hPSC-CMs (Figuur 2)

OPMERKING: Het hier beschreven protocol gebruikt hPSC-CM's die in een monolagskultuur gedifferentieerd werden met cytokinen ³⁴ bij ~ 18 dagen na het starten van de differentiatie. Het is echter bewezen geschikt te zijn voor elke 2D en 3D hPSC-CM cultuur. Bij gebruik van gedifferentieerde culturen op vroegere of latere tijdspunten, kan de incubatietijd van het dissociatie enzym (zie tabel van materialen ) worden necessary. De volgende volumes zijn bedoeld voor een enkele putje van een 12-brede plaatformaat (3,8 cm ² ).

1. Aspireer het medium uit de hPSC-CMs cultuurput.
2. Terwijl u werkzaam bent onder een weefselkweekkap, voeg 1-2 ml / putje PBS zonder Ca ²⁺ / Mg ^{2+ toe} om de cultuur te wassen. Aspireer de PBS.
3. Voeg 500 μL / putje van het dissociatie enzym toe. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
4. Voeg 1 ml LI-BPEL / putje toe om het enzym te verdunnen. Maak de monolaag van hPSC-CMs voorzichtig los door het voorzichtig te krabben met een P1000 pipet. Verzamel de cel suspensie in een 15 ml buis.
5. Spoel de put met 1 ml LI-BPEL af om alle resterende cellen en cellen te verzamelen.
6. Voeg nog eens 2-3 ml LI-BPEL toe om een ​​eindvolume van 5-6 ml te bereiken en pipetteert 3-5 keer op en neer met een 5 ml pipet om de klontjes te dissociëren.
   OPMERKING: Dissociatie in enkele cellen op dit punt is niet nodig, aangezien het celoverleving zal beïnvloeden. Aanwezigheid van kleine clusters zalZorgen voor hogere cel levensvatbaarheid.
7. Centrifugeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten bij 300 x g.
8. Verwijder de supernatant, probeert het grootste deel van het overtollige vloeistof te verwijderen, maar zonder de celpelletje los te maken.
9. Resuspendeer de celpelletje in 250 μL LI-BPEL (met behulp van een P1000 en pipettering zeer zachtjes).
10. Verspreid ~ 50 μL celsuspensie per MEA (maximaal 5 MEA's kunnen worden bereid uit één putje van een 12-puts plaat) door de celsuspensie rechtstreeks in het midden van de PTFE-ring op de top van de elektrode-array te pipetteren.
    OPMERKING: In dit stadium zijn cellen moeilijk te tellen door de aanwezigheid van celclusters en het totale aantal cellen per MEA kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van de gebruikte hPSC-CM bron. Zorg ervoor dat de wolk van gedissocieerde cellen het gebied van de elektroden bedekt tijdens het plateren.
11. Zorg de MEA voorzichtig over naar de incubator bij 37 ° C en laat de cellen O / N bevestigen

5. Ring Removal en Medium ReVersnijden (figuur 3)

1. Verwijder de ring zorgvuldig op een dag na het platen in een steriele omgeving met behulp van steriele pincetjes ( Figuur 3A-3B ).
2. Spoel de ring in 80% (v / v) ethanol en berg deze in een 50 ml buis met verse 80% (v / v) ethanol.
3. Verwijder voorzichtig 500 μl medium uit de MEA-chip en voeg 500 μL verse LI-BPEL toe.
4. Breng de MEA's naar de incubator bij 37 ° C.
   OPMERKING: De cellen moeten 1 tot 7 dagen na de verwijdering van de ring en de middelste verandering starten ( Figuur 3C ).
5. Meet de elektrische activiteit van hPSC-CMs op MEAs 1-7 dagen na de verwijdering van de ring.

6. Controleer de signaalkwaliteit (afbeelding 4)

1. Schakel de computer aan en start de software suite die is gekoppeld aan de MEA-instelling: TCX-Control, MC_MEA Select en MC_Rack. Stel de temperatuur in op 37 ° C in TCX-Control om metingen op fysiologische temperatuur op te nemen.
2. Verwijder de schaal die de MEA chip f bevatRom de incubator. Open het deksel, haal de MEA-chip uit, en plaats het op een weefsel om restwater te absorberen.
3. Veeg de externe contacten van de plaat met een weefsel voorzichtig af en maak ze schoon met behulp van een katoenen pootje bevochtigd met 100% (v / v) ethanol om eventuele resterende water of rommel te verwijderen, wat kan leiden tot signaalgeluid.
4. Breng de MEA-plaat over op de verwarmde (37 ° C) opnamehoofdstad om de spontane activiteit te detecteren ( bijv. Hardware: zie Tabel van materiaal ; software: MC_Rack).
   1. Open MC_Rack: Klik op 'Bewerken' → 'MC_Card toevoegen' om een ​​nieuw protocol te maken. Gebruik de vervolgkeuzelijst 'Bewerken' om verschillende recorder- en displayvensters toe te voegen aan het protocol.
      OPMERKING: een bemonsteringsfrequentie van ten minste 10 kHz wordt aanbevolen. Het protocol dat we gebruiken bevat een langdurig Display Tool, met een volledige lay-out van de hele MEA chip en een Spike Sorter, essentieel om het effect van de drug te vangen iN real time. De Spike Cutout is afgestemd op een 'Pre Trigger' van 20 ms, een 'Post Trigger' van 800 ms en een 'Dead Time' van 2 ms. Het protocol kan worden opgeslagen als '.Rck' bestand en herladen voordat u de experimenten start.
5. Start het protocol in de afspeelmodus door op de 'play'-knop te klikken.
   OPMERKING: Op dit moment is het mogelijk om het protocol dat is opgeslagen onder stap 6.5 te herladen. In MC_Rack laad u het protocol (.rck-bestandsextensie) door op 'Bestand' → 'Open' te klikken.
6. Als de signalen duidelijk zichtbare R pieken en T pieken tonen, wacht u 10-15 minuten om de aanpassingsfase af te sluiten. Voorbeelden van goede en slechte kwaliteitsporen zijn weergegeven in figuur 4 .
   OPMERKING: Als er geen T-piek kan worden gedetecteerd in een van de elektroden, ga dan niet verder met het experiment. Meestal is dit het gevolg van een slechte elektrische activiteit van de hPSC-CM of de slechte bevestiging van de cellen aan de elektroden.

7. Start ExPeriment en opname

1. Klik op 'record' en dan 'afspelen' en verwaarloos gegevens gedurende 10 minuten onder basiswaarden om de steady state te bepalen. Annoteer de elektroden die het beste signaal hebben, zodat ze gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en later geëxporteerd voor de analyse.
2. Voor de beoordeling van geneesmiddel-respons, voeg elke tien minuten toenemende concentraties van geneesmiddel toe. Bijvoorbeeld, voeg de hERG blokker E4031 toe bij een eindconcentratie van 1 μM. Verwijder hiervoor 100 μl medium en voeg hetzelfde volume toe van 10 μM E4031 opgelost in het medium.
   OPMERKING: Zoals eerder door Cavero en collega's ³¹ is aangetoond, is een verstandige keuze van het volume waarin de drugs opgelost zijn belangrijk belangrijk, aangezien het de drugresponscurve grondig kan veranderen.
3. Herhaal stap 7.2 voor alle andere geneesmiddelconcentraties van belang.
4. Klik op 'stop' om de opnames aan het einde van het protocol af te sluiten.

8.MEA Reiniging voor hergebruik

1. Zodra het experiment opnemen is voltooid, verwijder het medium voorzichtig met een P1000 pipet. Raak de binnenkant van de schotel niet aan, omdat dit de elektroden kan beschadigen. Verwijder volgens de lokale veiligheidsvoorschriften.
2. Spoel de MEA-chips uit met gedeioniseerd water met een wasfles en herhaal de wasstap 3-4x.
   OPMERKING: Op dit moment is het niet nodig dat de cellen volledig los van de chip zijn.
3. Voeg 1 ml enzym detergensoplossing 1% (v / v) in elke put toe en incubeer O / N bij 4 ° C om celledetachatie en celverwijdering mogelijk te maken.
4. Eendag later, spoel de MEA-chips grondig af met gedeïoniseerd water om enzyminderingsoplossing en resterende cellen te verwijderen en voeg 1 ml gedeïoniseerd water toe. Schone MEA-chips kunnen opgeslagen worden in gedemineraliseerd water bij 4 ° C.

9. Gegevensuitvoer

1. Open de MC_Data Tool software die gekoppeld is aan de MEA setup.
2. Klik op 'Bestand' → 'Open MCD'.
3. Klik op 'Extra' → 'MCD converteren naar ABF' .
4. Selecteer de elektroden met de beste opnamesignalen die worden geëxporteerd voor de analyse. Kies de map waarin u de geëxporteerde bestanden wilt opslaan en klik op 'Opslaan'. De export procedure kan enkele minuten duren, afhankelijk van het aantal geëxporteerde elektroden en de totale grootte van de opname bestanden.

10. Gegevensanalyse

1. Download en installeer een elektrofysiologie data acquisitie en analyse programma ( bijv. PClamp). Zodra u klaar bent, start de analysesoftware (bijvoorbeeld Clampfit).
2. RR Intervalberekening (Figuur 5).
   1. Plaats twee verticale cursors om het gebied van belang op het spoor te definiëren. Selecteer 'Eventdetectie' → 'Drempelzoeken'. De horizontale cursor moet alle gebeurtenissen overschrijden die moeten worden gekwantificeerd, zoals getoond in figuur 5A .
   2. Klik &# 39; OK 'en dan' De gehele categorie accepteren '. De software zal dan door het trace zoeken voor alle geschikte gebeurtenissen. Blauwe tekens worden boven de gebeurtenissen geplaatst.
   3. Pas de gevoeligheid van de automatische selectie aan door de parameters in het hoofdvenster detectievenster af te stemmen.
   4. Zodra alle gebeurtenissen automatisch zijn geïdentificeerd, ga naar het resultaatvenster (Venster → Resultaten) en kopieer de kolom 'Intervent Interval', die de frequentiegegevens bevat ( Figuur 5B ).
3. QT Intervalberekening (figuren 6-9):
   1. Plaats één cursor voor en één na een enkele FP in de steady state conditie. Selecteer 'Event Detection' → 'Create Template' (Afbeelding 6 ) .
   2. Controleer of de FP correct is geïdentificeerd en klik op 'Toevoegen'. De sjabloon wordt verplaatst naar het onderste paneel.
   3. Sla de sjabloon op als een '.atf'het dossier. Op deze manier is een template trace gemaakt die door de software door de gehele opname wordt gezocht ( Figuur 7 ). Maak een sjabloon voor elke conditie, omdat een drug effect de vorm van de FP kan veranderen. Indien nodig, filter het trace iets om maximaal 10.000 punten binnen de twee cursors op te nemen.
   4. Zodra de sjabloon is opgeslagen met '.atf' extensie, selecteer 'Event Detection' → 'Template Search' en laad de sjabloon.
   5. Pas de "Template match threshold" aan om alle FP in het geselecteerde interval correct te identificeren.
   6. Zodra alle gebeurtenissen correct zijn geïdentificeerd, sla deze op in een nieuw '.abf' bestand.
4. Open het bestand met analysesoftware en bereken de 'Time of Peak' automatisch voor zowel de Q / R als de T-pieken ( figuren 8, 9 ). Als sporen erg luidruchtig zijn, gebruik een filter. Bereken het QT interval door het subtracten van deQ / R-waarde van de T-waarde in een gewenste spreadsheet-editor.

Resultaten

Eén dag na dissociatie en plating, zal de laag van hPSC-CMs zichtbaar zijn als een dichte en witte film die het midden van de MEA-kamer bedekt ( Figuur 3A ). Na verwijdering van de ring ( figuur 3B )   De laag moet op zijn plaats blijven en inspectie op een lichtmicroscoop toont de MEA-elektroden die onder de (contracterende) hPSC-CM laag vallen ( Figuur 3C ). Door fysieke en elektrische koppeling van de cellen wordt alleen één elektrode (gouden elektrode) gebruikt voor analyse.

Als alternatief kunnen ze, wanneer ze werken met 3D-structuren, zoals embryoïde lichaamsdelen of microtisses, worden geplateerd zodat ze fysiek en elektrisch ontkoppeld zijn. Visuele inspectie bij de microscoop kan geen fysieke verbinding tussen de clusters bevestigen en niet-gesynchroniseerde R-golven bij MEA's bevestigen geen elektrische koppeling. In deze cAse, meerdere onafhankelijke elektroden kunnen worden geanalyseerd.

Typische opnames van FP-traces worden getoond in Figuur 4 . In het bijzonder kan een goede kwaliteitspoor worden gedefinieerd door de aanwezigheid van een duidelijke piek die overeenstemt met de Na ⁺ -instroming en membraan depolarisatie (R / Q piek), een duidelijke repolarisatie fase die overeenkomt met K ⁺ efflux (T piek) en een hoge Signaal-ruisverhouding ( figuur 4A , links: noot y-as schaal en figuur 4B ). Slechte kwaliteitssporen ( Figuur 4A , midden) kunnen het gevolg zijn van het falen van hPSC-CM's om aan de MEA-plaat of de zwakke hPSC-CM elektrische activiteit te bevestigen. Wachten 1-3 dagen voor betere bevestiging kan het signaal verbeteren; Echter, als er geen signaalverbetering zichtbaar is, wordt dit MEA uit experimenten aanbevolen. Luidruchtige sporen ( figuur 4A , rechts) kunnen na het filteren worden geanalyseerd.

Succesvolle analyse van RR interval kan worden geïdentificeerd door visuele inspectie van het scherm dat piekdetectie toont ( Figuur 5A, 5B ). Binnen het door de verticale cursors gedefinieerde tijdsinterval dienen de blauwe punten die overeenkomen met elke piek aanwezig te zijn. Als het programma geen of meerdere pieken identificeert, probeer dan de horizontale cursor te verplaatsen en de analyse opnieuw uit te voeren of de detectie-instellingen aan te passen. Op dezelfde manier kan een succesvolle analyse van QT-interval worden geïdentificeerd door visuele inspectie van het scherm dat FP-detectie toont ( Figuur 7 ). Binnen het door de verticale cursors gedefinieerde tijdsinterval dienen de blauwe markeringen die overeenkomen met elke FP-detectie aanwezig te zijn. Als het programma geen of meerdere FP's identificeert, probeer dan de FP-sjabloon opnieuw te definiëren (Afbeelding 6 ) of pas de detectie-instellingen aan en voer de analyse opnieuw uit.

Getrokken individuele FP sporen of hun gemiddelde (FiguurE 8) kan worden gebruikt voor het verkrijgen van QT-intervalwaarden met specifieke instellingen zoals in Figuur 9 . Analyse van QT-RR relatie is aan te bevelen en is zinvol in zieke en WT hPSC lijnen ( Figuur 10A ) en om de behoefte en / of het effect van QT-interval correcties te evalueren ( Figuur 10B-10D ). HPSC-CM's die LQTS-veroorzakende mutaties dragen, hebben langdurige QT-intervallen vergeleken met WT-controles ( Figuur 11A ). Behandeling van hPSC-CM's met een hERG-blokker resulteert in verlenging van QT-interval ( Figuur 11B ); Omgekeerd resulteert de behandeling met een hERG activator in het verkorten van het QT interval ( Figuur 11C ). Tenslotte moet de behandeling met geneesmiddelen die de kloppingsfrequentie van hPSC-CM beïnvloeden, zichtbaar zijn als een verandering in het RR-interval ( Figuur 11D , RR-interval verkorting).

/>
Figuur 1: Sterilisatie en Coating van MEA Chips. ( A ) Schema dat het sterilisatieproces vertegenwoordigt, met inbegrip van het plaatsen van de MEA-chip in een autoclaveerbare Petri-schotel, in aluminiumfolie opvullen, gedurende 6 minuten stomen en UV gedurende 30 minuten blootstellen. ( B ) Bovenste (linker paneel) en zijaanzicht (middenpaneel) van aangepaste PTFE-ring; De ring heeft een buitendiameter van 1,2 cm, inclusief 4 kleppen die zijn positionering in het midden van de MEA-chip mogelijk maken en de binnendiameter is 0,4 cm (rechter paneel). ( C ) Schematisch die de voorbereiding van de MEA-chip vertegenwoordigt, inclusief het plaatsen van de chip in een standaard plastic Petri-schotel, waarbij 8 ml gedeioniseerd water buiten de MEA-kamer wordt toegevoegd, de PTFE-ring in het midden van de kamer plaatst en de elektrode-array met fibronectine . Na incubatietijd wordt fibronectine verwijderd en vervangen door kweekmedium.T = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 2: Dissociatie en Plating van hPSC-CMs. Schematisch die de processen van enzymatische dissociatie van hPSC-CMs vertegenwoordigen, centrifugeren, resuspensioneren en pletteren in het midden van de MEA-kamer. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: MEA-chips met hPSC-CM-laag. ( A ) Bovenaanzichten van MEA chip die de ring en de laag van hPSC-CMs bevatten. ( B ) zijaanzicht van de MEA-chip na het verwijderen van de ring. ( C ) Helder veldbeeld van hPSC-CMs laag op de micro-Elektrode array; 4X vergroting. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: MEA opname van hPSC-CMs. ( A ) Representatieve sporen die bij het MEA zijn opgenomen, tonen een goede kwaliteitsspoor met R / Q en T pieken duidelijk zichtbaar met een hoge signaal-ruisverhouding (links), een slechte kwaliteitsspoor zonder duidelijk zichtbare R / Q en T pieken (midden) En een luidruchtig spoor met R / Q en T piept duidelijk zichtbaar maar met een lage signaal-ruisverhouding (rechts). ( B ) Representatieve voorbeelden van FP-traces van goede kwaliteit met verschillende morfologieën die kunnen worden opgenomen tijdens MEA-experimenten met behulp van hPSC-CMs. Het schaduwrijke gebied vertegenwoordigt het QT-interval gemeten tijdens de analyse. Aangezien de FP bij MEA lijkt op het eerste derivaatE van het actiepotentieel ²⁸ hebben we het integraal van het FP-trace, weergegeven als rode stippellijn, berekend als theoretische demonstratie van een T wave-keuze in de buurt van een complete actiepotentiële repolarisatie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: RR Intervalberekening. ( A ) Voorbeeld van RR interval analyse met automatische piekdetectie (bovenste) en data-extractie (bodem) met behulp van de analysesoftware (zie tabel van materialen). Verticale cursors identificeren het tijdinterval van interesse en de horizontale cursor kruist alle gebeurtenissen die worden gedetecteerd en geïdentificeerd door blauwe markeringen. ( B ) De vergrote kolom toont de geëxtraheerde gegevens die gebruikt worden om het RR interval te berekenen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Creëren van FP Template. Voorbeeld van sjabloon selectie met verticale cursors geplaatst voor en na een enkele FP. Deze sjabloon wordt gebruikt voor automatische identificatie van FP. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Automatische identificatie van de FP-sjabloon. Voorbeeld van sjabloonzoeken gedurende een interval gedefinieerd door twee verticale cursors. Alle gedetecteerde gebeurtenissen worden geïdentificeerd door blauwe markeringen en zijn automatischY boven in de inzet. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Kwantificering van FP Parameters. Analyse van de opgeslagen gebeurtenissen, met de R-piek handmatig geïdentificeerd binnen de eerste twee cursors en de T-piek die handmatig is geïdentificeerd binnen de laatste twee cursors. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Analysevenster. Parameters die in het statistiekvenster worden gebruikt om R piek te detecteren. Voor de detectie van de T-piek, verander cursors en (indien nodig) poregelmatigheid. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: QT-RR Relatie. ( A ) Voorbeeld van verschillende relatie tussen QT en RR intervallen tussen WT (LQT1 ^corr ) en Long QT syndroom type 1 (LQT1 ^R190Q ) hPSC-CMs. Schaduwrijke gebieden laten zien dat dezelfde verschuiving in RR-interval een grotere verschuiving in het QT-interval van de LQT1-zieke lijn genereert, waardoor de kans op aritmie gevoelig wordt verhoogd. ( B ) Relatie tussen niet-gecorrigeerde QT- en RR-intervallen gemeten bij MEA in CM's van 7 verschillende hPSC-lijnen. Het effect van QT-correctie op Bazett's ( C ) of Fridericia's ( D ) formules wordt getoond en zichtbaar als verandering in de helling van de QT-RR in Tervale relatie. Cijfers aangepast uit referentie ³⁰ . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Ziekte- of Druggeïnduceerde QT- en RR-intervalvariaties. ( A ) Voorbeeld van QT-interval verlenging in hPSC-CM afgeleid van een patiënt die een long-QT syndroom (LQTS) mutatie vergeleken met zijn isogene WT controle. ( B ) Voorbeeld van QT-interval verlenging in hPSC-CM op farmacologisch hERG blok. ( C ) QT-interval verkorten bij behandeling met toenemende doses van hERG-activator. Pijl geeft de richting van de verkorting aan. ( D ) Voorbeeld van geneesmiddelgeïnduceerde RR-interval verkorting. Paneel (C) werd van referentie aangepast> 30. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Lage insuline, BSA, polyvinylalcohol, essentiële lipiden (LI-BPEL) Medium
bestanddeel		Hoeveelheid voor 100 ml
IMDM		43 ml
F12		43 ml
Ascorbinezuur 2-fosfaat (5 mg / ml in gedestilleerd water)		1 ml
Celcultuur aanvulling (directe substituut voor L-glutamine)		1 ml
Penicilline / streptomycine		0.5mL
Phenol Red		1 mg
Proteïnevrije Hybridoma Medium-II (PFHMII)		5 ml
BSA (10% wt / vol in IMDM)		2,5 ml
PVA (5 gew.% Vol in gedestilleerd water)		2,5 ml
Chemisch gedefinieerd Lipid Concentraat (CDLC)		1 ml
Insuline-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100X		0,1 ml
A-monothioglycerol (13 μl in 1 ml IMDM)		0,3 ml
Combineer de reagentia, filter met een 0,22 μm poriënfilter en houd het medium bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.

Tabel 1: Li-BPEL Medium Samenstelling.

Discussie

Dit protocol laat zien hoe u HPSC-CM's kunt dissociëren en voorbereiden voor het meten van hun FP met behulp van MEA's. HPSC-CMs tonen gewoonlijk spontane elektrische activiteit, die kan worden gemeten als FP en kan significante gegevens verschaffen met betrekking tot de kloptempo, QT-intervalduur en aritmische gebeurtenissen.

Dissociatie van 2D-kardiale gedifferentieerde culturen is nodig om een ​​kloplaag op het MEA te herstellen en het is een kritische stap. Mechanische stress door herhaalde pipettering en / of agressieve dissociatie-enzymbehandelingen kan leiden tot hoge celsterfte, het niet aanbrengen aan de MEA-plaat en het ontbreken van spontane elektrische activiteit. Dit protocol is geoptimaliseerd voor monolayer culturen. Echter, een soortgelijke aanpak kan gebruikt worden voor driedimensionale (3D) culturen (bijvoorbeeld embryoïde lichamen of EB's) met kleine wijzigingen, zoals verzameling van de EB's gevolgd door PBS-wassen en langer incubatietijd bij het dissociatie-enzym. ImporterenAntly, in beide 2D- en 3D-gedifferentieerde culturen, hoe hoger de gedifferentieerde cellen, zou de langere incubatietijd nodig zijn om de cellen los te maken vanwege verhoogde extracellulaire matrixafzetting.

Het hier beschreven protocol voor het kwantificeren van FP-parameters kan gebruikt worden om dosis-responscurves voor cardioactieve drugs te genereren. Zoals onlangs beschreven door Cavero et al. ³¹ kan de startconcentratie van een geneesmiddel het resultaat van een MEA-meting ernstig beïnvloeden. Daarom, om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de resultaten te verbeteren, raden we het volgende aan: 1) in geval van onomkeerbare activators / blokkers, gebruik maken van relatief grote volumes medium die het te testen geneesmiddel bevat. Verwijder meer in detail 10-50% van het gemiddelde volume van de MEA-chip en voeg een gelijke hoeveelheid medium toe waarin het geneesmiddel eerder bij de juiste concentratie is opgelost. In dit geval is het voor de berekening van de uiteindelijke geneesmiddelconcentratie cruciaal om te overwegenIs de verandering in concentratie na mediumverwijdering. 2) Bij reversibele activatoren / blokkers voeg 10 μL van elke geneesmiddeldosis toe van een 100X voorraadoplossing.

De meerderheid van de hartdifferentiatieprotocollen resulteert in een variabele gemengde populatie van nodaleachtige, atriale-achtige en ventriculaire achtige cardiomyocyten, waarbij het ventriculaire type het meest vertegenwoordigd is. Dit kan een beperking vormen bij het modelleren van hartziekten die een specifiek cardiomyocyt subtype of drugs beïnvloeden die op cardiale subtype-specifieke ionkanalen beïnvloeden. Hoewel verschillende studies de voorwaarden hebben geoptimaliseerd om meer gecontroleerde specificaties te leiden tijdens de hartdifferentiatie ^{3 , 5 , 37 , 38} , is hun bredere toepasbaarheid nog onderzocht.

Bovendien, variabele efficiëntie van differentiatie (in verschillende experimenten en in diFferent hPSC lijnen) kunnen waargenomen worden ^{39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44} . Kardiomyocytenverrijkingstrategieën gebaseerd op oppervlakte-eiwituitdrukking ^{35 , 45} (door middel van florescentie-geassocieerde celsortering of door magnetische kraalselectie ^{46 , 47} ) en metabole selectie ^{44 , 48} kunnen geldige strategieën voorstellen die op elke (genetisch gemodificeerde of Ongewijzigd) hPSC-lijn voorafgaande plating van de hPSC-CMs, om het elektrische signaal te verbeteren.

Hoewel hPSC-CM's beruchte onvolwassen zijn in vergelijking met volwassen volwassen cardiomyocyten ^{4 , 49} , hebben ze blijk gegeven dat ze waardevol zijn in rEcapituleren en identificeren van specifieke ziekteverwante veranderingen ( bijv . In kanaalopathieën) ^{19 , 20 , 50} en geneesmiddelgeïnduceerde reacties ( bijv. Hart-ion-kanaalblokkers) ^{4 , 51} . Bovendien zijn onrijpe cellen gemakkelijker te dissociëren en beter te herstellen dan volwassen cardiomyocyten na dissociatie en plating ^44. Daarom kan hPSC-CM immaturiteit in dit opzicht als een voordeel worden beloond. Echter, om bijvoorbeeld te kunnen herhalen. Late hartziekten en het reproduceren van geneesmiddelenreacties van volwassen cardiomyocyten trouw, een meer volwassen mechanische, metabolische en elektrische hPSC-CM-toestand moet worden verkregen. Methoden om deze cellen te volwassenen omvatten langdurige tijd in cultuur ⁵² , mechanische stam ⁵³ , elektrische stimulering ⁵⁴ , toevoeging van kleineMoleculen ⁵⁵ , 3D-cultuur ⁵⁶ , co-cultuur met andere celtypen ⁵⁷ , en zelfs een combinatie van deze benaderingen ⁵⁸ ; Tot op heden heeft geen van deze benaderingen geleid tot een volwassen soort fenotype.

Als onderdeel van de onvolwassenheidsfuncties tonen hPSC-CM's elektrische automatisering. Hier worden details gegeven over de nauwkeurige kwantificering van QT- en RR-intervallen. Eén beperking van het meten van spontane elektrische activiteit is dat vergelijking van QT-intervallen moeilijk kan zijn wanneer hPSC-CM's verschillende klopfrequenties tonen. In dit geval kunnen de formules van Bazett of Fridericia worden gebruikt om het QT-interval voor de frequentie te corrigeren. Zoals eerder gerapporteerd ³⁰ , raden we sterk aan om Major-Axis regressieanalyse te verrichten door het QT-interval tegen RR-interval op te stellen voor zowel ruwe als gecorrigeerde data, om eventuele vooroordeel weg te nemen door de correctiemethode zelf.

Het hier gepresenteerde protocol, samen met de eerder beschreven methoden ^{59 , 60,} helpt de standaardisatie van de procedures en de analyse van hPSC-CM FP's, verbetering van de data reproduceerbaarheid en het mogelijk maken van een betere vergelijking van inter-laboratoriumresultaten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Biologische veiligheidskast/laminaire stroming-kap	Cleanair
MEA2100 in vitro opnamesysteem	Multi Channel Systems
CO2 cel-kweekincubator	Sanyo	MCO-15A
Centrifuge	Hitachi	himac-CT6EL
Leica stereomicroscoop	Leica Microsystems	MS5
Handbediende pipetman (P-10 (10 µL), P-200 (200 µL), P-1000 (1.000 µL))	Gilson International
Filtertips (10 µL, 200µL, 1.000µL)	Corning	4807 (10 µL), 4810 (200µL), 4809 (1000µL)
Wegwerp flesdopfilter (0,22 µm poriegrootte)	Millipore	SCGVU02RE
Steriele plastic pipet	Greiner Bio-One	606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
Pincet	Dumont
Autoclaveerbare petrischalen	VWR/ Duran Group	391-0860
MEA chip	Multi Channel Systems	MEA200/30iR-Ti-gr
Fosfaat-gebufferd zout (PBS) calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040-091
Fosfaat-gebufferd zout (PBS) geen calcium, geen magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190-169
Humaan recombinant fibronectine	Tebu-Bio	J64560
Op maat gemaakte polytetrafluorethyleen (PTFE) MEA-ringen	LUMC: afdeling Instrumentontwikkeling
Dissociatie-enzym - TrypLE Select 1x	Thermo Fisher Scientific	12563-029
Tergazyme enzymdetergent	Sigma-Aldrich	Z273287-1EA
Gedestilleerd water	Thermo Fisher Scientific	15230-089
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia voor LI-BPEL-medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	21056-023
F12 voedingsmengsel (Ham)	Thermo Fisher Scientific	31765-027
Ascorbinezuur 2-fosfaat	Sigma-Aldrich	A8960
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-038
Penicilline/Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15070-063
Fenolrood	Sigma-Aldrich	P3532
Eiwitvrij Hybridoma Medium-II (PFHMII)	Thermo Fisher Scientific	12040-077
Rundserumalbumine (BSA)	Bovogen Biologicals Australia	BSAS05
Poly(vinylalcohol) (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat (CDLC)	Thermo Fisher Scientific	11905-031
Insulin-Transferrine-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100x	Thermo Fisher Scientific	51599-056
α-Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
Naam	Bedrijf	Softwareversie	Opmerkingen
MC_Rack	Multi Channel Systems	4.6.2	Alternatief kunnen gegevens worden opgenomen met Cardio2D of MC_Experimenter (MultiChannel Systems)
TCX Control	Multi Channel Systems	1.3.4
MEA Select	Multi Channel Systems	1.3.0
MC_Data Tool	Multi Channel Systems	2.6.15	Alternatief kan Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) worden gebruikt wanneer aangepaste gegevensexport vereist is (HDF5, EDF, etc.)
Clampfit	Molecular Devices	7.0.0	Gebruikt in stap 10.1 voor het analyseren, weergeven en opmaken van alle gegevens. Om Clampfit te gebruiken, download en installeer de elektrofysiologische data-acquisitie en pClam (nieuwste versie, 10.7.0), beschikbaar op de website van Molecular Devices. Na voltooiing start u de software Clampfit. Alternatief kunnen gegevens worden geanalyseerd met behulp van Cardio2D (MultiChannel Systems) of MatLab aangepaste code.