Methodenartikel

Een Chronisch Autoimmuun Droog Oog Rat Model Met Toename In Effector Geheugen T Cellen In Oogappel Weefsel

DOI:

10.3791/55592

⸱

7 juni 2017

 ,  ,  , 
1Singapore Eye Research Insitute, A Member of SingHealth, 2DUKE-National University of Singapore Medical School, 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 4Singapore National Eye Center, 5Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit rapport beschrijft een methode om chronische experimentele auto-immuun droge ogen in Lewis-ratten te induceren door middel van immunisatie met een emulsie van ratlakakalextract, ovalbumine en complete Freund's adjuvans, gevolgd door de injectie van lacrimale klier extract en ovalbumine in de forniceal subconjunctiva en lacrimale klieren Zes weken later.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Droge oogziekte is een zeer voorkomende aandoening die zorgt voor morbiditeit en gezondheidszorg en vermindert de kwaliteit van het leven. Er is behoefte aan een geschikt model met droge ogen, om nieuwe therapieën te testen om auto-immuun droge ogen te behandelen. Dit protocol beschrijft een chronisch auto-immuun droog oog rat model. Lewis-ratten werden geïmmuniseerd met een emulsie die lacrimale klier extract bevat, ovalbumine en complete Freund's adjuvans. Een tweede immunisatie met dezelfde antigenen in het incomplete Freund's adjuvans werd twee weken later toegediend. Deze immunisaties werden subcutaan aan de basis van de staart toegediend. Om de immuunrespons bij de oculaire oppervlakte- en lacrimale klieren te stimuleren, werden 6 weken na de eerste immunisatie injectie van lacrimal gland extract en ovalbumine in de forniceal subconjunctiva en lacrimale klieren. De ratten ontwikkelden droge oogkenmerken, inclusief verminderde traanproductie, verminderde traanstabiliteit en verhoogde cornea schade. Immuun proFiling door flow cytometry vertoonde een overwegendheid van CD3 + effector geheugen T cellen in de oogballon.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dauw oogziekte (DED) is een multifactorische ziekte van de tranen en het oogoppervlak dat resulteert in symptomen van ongemak, visuele stoornis en onstabiliteit van de traanfilm, die kan leiden tot schade aan het oculaire oppervlak. Het gaat gepaard met verhoogde osmolariteit van de traanfilm en door ontsteking van het oculaire oppervlak 1 . Symptomen die verband houden met DED zijn branden, steken, grittigheid, gevoel van vreemde lichaamsbeweging, scheuren, oculaire vermoeidheid en droogheid 2 , 3 . De twee belangrijkste oorzaken van DED verminderen de traanproductie door de traanafscheidingsklier en de overmatige verdamping van de traanfilm 4 . Bij patiënten met auto-immuunziekten, zoals Sjogren syndroom, systemische lupus erythematosus en reumatoïde artritis, veroorzaken immuunschade aan de meibomische klieren de expressie van lipiden die essentieel zijn voor traanstabiliteit. Ook vermindert de immuunschade aan het oculaire oppervlak het productiAan mucins die belangrijk zijn voor oppervlakte bevochtiging. Samen veroorzaken deze processen cumulatief chronisch droog oog 5 , 6 , 7 .

Scheurvervanging en anti-inflammatoire therapie zijn de hoofdsteunen van de therapie. De huidige anti-inflammatoire therapieën voor DED ( dwz corticosteroïden en cyclosporine) zijn echter immuunonderdrukkend, wat leidt tot ernstige bijwerkingen 8 , 9 , 10 . Er is behoefte aan een geschikt diermodel om nieuwe immunomodulerende middelen te testen om auto-immuun droog oog te behandelen.

Muizen met specifieke genetische defecten 11 , 12 , 13 , muizen die specifieke genen 14 , 15 en transgene muizen ontbreken die immunoregulaat overexpresserenOry genen zijn gebruikt als modellen van auto-immuun droge oog 16 , 17 . Antigeen-geïnduceerde auto-immuundiermodellen zijn ook gemeld in muizen 18 , konijnen 19 en ratten 20 , 21 . Hier beschrijven we een antigeen-geïnduceerd model van chronisch auto-immuun droog oog. Dit model is een wijziging van twee eerdere modellen; Één gebruikte lacrimale klier extracten, en de tweede gebruikte een autoantigen ( dwz klk1b22) van de lacrimal klieren 20 , 21 .

De ziekte werd geïnduceerd door de subcutane immunisatie van 6 tot 8 week oude vrouwelijke Lewis ratten met ovalbumine, complete Freund's adjuvans, en een emulsie die lacrimale extracten bevat van Sprague-Dawley ratten ( Figuur 1 ). Een tweede immunisatie met hetzelfde antigeen in incomplete Freund's adjuvans wasTwee weken later toegediend. Om antigenspecifieke immuuncellen aan de lacrimale klier en het oogoppervlak te werpen, werd het mengsel van lacrimale klier extract en ovalbumine (1 mg / ml) op de 6e - 7e week geïnjecteerd in de forniceal subconjunctiva en lacrimale klieren ( Figuur 1 ). Meer dan 85% van de ratten ontwikkelden kenmerkende eigenschappen van het droge oog 70 dagen na de eerste immunisatie. Deze eigenschappen omvatten verminderde traanproductie ( Figuur 2 ), verhoogde corneale fluoresceinverf ( Figuur 3 ), en verminderde traanstabiliteit ( Figuur 4 ). Immuunprofielen van de T-cellen in de oogbollen van normale ratten door flowcytometrie onthullen een overweging van CD3 + effector-geheugen T-cellen ( Figuren 5 en 6 ). Ratten met autoimmune DED tonen een toename in CD3 + effector geheugen T cellen en een overeenkomstige afname in naïeve en centrale geheugen T cellen ( Figuur 6 ).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieren werden behandeld volgens de institutionele richtlijnen en de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oog- en visieonderzoek. Het studieprotocol werd goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van SingHealth.

1. Bereiding van Lacrimal Gland Extract

OPMERKING: Ratten werden verdoofd met de intraperitoneale injectie van ketamine (75 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Behoorlijke verdoving werd bevestigd door teen knijpen en staart knijpen. Oftalmische gel werd aangebracht op de rat ogen om droogte na elke procedure te voorkomen. De verdovende ratten werden onder verre infraroodlampen geplaatst om de dieren warm te houden tot ze volledig hersteld werden. Tijdens de procedures en de hersteltijd werden dieren nauwlettend gecontroleerd door onderzoekers. Alle materialen en chirurgische gereedschappen waren steriel voor gebruik. Aan het einde van het experiment werden ratten geëuthaniseerd door de intraperitoneale injectie van pentobarbital (80 mg / kg).Volledige euthanasie werd geverifieerd door een gebrek aan hartpuls en geen blinkreflex door de oogballen aan te raken. Ratten werden gehuisvest in standaard omstandigheden: kamertemperatuur, 21-23 ° C; Relatieve luchtvochtigheid, 30-70%; Licht-donkere cyclus, afwisselend 12 uur (7 uur tot 7 uur).

  1. Plaats de geëuthaniseerde vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (leeftijd van 8 weken tot 16 weken) vlak, met één oor tegen de tafel en de andere naar boven. Maak een 10 mm incisie superieur-inferiorly onder het blootgestelde oor met een paar lentenschaar. Verwijder de lacrimale klier door dissecteren van het omliggende bindweefsel en van de afvoerleiding.
    1. Bewaar de klieren bij -80 ° C totdat dit nodig is. Doe de klieren op ijs. Gehakt zo fijn mogelijk op ijs met een schaar. Voeg 150 μL PBS toe met 1x proteaseremmer per lacrimale klier.
  2. Soniceer de monsters op ijs gedurende 5 minuten bij 20 kHz met de sonicator ingesteld op 10 s aan, 10 s uit bij 30% amplitude. Centrifugeer de zoonGegoten monsters gedurende 20 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C.
  3. Pipet de supernatant en breng het over naar een nieuwe buis. Aliquot de supernatant naar 1,5 ml buizen en sla ze op -80 ° C. Meet de eiwitconcentratie met een bicinchoninezuurassay 22 volgens de instructies van de fabrikant.

2. Bereiding van Emulsie en Pertussis Toxine

  1. Emulsie
    1. Voeg 40 mg warmte-gedood Mycobacterium tuberculosis H37Ra toe in 10 ml compleet Freund's adjuvans dat 1 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra bevat en meng goed.
      OPMERKING: De uiteindelijke complete Freund's adjuvante bevat 5 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
    2. Weeg het ovalbumine, oplos het in PBS en berei een antigeenmengsel op met 2 mg / ml ovalbumine en 10 mg / ml lacrimale klier extract. Voor een injectievolume van 200 μL voor elk dier, bereiden een meermengsel bAls op de dierengetallen.
    3. Breng onvolledige Freund's adjuvant over of voeg Freund's adjuvans toe aan een 50 ml buis, zodat de hoeveelheid adjuvans aan het antigeenmengsel in een verhouding van 1: 1 ligt. Voeg de antigeenmengsel drop-by-drop toe aan het adjuvans, terwijl de vortexing met de hoogste snelheid niet leidt tot morsen. Blijf vortexeren gedurende 5 minuten nadat al het antigeen is toegevoegd.
    4. Breng de emulsie over op een 5 ml spuit en verbind deze met een andere 5 ml spuit via een injectiespuit. Duw de emulsie van de ene spuit naar de andere om het te mengen.
      OPMERKING: De emulsie is klaar als een enkele druppel als een bol blijft als het in water wordt geplaatst. Alleen vers bereide emulsies of emulsies die nachtelijk bij 4 ° C worden opgeslagen, dienen te worden gebruikt.
  2. Pertussis toxine
    1. Reconstitute 50 μg pertussis toxine in 500 μl water om een ​​uiteindelijke concentratie van 100 ng / μL te maken. Votex de container gedurende 30 s om ervoor te zorgen dat de tOxine lost volledig op.
      OPMERKING: Steriliseer niet door filtratie, omdat dit materiaalverlies zal veroorzaken. Niet bevriezen. Deze oplossing blijft gedurende minstens 6 maanden bij 4 ° C actief.
    2. Verdun 100 ng / μL pertussis toxine tot 3 ng / μl met behulp van PBS. Breng 100 μL van het verdunde pertussis toxine over op een 1 ml Luer-lock injectiespuit met een 27 G-naald.

3. Immunisatie van de Lewis-ratten

  1. Op dag 0 meng de emulsie een paar keer. Verdeel 200 μL van de emulsie, die 1 mg lacrimale extract bevat en 200 μg ovalbumine in complete Freund's adjuvans, in 1 ml Luer-lock spuiten met 27G naalden. Spuit de emulsie subcutaan aan de basis van de ratstaarten zonder verdoving.
    OPMERKING: De staart hoeft niet voorverwarmen te worden vóór de injectie. Elke rat wordt geïmmuniseerd met 1 mg lacrimale klier extract en 200 μg ovalbumine in complete Freund's adjuvans witH 500 μg Mycobacterium tuberculose H37Ra.
  2. Op dag 14 injecteer 200 μl van de emulsie, die 1 mg lacrimale extract en 200 μg ovalbumine in onvolledig adjuvant Freund bevat, op dezelfde wijze als op dag 0. Spuit 300 ng pertussis toxine in 100 μl PBS intraperitoneaal Per rat op dezelfde dag.

4. Injectie van het Antigene Mengsel in het Forniceal Subconjunctiva en Lacrimale Klier om Antigenspecifieke Immuuncellen Recruit En Oorzaak Lokale Ontsteking

  1. Bereken het aantal ovalbumine- en lacrimale klier extract op basis van het aantal ratten in het experiment. Weeg de benodigde hoeveelheid ovalbumine en combineer het met het ontdooide lacrimale klier uittreksel bereid in stap 1, waarbij een antigeen oplossing die 1 mg / ml ovalbumine en 1 mg / ml lacrimale klier extract bevat.
  2. Verdoof de ratten met ketamine (75 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) door intraperitoneale injectie. Knijp het aanVan ratten om ervoor te zorgen dat de juiste verdoving is bereikt ( dwz, geen responsieve beweging wordt waargenomen na de knijp). Spuit 5 μL antigeen in de forniceale subconjunctiva van het oog. Injecteer 20 μl antigeen in de lacrimale klier.

5. Beoordeling van de eigenschappen van de droge ogen

OPMERKING: Voor stappen 5.1-5.3 moeten de verdovende ratten voorzichtig worden gehouden met een handgeschoven hand in een rechtopstaande positie op een vlakke ondergrond om beweging te vermijden.

  1. Meet het traanvolume met fenol rode draad.
    1. Gebruik een paar tang om de draad vast te houden en een ander om de onderste ooglid van de rat te trekken. Plaats de draad in de proximale hoek van de onderste fornix gedurende 1 minuut en verwijder vervolgens de draad.
      OPMERKING: Tranen maken het bevochtigde deel van de draad rood van kleur.
    2. Neem een ​​afbeelding van de lengte van het bevochtigde deel van de draad naast een liniaal met millimeter markeringen. Meet de bevochtigde lengte op de tiende oFa millimeter met behulp van een beeldsoftware ( bijv. ImageJ).
  2. Meet de hoornvliesheid / cornea.
    1. Plaats de rat onder een stereomicroscoop uitgerust met een ringverlichting en een camera. Breng 5 μl zoutoplossing aan op de hoornvlies van de rat. Knipper passief door de bovenste en onderste oogleden te bewegen met glove vingers ~ 5 keer om de zoutoplossing te verspreiden.
    2. Focus de ringverlichting op het midden van het hoornvliesoppervlak onder 1,6x vergroting. Verkrijg fotografische beelden na 10 s.
      OPMERKING: De ringverlichting projecteert twee cirkelvormige rijen stippenbeelden op de hoornvlies van het dier. Regelmatige verdeling van de onverteerde stippen suggereert een gladde hoornvlies / scheurlaag.
  3. Meet cornea schade met fluorescein kleuring.
    1. Voeg 2 μL 0,2% fluoresceïne toe aan de hoornvlies van de rat. Open de schouderlidleden 3 keer passief en sluit deze met een glove vinger om de fluoresceine kleurstof op het oppervlak van het oog te verspreiden.
    2. Na 1 minuut trek 1 ml zoutoplossing met een 3 ml spuit (zonder naaldbevestiging), plaats de spuit ongeveer 2-3 mm voor de hoornvlies, en breng zout op het oog zachtjes.
    3. Verkrijg beelden onder het kobaltblauw filter ( dwz ~ 400 nm) van een oculaire beeldmicroscoop met de achtergrondlampjes uitgeschakeld.
      OPMERKING: Beelden werden vervolgens geanalyseerd door een cijfersysteem dat is gewijzigd van eerdere publicaties 23 . Beelden werden vervolgens geanalyseerd door het aantal, de oppervlakte en de intensiteit van de groene vlekken van 0 tot 2 individueel te classificeren, waar 0 hun afwezigheid aangeeft, 1 wijst op punctaatkleuren van minder dan 50 plekken en 2 wijst op punctaatkleuring van meer dan 50 plekken.
  4. Euthanize de ratten door de intraperitoneale injectie van pentobarbital (80 mg / kg). Verwijder de bovenste en onderste oogleden met behulp van een schaar. Bevestig en prolaps de oogballen door op de perioculaire weefsels te drukken met tang. Bevrijd de wereld door t te scheidenHij extraoculaire spieren, de optische zenuw en het forniceal conjunctiva.
  5. Bevestig de positie van de rat-oogballetje met tang en open deze met een omtrek in de hoek van de equator. Verwijder de lens en glazen. Zet de gedroogde oogballen in 1,5 ml buizen op ijs.
  6. Verzamel de lacrimale klieren, zoals beschreven in stap 1.1. Breng de gedissendeerde ooglapweefsels en lacrimale klieren onmiddellijk door naar het laboratorium om voor de flowcytometrie-analyse voor te bereiden.
  7. Geïsoleerde de immuuncellen met collagenase en dispas II digestiemethoden 24 , 25 . Ga verder met gebruik van stromingscytometrie om de T-cel subpopulatie in de ooglapweefsels te profileren 26 .
    OPMERKING: Het paneel van antilichamen zijn: anti-CD45APC-Cyanine7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22) -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50) en levensvatbaarheidscel kleurstof 7-AAD. Onder de CD45 + CD3 + 7AAD - populatie, naïef (CD3 + CD45RC + ), effectorgeheugen (T EM, CD3 + CD45L - ), en centraal geheugen (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) .

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 illustreert het experimentontwerp. Op beide dagen 48 en 70 worden klinische eigenschappen van de droge ogen in de geïmmuniseerde ratten beoordeeld. Het traanvolume wordt weergegeven door de lengte van het natte deel van de fenol rode draad. Figuur 2 toont representatieve afbeeldingen van fenol rode draden van controle- en DED-ratten. De lengte van de fenol rode draden in de DED-groep is korter dan de controlegroep, wat minder traan volume aangeeft.

Fluoresceïne bindt aan beschadigd hoornvliesepitheel. Aldus wordt cornea schade gemeten door cornea fluorescein kleuring. Fluoresceinvlekjes op het hoornvliesoppervlak van DED-ratten werden gegradeerd van 0 tot 2 en vergeleken met controle ratten. Ratten met DED hebben meer fluoresceine kleuring dan controle ratten ( Figuur 3 ), wat leidt tot cornea schade.

De gladheid van de hoornvliesIn DED en controle werden ratten beoordeeld door de ringverlichting. Als het hoornvliesoppervlak glad is, met een hoge traanstabiliteit, is het beeld van de verlichtingsring op het oculaire oppervlak ronde en perfect. Distortie van het beeld geeft een verminderde gladheid van de hoornvlies en een onstabiele traanfilm. De vervormingsgraad van de ring werd gegradeerd van 0 tot 2. Een hoger ringvervormingsniveau werd genoteerd in de DED-groep ( Figuur 4 ), wat minder traanstabiliteit aangeeft.

Ratten worden gedefinieerd als droog oog wanneer ten minste twee klinische kenmerken van droog oog abnormaal zijn. Van de 24 geïmmuniseerde ratten ontwikkelden 21 ratten DED op dag 48. De resultaten waren consistent bij evaluatie op dag 70.

De flowcytometrie analyse toont aan dat de overheersende T-cel subset in normale rattenoogballenweefsels effector geheugen T cellen zijn ( Figuur 5 ). In de oogbollen van DED-ratten, ~ 70% van de CD3+ T-cellen zijn effectorgeheugen T-cellen, terwijl deze in controle ratten is ~ 50%. Oogballetjes van DED-ratten hebben significant hogere effectorgeheugen T-cellen dan die van controle-ratten ( Figuur 6 ).

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch van het experimentele ontwerp. LG: lacrimale klier; DED: droge oogziekte; CFA: compleet Freund's adjuvans; IFA: incomplete Freund's adjuvans. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Fenol rode draad meet het traan volume. Phenol rode draad wordt 1 minuut voor de proximale hoek van beide rat ogen geplaatst en wordt vervolgens verwijderd. representativE afbeeldingen van de fenol rode draad, samen met een liniaal, van zowel de controle als de DED groepen worden getoond. ImageJ werd gebruikt om de lengte van het nat deel van de fenol rode draden te meten. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve beelden van de epitheelchade van de hoornvlies, gemeten door fluoresceïneverf. Elke rotte hoornvlies werd gedurende 1 min met 0,2% fluoresceïne gekleurd en gespoeld met tenminste 1 ml zoutoplossing. Beelden werden genomen onder een oogbeeldmicroscoop met kobaltblauw licht. De eerste kolom toont representatieve afbeeldingen van controle hoornvlies. De tweede kolom bevat representatieve afbeeldingen van corneale kleuring van ratten met DED-eigenschappen. De groene fluorescerende vlekken wijzen op corneale epithelia L schade Alle afbeeldingen werden op dezelfde kleurschaal geproduceerd. De kwantificering van fluoresceinkleuring werd uitgevoerd volgens het gebied en de dichtheid van de groene vlekken. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Representatieve Cornea Beelden tonen de reflectie van de belichtingsverlichting. Ratkorneale / traanvlotheid werd gemeten met een ringverlichting. De vervormingsgraad van de ring in de opgenomen beelden is een maat voor relatieve traanstabiliteit. De linkerkolom toont de representatieve afbeeldingen in controledieren, en in de rechterkolom worden representatieve beelden weergegeven na de inductie van droog oog. Schaalbalk = 1 mm.Ank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

figure-results-5
Figuur 5: Dot Plots afgeleid van Flow Cytometry Analysis. T-cellen die zijn geïsoleerd uit ooglapweefsels werden gekleurd met een paneel antilichamen. In de CD45 + CD3 + 7AAD - populatie werden CD3 + 7-AAD - T cellen gated. Onder de CD3 + 7-AAD - T-cellen werden de T-celpopulaties naïeve, centrale geheugen en effectorgeheugen bepaald. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: T-cel subpopulatie profiel in de oogballen. CD3 + CD45RC+ Naïeve T cellen, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - effector geheugen T (T EM ) cellen en CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + centrale geheugen T (T CM ) cellen worden gepresenteerd als het percentage CD3 + T cellen. Resultaten komen uit 3 controle ratten en 6 DED ratten. Vergelijkbare resultaten werden verkregen uit de analyse van T-cellen uit geïsoleerde lacrimale klieren (data niet getoond). De unpaired Student's t-test werd gebruikt voor statistische vergelijking. De foutbalken staan ​​voor de SD. * P <0,05, ** p <0,01. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een kritische stap van dit protocol is het verzekeren van de homogeniteit van de emulsie. Bij goed bereide emulsies worden de antigenen volledig bedekt met olie, waardoor de langzame afgifte van het geïnjecteerde antigen en de voortdurende immuunstimulatie wordt gewaarborgd. Een ander belangrijk kenmerk van dit protocol is het gebruik van Lewis ratten. Lewis-ratten zijn gevoeliger voor de ontwikkeling van auto-immuunziekte dan andere stammen 27 .

Dit protocol is gewijzigd uit twee eerder gepubliceerde protocollen, die alleen lakrimale klier extract of recombinant Klk1b22 20 , 21 gebruikt . In het huidige protocol worden ovalbumine plus lacrimale klier extract gebruikt als antigeen, en antigeen-specifieke immuuncellen worden aangetrokken tot het oculaire oppervlak en de lacrimale klier, waardoor lokale weefselschade wordt veroorzaakt. Droog oog ontwikkelt langzaam en bereikt ~ 85% per dag 48 na de eerste immunisatie. Antigenische uitdaging aan deOog- en lacrimale klier op dag 48 verergert het droge oog en zorgt ervoor dat de chroniciteit tot dag 70 wordt gewaarborgd.

In vergelijking met de recombinante Klk1b22 in het Klk-geïnduceerde DED-model, zijn de lacrimale klier extract en ovalbumine gebruikt in het huidige model goedkoper en gemakkelijker te verkrijgen. Het lacrimale klier extract bevat ook andere eiwitten, afgezien van Klk, die auto-immuniteit kan induceren, dus dit extract is theoretisch krachtiger dan de Klk-methode bij het induceren van DED. We hebben ook geprobeerd alleen ratten te immuniseren met lacrimale klier extract. Hoewel deze geïmmuniseerde ratten DED ontwikkelden, was er geen significante toename van effector-geheugen T-cellen in ooglapweefsels vergeleken met controles.

De beperking van deze techniek is dat het 70 dagen duurt om het model te bereiken. Effector geheugen T cellen zijn de belangrijkste T-cel subsets in het normale rat oog. In dit model resulteert auto-immune DED in een toename van CD3 + effector geheugen T cellen in de oogballon. Drugs die prefT-cellen, zoals selectieve remmers van het Kv1.3 kaliumkanaal, kunnen derhalve een therapeutisch voordeel hebben op auto-immuun DED 28 .

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten. LT heeft voorafgaande financiering en / of cadeaus ontvangen van Alcon, Allergan, Santen, Bausch en Lomb, Eyelens en Eyedetec.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen mevrouw Tin Min Qi en Dr Veluchamy Amutha Barathi en haar team bedanken voor hun hulp bij de behandeling van de dieren. Dit werk werd ondersteund door NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 en NMRC / CSA / 045/2012.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Pierce BCA Protein Assay KitThermal Scientific23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Becton, Dickinson and company231141
complete Freund's adjuvantBecton, Dickinson and company231131
ovalbuminSigma-AldrichA5503-10G
incomplete Freund's adjuvant Sigma-AldrichF5506-6X10ML
pertussis toxin Sigma-AldrichP7208-50UG
fluorescein sodium solutionBausch & Lomb U.K LimitedNA
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Uitrusting
SonicatorSonics Vibra-Cell
phenol red draadTianjin Jingming New Technological development Co. LTD.NA
Stereo microscoop met ringlichtverlichting en cameraCarl ZeissNA
Micro IV microscoop Phoenix Research LabsNA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).
  2. Gayton, J. L. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).
  3. Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. The dry eye. Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).
  4. Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).
  5. Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403(2014).
  6. Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).
  7. Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).
  8. Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids. Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).
  9. Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations. Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).
  10. Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye. J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).
  11. Ishimaru, N., et al. Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis. Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).
  12. Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells. Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).
  13. Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice. Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).
  14. Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome. Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).
  15. Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
  16. Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice. Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).
  17. Shen, L., et al. Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice. J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).
  18. Hayashi, Y., Hirokawa, K. Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice. Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).
  19. Liu, S. H., Zhou, D. H. Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).
  20. Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).
  21. Jiang, G., et al. A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).
  22. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  23. Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride. Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
  24. Cousins, S. W., Streilein, J. W. Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).
  25. Yawata, N., et al. Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection. Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).
  26. Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells. Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).
  27. Goldmuntz, E. A., et al. The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains. J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).
  28. Cahalan, M. D., Chandy, K. G. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Traanklier extractflowcytometrie analysesubcutane immunisatiesubconjunctivale injectiebeoordeling van hoornvliesbeschadigingmeting van traanvolumerattoogmodelimmuunprofilering

Gerelateerde artikelen