Hier beschrijven we een nieuwe aanpak om traumatisch hersenletsel in Drosophila melanogaster te veroorzaken . Onze methode heeft het voordeel om herhaalde effecten te leveren met instelbare sterkte aan het hoofd alleen. Verdere verkenning van het ongewervelde systeem zal helpen bij het verlichten van de pathogenese van chronische traumatische encefalopathie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een nieuwe methode om chronische traumatische encefalopathie te modelleren in
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chronische Traumatische Encefalopathie (CTE) is een gevestigde neurodegeneratieve ziekte die nauw verband houdt met blootstelling aan herhalende milde traumatische hersenletsel (mTBI). De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor zijn complexe pathologische veranderingen blijven grotendeels ontwijkend, ondanks een recente consensus om de neuropathologische criteria te definiëren. Hier beschrijven we een nieuwe methode om een model van CTE in Drosophila melanogaster ( Drosophila ) te ontwikkelen in een poging om de belangrijkste genen en pathways te identificeren die leiden tot de kenmerkende hyperfosforyleerde tau-accumulatie en neuronale dood in de hersenen. Verstelbare sterkte-effecten om zacht gesloten letsel te veroorzaken worden direct aan de vliegkop afgeleverd, waarbij het hoofd wordt onderworpen aan snelle versnelling en vertraging. Onze methode elimineert de mogelijke problemen die inherent zijn aan andere Drosophila mTBI-modellen ( bijv. De dierlijke dood kan worden veroorzaakt door schade aanAndere delen van het lichaam of aan inwendige organen). De minder arbeids- en kostenintensieve dierenverzorging, korte levensduur en uitgebreide genetische hulpmiddelen maken de vruchtvlieg ideaal om CTE pathogenese te bestuderen en het mogelijk maken grootschalige genoomwijdte genetische en farmacologische schermen te verrichten. We anticiperen dat de voortgaande karakterisering van het model belangrijke mechanistische inzichten zal genereren over ziektepreventie en therapeutische benaderingen.
Inleiding
Chronische Traumatische Encefalopathie (CTE) is onlangs herkend als een duidelijke neurodegeneratieve stoornis, los van andere tauopathieën zoals de ziekte van Alzheimer 1 . In tegenstelling tot de ziekte van Alzheimer en andere algemene tauopathieën - waarvan de belangrijkste risicofactoren de leeftijd en de familiegeschiedenis van dementie bevorderen, betekent CTE, zoals aangegeven door haar naam, een nauwe band met een geschiedenis van hersentrauma, die waarschijnlijk wordt gezien bij contactsporters, Zoals boksers en voetballers, evenals in militaire veteranen 2 , 3 , 4 , 5 . Het wordt vermoedelijk geïnitieerd door herhaaldelijke hersenschudding en subconcussieve klachten aan het hoofd. Patiënten kunnen symptomen en tekenen zoals cognitieve tekorten, stemmings- en gedragsveranderingen en bewegingsstoornissen voordoen, die aanzienlijk overlappen met de ziekte van Alzheimer, frontotemporaleDementie, Lewy body dementie en de ziekte van Parkinson 6 . Daarentegen onthullen post mortemonderzoeken van hersenweefsel een duidelijk patroon van hyperfosforyleerde tau-accumulatie rond kleine bloedvaten bij de diepten van de corticale sulci, een pathognomonale functie die niet in de andere degeneratieve aandoeningen is waargenomen 7 . Maar tot nu toe is zeer weinig bekend over de pathogenese die leidt tot ziekte manifestatie. Dit komt voornamelijk toe door het gebrek aan een getrouw diermodel - pas onlangs zijn knaagdiermodellen gegenereerd 5 , 8 . Deze modelorganismen hebben de nadelen van kostenintensieve zorg en een relatief lange levensduur, die niet goed geschikt zijn voor neurodegeneratieve ziekteonderzoeken.
In vergelijking met zoogdieren tegenhangers zijn ongewervelde dieren zoals Drosophila een uitstekend alternatief, met hun kosteneffectieve onderhoud,Uitgebreide hulpmiddelen voor het dissecteren van genetische determinanten, en een relatief korte levensduur 9 . Opmerkelijk delen, vliegen en menselijke hersenen evolutionair geconserveerde moleculaire en cellulaire wegen, evenals anatomische overeenkomsten 10 , 11 , 12 . Twee ingenieuze Drosophila modellen om traumatisch hersenletsel te bestuderen zijn eerder gerapporteerd 13 , 14 . Het eerste 'High Impact Trauma' (HIT) -apparaat, ontworpen door Katzenberger en collega's, bevatte vrij bewegende vliegen in een plastic flesje die vastgebonden was aan het vrije uiteinde van een metalen veer 13 , 15 . Toen de plastic flesje rechtop werd gekanteld en losgelaten, raakte het een polyurethaanpaneel en bracht trauma aan de vliegen toe, terwijl ze naar de flesmuur stoot en teruggingen. In tegenstelling tot hebben Barekat en collega's ons een andere leveringsmethode ontwikkeldIn het Omni Bead Ruptor-24 homogenisatorplatform 14 . Vliegen waren onbekwaam met CO 2 en geplaatst in een 2 ml schroefdopbuis die aan de homogenisator was bevestigd en onderworpen aan vooraf geprogrammeerde schudtoestanden. Een voordeel van het gebruik van het weefselhomogenisatorsysteem is dat de experimentator de intensiteit van de verwonding, de duur van de blessure en het aantal letselschade kan moduleren. Echter, beide regimes hebben hetzelfde nadeel: primaire verwondingen aan het hoofd worden willekeurig toegebracht in termen van de plaats van impact en kracht. Bovendien leidden beide methoden tot aanzienlijke sterfte, veroorzaakt door onvermijdelijk schade aan andere delen van het lichaam en inwendige organen. Hier beschrijven we een nieuwe methode om mTBI in fruitvliegen te veroorzaken. Ons apparaat bestaat uit een gasdreven ballistische impactor. In vergelijking met de bestaande Drosophila modellen 14 , 15 , heeft onze methode het unieke voordeel van het leveren van measHaalbare impact, die alleen gericht is op het vrij bewegende vliegkop, waardoor de nauwkeurige controle van verschillende factoren, zoals de ernst van de impact, het tijdsinterval tussen de impact en het totale aantal effecten die worden opgelopen, kunnen worden gecontroleerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Montage van het Strike Device ( Figuur 1 )
- Verwijder de plunjer uit een 1 ml tuberculinespuit. Knip het vat met 1 ml af.
- Verwijder een aerosolbarrière (3 mm hoogte x 4 mm diameter) van een 200 μL pipettip en gebruik deze als een slagbuis. Plaats de schok in de spuitvat. Tap het vat voorzichtig om de slaginrichting naar het uiteinde te verplaatsen, met de vlakke zijde die de mondstukopening bedekt.
- Bevestig het uiteinde van het vat aan de plastic buis die is aangesloten op de kooldioxide (CO 2 ) stromingsregelaar van een Drosophila anesthesie station.
- Houd het vat verticaal vast en knijp het aan op een standaard klemhouder, zodat de schroef aan de onderkant van het vat blijft.
- Wijzig een 200 μL pipettip om de vlieghouder te maken.
- Knip 4 mm van de punt om een opening van 0,8 mm te maken waardoor alleen de vliegkop blootgesteld kan worden.
OPMERKING: De thoRax en alle andere delen van het vlieglichaam blijven binnen in de pipettip.
- Knip 4 mm van de punt om een opening van 0,8 mm te maken waardoor alleen de vliegkop blootgesteld kan worden.
- Wijzig een 1.000 μL pipettip en een 1 ml spuit naaldkap om de connector te maken.
- Afsnijd 44 mm vanaf de opening van de punt. Neem een 6 mm lengte van een 1 ml spuit naaldkap en duw het stevig in het overblijvende segment van de 1000 μL pipettip.
2. Bediening van het Strike Device
- Verdoof een enkele 2-daagse volwassen vrouwelijke vlieg met behulp van CO 2 op een vliegkussen.
- Zet het voorzichtig naar de vlieghouder met een fijne borstel. Tik de houder voorzichtig op, zodat de vliegkop buiten het uiteinde wordt gezien. Als de vliegproblemen buiten het uiteinde wordt blootgesteld, steek het met een stompe 1 ml spuitnaald voorzichtig terug in de punt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de vliegproblemen in de houder houdt. Anders kan de vlieg van een zuigende proboscisbeschadiging sterven. - Draai de vlieg hoGa naar de spuitvat met de connector zodat de vliegkop naar beneden gericht is.
- Stel de gasdruk bij 100 kPa in. Stel de stromingssnelheid in volgens het experimentontwerp.
- Draai de schakelaar van de regelregelaar snel in en uit zodat de schakelaar een keer de vliegkop trekt.
- Til de vlieghouder op en beweeg het over een vliegkussen. Draai de vlieghouder omlaag en druk de kant zachtjes om de vlieg uit te laten. Laat de vlieg in een lege injectieflacon achterhalen.
3. Video-assisted Movement Tracking
- Vul een Petri-schotel met 6 cm diameter met transparant silicium elastomeer om het tracé te maken. Laat een 3 mm ruimte tussen de silicon en het afdekplaatje om de vliegen vrij te laten lopen maar niet te vliegen.
- Verdoof elke keer vier vliegen van de sham of de behandelde groep en plaats ze in de arena. Laat de vliegen gedurende 1 uur bij 22 ° C liggen.
- Plaats een CCD-camera (CCD) boven de arena's en record gedurende 5 minuten.
- Analyseer de bewegende trajecten met behulp van Ctrax-software (vrij verkrijgbaar bij Caltech) 16 . Voer de opgeslagen gegevens uit in een programmeertaal (bv. Matlab) -compatibel formaat en analyseer de gegevens op basis van de afstand die per frame is gereisd 17 . Bereken de gemiddelde loopafstand voor elke vlieg en combineer het met alle andere opgenomen vliegen / groep om een gemiddelde cumulatieve afstand te verkrijgen die door de populatie van bestanden in dezelfde groep is gereisd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om een CTE-model op te stellen met behulp van volwassen Drosophila , hebben we de effectiviteit van ons apparaat bepaald door een enkele schade aan het hoofd te veroorzaken. Om de variaties die verband houden met genotype, geslacht of leeftijd te elimineren, hebben we 2-daagse Canton-S WT-vrouwelijke vliegen gebruikt in het experiment. We kunnen de sterkte van de impactor gemakkelijk regelen door de stromingssnelheid van CO 2 te reguleren bij een constante gasdruk v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Diermodellen die trouw model CTE-eigenschappen, met inbegrip van neurofysiologische veranderingen, neuropathologische kenmerken en neurobehaviorale tekorten, zijn essentieel voor het ontdekken van ziekte-mechanismen en voor het ontwikkelen van diagnostische en therapeutische doelen. Het is begrijpelijk dat geen diermodel van een menselijke ziekte perfect is om alle klinisch relevante eindpunten na te bootsen. Wij geloven echter dat een robuust CTE-model aan de volgende drie eisen moet voldoen: (1) de impact moet direct ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Dit werk werd ondersteund door het Johns Hopkins University School of Medicine faculty startup fonds aan LC
Dankbetuigingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Gebaten als een impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Gebaten als een vliegkophouder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Gebaten als een connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Gebaten als een volgarena |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
Referenties
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407(2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252(2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
