Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

Summary

Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan ​​uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.

Abstract

Functioneel herstel komt zelden voor als gevolg van letsel of door de ziekte veroorzaakte degeneratie in het centrale zenuwstelsel (CNS) door de remmende omgeving en de beperkte capaciteit voor neurogenese. We ontwikkelen een strategie om tegelijkertijd neuronale en axonale wegverlies in het beschadigde CNS aan te pakken. Dit manuscript presenteert het fabricageprotocol voor microweefselgemanipuleerde neurale netwerken (micro-TENNs), implanteerbare constructen bestaande uit neuronen en uitgelijnd axonale tracten die het extracellulaire matrix (ECM) lumen van een voorgevormde hydrogelcilinder overspannen, honderden micron in diameter die centimeter kunnen verlengen in lengte. Neuronale aggregaten zijn afgebakend aan de extremen van de driedimensionale omhulling en worden gespannen door axonale projecties. Micro-Tenns zijn uniek gepositioneerd als een strategie voor de reconstructie van het CNS, waarbij aspecten van de hersenbindende cytoarchitectuur worden geïmplementeerd en mogelijk middelen voor netwerkvervanging bieden. De neuRonale aggregaten kunnen samenvallen met gastheerweefsel om nieuwe functionele relais te vormen voor het herstellen en / of moduleren van ontbrekende of beschadigde schakelingen. Deze constructen kunnen ook fungeren als pro-regeneratieve "living scaffolds" die ontwikkelingsmechanismen voor celmigratie en axonale pathfinding kunnen exploiteren, die synergistische structurele en oplosbare signalen op basis van de staat van regeneratie verschaffen. Micro-Tenns worden vervaardigd door vloeibare hydrogel te gieten in een cilindrische vorm die een longitudinale centreerde naald bevat. Zodra de hydrogel gelegerd is, wordt de naald verwijderd, waardoor een holle microkolom wordt gelaten. Een ECM oplossing wordt toegevoegd aan het lumen om een ​​omgeving te verschaffen die geschikt is voor neuronale hechting en axonale uitgroei. Gedissocieerde neuronen worden mechanisch geaggregeerd voor precies zaaien in één of beide uiteinden van de microkolom. Deze methodologie produceert betrouwbaar zelfstandige miniatuurconstructen met langwerpige axonale tracten die de kenmerken van hersenneuranatomie kunnen herkapituleren. Synaptische immNiet-etiketterende en genetisch gecodeerde calciumindicatoren suggereren dat micro-TENN's uitgebreide synaptische verdeling en intrinsieke elektrische activiteit bezitten. Bijgevolg vormen micro-TENNEN een veelbelovende strategie voor gerichte neurochirurgische reconstructie van hersenwegen en kunnen ook worden toegepast als biofidelische modellen om neurobiologische verschijnselen in vitro te bestuderen.

Introduction

Een algemeen kenmerk van aandoeningen en ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS), zoals traumatisch hersenletsel (TBI), ruggenmergletsel (SCI), beroerte, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson, is de ontkoppeling van axonale wegen en neuronale cellen Verlies ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Bijvoorbeeld, wanneer een ischemische beroerte onbehandeld wordt, wordt geschat dat axonen verloren gaan met een snelheid van 7 mijl axonen per minuut ⁵ ....

Protocol

Alle procedures die dieren betreffen, werden goedgekeurd door de Institusionele Diervoeder- en Gebruikscommissies aan de Universiteit van Pennsylvania en het medisch centrum van Michael J. Crescenz Veterans Affairs en voerden zich aan de richtlijnen die zijn uiteengezet in het NIH Public Health Service Beleid inzake Humane Care and Laboratory Dieren (2015).

1. Ontwikkeling van de Agarose Hydrogel (Acellulaire Component van Micro-Tenns)

1. Bereiding van de agaroseoplossing
   1. Maak een reservoir voor de microkolommen in een biosafety-kastje door 20 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) over ....

Results

Micro-TENN's werden gecontroleerd met behulp van fase-contrast microscopie om hun cytoarchitectuur en axonale uitgroei te beoordelen ( Figuur 4 ). Binnen unidirectionele 2 mm lange micro-TENNEN werden neuronale aggregaten beperkt tot het ene uiteinde van de microkolom en geprojecteerd een bundel axonen door de binnenste kern. Axons strekte de volledige lengte van de kolom door 5 dagen in vitro (DIV) ( Figuur 4A ). Er was een grotere aanvanke.......

Discussion

CNS letsel en ziekte resulteert typisch in het verlies of de disfunctie van de long-distance axonale pathways die de hersenverbinding omvatten, met of zonder gelijktijdige neuronale degeneratie. Dit wordt gecompenseerd door de beperkte capaciteit van het CNS om neurogenese en regeneratie te bevorderen. Ondanks het streven naar herstelstrategieën zoals groeifactor-, cel- en biomateriaalafgifte als individuele of combinatorische benaderingen, falen deze technieken tegelijkertijd niet alleen de degeneratie van neuronale ce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter)	Fisher	21170D	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N	Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium	Invitrogen	21103049	Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Printer	Stratasys	--------------	Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent	Fisher	NC9285739	Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel	Fisher	10-348C
1 ml pipette bulb	Sigma	Z509035
Micro-spatula	Fisher	S50821
12-well culture plate	EMESCO	1194-353043
Oven	Fisher	11-475-154
Incubator	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Triton X-100	Sigma	T8787	Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum	Gibco	16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody	Sigma	T8578-200UL	Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody	Synaptic Systems	106-001	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	--------------	Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.