Methodenartikel

Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

12.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55609

⸱

31 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan ​​uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.

Samenvatting

Functioneel herstel komt zelden voor als gevolg van letsel of door de ziekte veroorzaakte degeneratie in het centrale zenuwstelsel (CNS) door de remmende omgeving en de beperkte capaciteit voor neurogenese. We ontwikkelen een strategie om tegelijkertijd neuronale en axonale wegverlies in het beschadigde CNS aan te pakken. Dit manuscript presenteert het fabricageprotocol voor microweefselgemanipuleerde neurale netwerken (micro-TENNs), implanteerbare constructen bestaande uit neuronen en uitgelijnd axonale tracten die het extracellulaire matrix (ECM) lumen van een voorgevormde hydrogelcilinder overspannen, honderden micron in diameter die centimeter kunnen verlengen in lengte. Neuronale aggregaten zijn afgebakend aan de extremen van de driedimensionale omhulling en worden gespannen door axonale projecties. Micro-Tenns zijn uniek gepositioneerd als een strategie voor de reconstructie van het CNS, waarbij aspecten van de hersenbindende cytoarchitectuur worden geïmplementeerd en mogelijk middelen voor netwerkvervanging bieden. De neuRonale aggregaten kunnen samenvallen met gastheerweefsel om nieuwe functionele relais te vormen voor het herstellen en / of moduleren van ontbrekende of beschadigde schakelingen. Deze constructen kunnen ook fungeren als pro-regeneratieve "living scaffolds" die ontwikkelingsmechanismen voor celmigratie en axonale pathfinding kunnen exploiteren, die synergistische structurele en oplosbare signalen op basis van de staat van regeneratie verschaffen. Micro-Tenns worden vervaardigd door vloeibare hydrogel te gieten in een cilindrische vorm die een longitudinale centreerde naald bevat. Zodra de hydrogel gelegerd is, wordt de naald verwijderd, waardoor een holle microkolom wordt gelaten. Een ECM oplossing wordt toegevoegd aan het lumen om een ​​omgeving te verschaffen die geschikt is voor neuronale hechting en axonale uitgroei. Gedissocieerde neuronen worden mechanisch geaggregeerd voor precies zaaien in één of beide uiteinden van de microkolom. Deze methodologie produceert betrouwbaar zelfstandige miniatuurconstructen met langwerpige axonale tracten die de kenmerken van hersenneuranatomie kunnen herkapituleren. Synaptische immNiet-etiketterende en genetisch gecodeerde calciumindicatoren suggereren dat micro-TENN's uitgebreide synaptische verdeling en intrinsieke elektrische activiteit bezitten. Bijgevolg vormen micro-TENNEN een veelbelovende strategie voor gerichte neurochirurgische reconstructie van hersenwegen en kunnen ook worden toegepast als biofidelische modellen om neurobiologische verschijnselen in vitro te bestuderen.

Inleiding

Een algemeen kenmerk van aandoeningen en ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS), zoals traumatisch hersenletsel (TBI), ruggenmergletsel (SCI), beroerte, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson, is de ontkoppeling van axonale wegen en neuronale cellen Verlies 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Bijvoorbeeld, wanneer een ischemische beroerte onbehandeld wordt, wordt geschat dat axonen verloren gaan met een snelheid van 7 mijl axonen per minuut 5 . In het geval van TBI, die ongeveer 1,7 miljoen mensen elk jaar alleen in de VS ervaren, kan axonale degeneratie jaar na trauma blijven optreden, aangezien de aanvankelijke verwonding een langdurige neurodegeneratieve toestand 4 neigt. Versterking van deze schadelijke effecten, het CNS heeft een zeer beperkte capaStad voor regeneratie 1 , 7 , 8 , 9 . Na aanleiding van het letsel ontstaat een remmende omgeving die wordt gekenmerkt door een gebrek aan gerichte begeleiding naar verre doelen, de aanwezigheid van myeline geassocieerde remmers die neuritale uitgroei verhinderen en de vorming van een glialeire door reactieve astrocyten 8 , 10 , 11 , 12 . Het gliaire doet dienst als een biochemische en fysieke barrière voor regeneratie, met moleculen zoals chondroïtinesulfaatproteoglycanen die axongroei 8 , 11 belemmeren. Bovendien, hoewel neurale stamcellen zijn gevonden in het volwassen CNS, is de productie van nieuwe neuronen beperkt, aangezien consistent bewijs van neurogenese alleen is gevonden in de olfactorische bol, de hippocampaleSubgranulaire zone, het periventriculaire gebied en het centrale kanaal van het ruggenmerg 13 , 14 . Deze obstakels verhinderen het functionele herstel van verloren neuronen en witte materie architectuur als gevolg van letsel of ziekte, wat resulteert in de vaak veranderende en langdurige effecten van deze omstandigheden.

Ondanks het gebrek aan regeneratieve capaciteit in het volwassen CNS, is aangetoond dat axonale regeneratie mogelijk is als adequate milieueisen worden voorgesteld aan de gastheer neuronen 15 , 16 , 17 , 18 . Onderzoekers hebben geprobeerd groeifactoren te leveren en te manipuleren ( bijv. De zenuwgroeifactor, de epidermale groeifactor, de glial-afhankelijke groeifactor en de neurotrofische factor-3) en andere begeleidingsmoleculen om de plasticiteit en axonregeneratie te stimuleren 14 , </ Sup> 18 , 19 . Hoewel deze studies hebben bevestigd dat volwassen axonen in staat zijn om op groeifactoren te reageren, worden deze strategieën beperkt door de lage permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière en de specifieke ruimtelijke en temporale gradiënten die nodig zijn om regeneratie 14 , 18 , 19 te bevorderen. Andere benaderingen zijn gebaseerd op de hyperactivatie van regeneratie gerelateerde transcriptiefactoren in CNS neuronen. Bijvoorbeeld stimuleerde overexpressie van de stat3 transcriptiefactor axonale regeneratie in de optische zenuw 20 . Desalniettemin slaan zowel de biomoleculeafgifte als de overexpressie van transcriptiefactoren in de plaats van verloren neuronale populaties. Cell-based strategieën hebben vooral betrekking op transplantatie van neurale stamcellen (NSC's) in het CNS, waarbij zij profiteren van hun capaciteit om CNS neuronen te vervangen, trofische factoren te vrijgeven,En ondersteun de pogingen op neurogenese die zich voordoen na verwonding 17 . Ondanks dit zijn er nog steeds uitdagende uitdagingen die deze aanpak verhinderen, inclusief het belemmerde vermogen van getransplanteerde neurale cellen om te overleven, integreren met de gastheer en blijven ruimtelijk beperkt tot het gewond gebied 6 , 14 , 17 , 21 . Daarnaast is de levering van cellen alleen niet in staat om de cytoarchitectuur van beschadigde of verloren axonale wegen te herstellen. Een alternatieve benadering die betrekking heeft op de problemen die cel- en drug / chemische afleverstrategieën voordoen, combineert deze benaderingen met het gebruik van biomaterialen 14 , 22 , 23 . Biomaterialen zoals hydrogelen kunnen de biochemische en fysische eigenschappen van de extracellulaire matrix (ECM) emulerenD retentie binnen het gewond gebied, en het leveren van groeifactoren en andere bioactieve moleculen met gereguleerde afgifte 22 . De aantrekkelijke kenmerken van deze biomaterialen gebaseerde strategieën hebben geleid tot bewijs van in vivo axonale regeneratie na de transplantatie van steigers naar het lesion gebied 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Echter, acellulaire biomaterialestrategieën vervangen geen verloren neuronale populaties; Bij gebruik als leveringsvoertuigen voor neuronale, gliale of neuronale precursorcellen, zijn biomaterialen niet in staat om axonale netwerken op lange afstand te reconstrueren. De uitdaging om een ​​aanpak te ontwikkelen die zowel de axonale wegdegeneratie als neuronale verlies in verband met CNS-letsel en ziekte bestrijkt, blijft 31.

Onze onderzoeksgroep heeft eerder de ontwikkeling van implanteerbare microweefselgemanipuleerde neurale netwerken (micro-TENN's) gemeld, die een type "levende steiger" zijn die bestaat uit neuronale cellichamen die beperkt zijn tot één of beide uiteinden van een agarose hydrogel-ECM microkolom , Met uitgelijnd axonale tracten die zich uitstrekken over het binnenste van deze driedimensionale (3D) omhulling 1 , 10 , 31 , 32 . Een van de belangrijkste verschillen tussen deze techniek en eerdere benaderingen is dat de cytoarchitectuur van micro-TENNEN volledig in vitro wordt gecreëerd en daarna 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 wordt getransplanteerd 39 , 40 , 41 . In vitro fabricage biedt uitgebreide ruimtelijke en temporale controle van cellulaire fenotype en oriëntatie, mechanische / fysische eigenschappen, biochemische signalen en exogene factoren, die de integratie van deze steigers bij de gastheer na de implantatie 41 , 42 ten goede komen . Micro-Tenns zijn anatomisch geïnspireerd omdat ze neuroanatomie van de hersenen emuleren, waarbij axonale tracten worden weergegeven die vergelijkbaar zijn met die welke verschillende functionele gebieden van de hersenen gebruiken ( Figuur 1A ) 1 . Daarom kan deze strategie fysieke vervanging van verloren witte materiaalkanalen en neuronen na implantatie in een gewaarschelde regio vervangen. Deze techniek wordt ook geïnspireerd door ontwikkelingsmechanismen waarin "natuurlijke levende stellingen" gevormd door radiale gliale cellen en pioniers axonen fungeren als pathfinding gidsen voor celMigratie uit de subventriculaire zone en axonale uitgroei, respectievelijk 43 . Deze mechanismen worden teruggevonden in de uitgelijste axonale tracten van micro-TENNs, die leefwegen voor neurale celmigratie en axonale regeneratie kunnen voorstellen door axon-gemedieerde axonale uitgroei ( Figuur 1C ) 43 . Bovendien maakt deze strategie gebruik van synaptische integratie tussen de micro-TENN-neuronen en de inheemse schakelingen, waarbij nieuwe relais worden gevormd die kunnen bijdragen tot functioneel herstel ( Figuur 1B ) 43 . De capaciteit voor synapsvorming kan deze aanpak ook de mogelijkheid bieden om het CNS te moduleren en te reageren op gastheerweefsel volgens netwerk feedback. Optogenetisch actieve neuronen in de levende stellingen kunnen bijvoorbeeld gestimuleerd worden om gastheerneuronen te moduleren door middel van synaptische interacties ( Figuur 1D ).

Daarnaast heeft de biomaterial-gebaseerde buisvormige constrUitvoering van micro-TENNs biedt een adequate omgeving voor celadhesie, groei, neurietuitbreiding en signalering, terwijl de miniatuurafmetingen van de constructen mogelijk minimaal invasieve implantatie toestaan ​​en een gedeeltelijk gesekwestreerde microomgeving voor geleidelijke integratie in de hersenen mogelijk maken. Inderdaad hebben recente publicaties het potentieel van micro-TENNEN aangetoond om neurale trajecten na implantatie in de ratbrein te nabootsen. Na stereotaxische microinjectie hebben we eerder bewijs van micro-TENN neuronale overleving, onderhoud van axonale tractarchitectuur en neurietuitbreiding in de gastheercortex tot tenminste 1 maand in vivo 10 , 31 gemeld. Bovendien gaf etikettering met synapsine histologisch bewijs van synaptische integratie met natief weefsel 10 , 31 . In het algemeen kunnen micro-TENNES uniek geschikt zijn om beschadigd te reconstrueren en te modulerenCNS door verloren neuronen te vervangen, synaptisch te integreren met gastheercircuits, herstel van verloren axonale cytoarchitectuur en, in bepaalde gevallen, het regenereren van axonen met de juiste pathfinding cues.

figure-introduction-1
Figuur 1: Principes en inspiratie achter de ontwikkeling van micro-tissue engineered neurale netwerken (micro-TENNs). ( A ) Micro-Tenns nabootsen de cytoarchitectuur van de hersenverbindingen (paars), waarbij functionele afzonderlijke gebieden door middel van lange, uitgelijste axonale tracten in eenrichtingsbewerking (rood, groen) of tweerichtings (blauw) verbonden zijn. Bijvoorbeeld, micro-TENN's kunnen verloren verbindingen in corticothalamus- en nigrostriatale trajecten of in de perforante weg van de entorhinaire cortex tot de hippocampus reconstrueren (aangepast uit Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagram van een unidirectionaL en bidirectionele micro-TENN (respectievelijk rood en blauw) synaptisch integreren met de gastheercircuit (paars) om als een functioneel relais tussen beide uiteinden van een letsel te dienen. ( C ) Schematisch van de axonale tracten van een unidirectionele micro-TENN (groen), die dienen als een geleiding voor axon-gefaciliteerde regeneratie van host axons (paars) naar een doel waarmee de micro-TENN in wisselwerking is. ( D ) Conceptueel diagram van het gebruik van optogenetisch actieve micro-TENNS als neuromodulators, die profiteren van synaptische integratie met excitatoire of remmende neuronen (bodem). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het huidige manuscript detaileert de methodologie die wordt gebruikt om micro-TENNEN te vervaardigen met behulp van embryonaal afgeleide cerebrale corticale neuronen. Met name kunnen micro-TENNEN worden vervaardigd met andere soorten neurale cellen. Voor exRuim, de initiële rapporten van succesvolle micro-TENN ontwikkeling gekenmerkt door dorsale root ganglion (DRG) neuronen 32 . De hydrogelmicrokolommen kunnen gegenereerd worden ( Figuur 2A ) door vloeibare agarose aan te voegen aan een op maat gemaakte, lasersnijdende cilindrische kanaalschikking of naar capillaire buizen, die beide uitgelijnd acupunctuurnaalden bevatten. De naald vormt het lumen en bepaalt de binnendiameter (ID) van de microkolom, terwijl de capillaire buis ID en de diameter van de cilinders in het lasergesneden apparaat de buitendiameter (OD) van de constructies dicteren. De OD en ID kunnen volgens de gewenste toepassing worden gekozen door respectievelijk verschillende diameters voor de inrichting / capillaire buizen en de acupunctuurnaalden te selecteren. De lengte van de microkolommen kan ook worden gevarieerd; Tot op heden hebben we de constructie van micro-TENNEN tot 20 mm lang 10 gerapporteerd en actief nog langere lengtes volgen. Na de agarose gels en de acupunctuur nEedles worden verwijderd, een ECM oplossing die in het algemeen bestaat uit type I collageen en laminine wordt toegevoegd aan het lumen van de constructen ( Figuur 2C ). De ECM-kern biedt een steiger ter ondersteuning van neuronale celadhesie en axonale uitgroei. Aanvankelijk werden primaire ratcorticale neuronen geplateerd in de microkolommen met behulp van gedissocieerde cel suspensies 10 , 31 , 32 . Deze aanpak produceerde echter niet in alle gevallen de target cytoarchitectuur, die werd gedefinieerd als de neuronale cellichamen die beperkt waren tot de uiteinden van de microkolommen, waarbij het centrale lumen bestaat uit zuivere uitgelijnd axonale tracten. Sindsdien is het gebruik van een gedwongen neuronale aggregatie methode (gebaseerd op protocols aangepast aan Ungrin et al .) Een betrouwbare en consistente fabricage van micro-TENNEN mogelijk gemaakt met de ideale structuur ( Figuur 2B ) 44 . Naast het beschrijven van de huidigeMethodologie, zal dit artikel representatieve fasecontrast- en confocale beelden van micro-TENNs tonen die de vorming van axonale tracten over de tijd tonen, evenals de gefinaliseerde doelcytoorarchitectuur. Dit manuscript zal ook uitbreiden op opmerkelijke aspecten van het protocol en de resterende uitdagingen en toekomstige aanwijzingen van de micro-TENN-technologie.

figure-introduction-2
Figuur 2: Schematisch diagram van het driedimensionale micro-TENN fabricageproces. ( A ) Ontwikkeling van de agarosehydrogel: (i) Aanvankelijk wordt een kleine acupunctuurnaald ( bijv . 180-350 μm in diameter) in de cilindrische kanalen van een op maat gemaakte, lasergesneden vorm of een kapillair buis geplaatst ( bijv. , Diameter 380-700 μm). In de volgende stap wordt vloeibare agarose in DPBS geïntroduceerd in de cilindrische kanalen of capillaire buizen. (Ii) Na de agarosegels wordt de naald verwijderd enDe vorm wordt gedemonteerd om de holle agarose microkolommen te geven. (Iii) Deze constructies worden dan gesteriliseerd en opgeslagen in DPBS. ( B ) Primaire neuroncultuur en de aggregaatmethode: (i) Neuronale aggregatie wordt uitgevoerd in pyramidale micro-well arrays, gegoten uit 3D-gedrukte schimmels, die passen in de putjes van een 12-wells kweekplaat. (Ii) Micro-TENNs omvatten primaire ratneuronen die zijn losgelaten van foetale hersenen van embryonale-dag-18 ratten. Na afloop van weefseldissociatie met trypsine-EDTA en DNase I wordt een celoplossing met een dichtheid van 1,0-2,0 x 106 cellen / ml bereid. (Iii) 12 μl van deze oplossing worden overgebracht naar elke put in de pyramidale micro-put-array. De plaat die deze microputjes bevat, wordt gecentrifugeerd om celaggregaten te produceren. (Iv) Deze worden vervolgens overnacht geïncubeerd voorafgaand aan plating in de microkolommen. ( C ) ECM-kernfabrikatie en celzaden: (i) Vóór het zaaien van een cel, een ECM-oplossing die 1 mg / ml type I collageen en 1 mg / ml bevatLaminine wordt overgebracht naar het interieur van de micro-TENNEN en mag polymeriseren. (Ii) Afhankelijk van de vraag of unidirectionele of bidirectionele micro-TENNEN worden vervaardigd, wordt een aggregaat geplaatst op respectievelijk één of beide uitersten van de microkolom. Iii) Na een periode van incubatie om adhesie te bevorderen, worden micro-TENNEN gekweekt in Petri-schalen die zijn overspoeld met aangevulde embryonale neuronale basale media. Iv) Na 3-5 dagen in de cultuur, moet de uiteindelijke micro-TENN-structuur celaggregaten aantonen bij de uitersten van de microkolom, met axonale tracten die zijn lengte overspannen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures die dieren betreffen, werden goedgekeurd door de Institusionele Diervoeder- en Gebruikscommissies aan de Universiteit van Pennsylvania en het medisch centrum van Michael J. Crescenz Veterans Affairs en voerden zich aan de richtlijnen die zijn uiteengezet in het NIH Public Health Service Beleid inzake Humane Care and Laboratory Dieren (2015).

1. Ontwikkeling van de Agarose Hydrogel (Acellulaire Component van Micro-Tenns)

  1. Bereiding van de agaroseoplossing
    1. Maak een reservoir voor de microkolommen in een biosafety-kastje door 20 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) over te brengen op elk van de 10 cm Petri-schotels. Steriliseer fijne tang en microscalpels met een hot bead sterilisator.
    2. Weeg 3 g agarose en draag het over naar een steriele beker in de biosafety-kast. Voeg 100 ml DPBS toe voor een uiteindelijke concentratie van 3% gewicht / volume (w / v). Inclusief een schone magnetische staaf en bedek de beker met aluminiumNum folie.
    3. Met een kookplaat / roerder verwarm de beker bij 100 ° C en roer bij 120-200 rpm om de agarose volledig op te lossen (de oplossing wordt van bewolkt om te wissen). Bewaar de verwarming en roer daarna om gelering te voorkomen en verander de verwarmingstemperatuur als nodig om de agarose te verbranden.
      OPMERKING: De fabricage met zowel het lasergesneden apparaat als de capillaire buizen wordt hieronder weergegeven in respectievelijk de rubrieken 1.2 en 1.3. Ga verder naar paragraaf 1.4 na afronding van de stappen die in een van beide onderdelen worden beschreven. Voor beide micro-kolom fabricagemethoden, voeg de vloeibare agarose snel toe, aangezien agarose snel verdampt als het afkoelt. Bij het steriliseren met een autoclaaf in een van de volgende stappen, gebruik de standaardtoestanden die op glaswerk worden toegepast.
  2. Voorbereiding van microkolommen met behulp van een lasergesneden apparaat
    OPMERKING: Het lasergesneden apparaat is gesneden van transparant acryl met een commerciële CO 2 lasersnijder. De fabriKation van structuren en apparaten via lasersnijden is goed gedocumenteerd voor een scala aan techniek- en onderzoeksaanvragen 45 , 46 , 47 . Deze vorm ( Figuur 3 ) bestaat uit een reeks van vijf cilindrische kanalen, elk met een diameter van 398 μm en een lengte van 6,35 mm. Deze cilindrische arrays worden langs twee lengtes gevormd: een onderste helft (lengte: 25,4 mm, breedte: 6,35 mm, hoogte: 6,0 mm) en een bovenste helft (lengte: 31,5 mm, breedte: 6,35 mm, hoogte: 12,7 mm ), Zoals getoond in respectievelijk figuren 3A en 3B . De twee helften kunnen vastgeklemd worden door de voorste en achterste kapjes waargenomen in figuur 3C (lengte: 31,5 mm, breedte: 6,35 mm, hoogte: 12,7 mm), die vier uitlijngaten bevatten die samenvallen met twee gaten, elk boven en onder Stukken en die helpen bij het vastzetten van alle onderdelen bij elkaar. Deze caps ook inclZet vijf gaten, concentrisch op de cilindrische kanalen, waarin de acupunctuurnaalden kunnen worden ingevoegd om het lumen van de microkolommen te vormen.
    1. Steriliseer het in figuur 3 getoonde apparaat door het te bedekken met aluminiumfolie en autoclaving. Monteer het apparaat zoals getoond in Figuur 3D door de voorste en achterste kapjes met slechts het onderste halve stuk te aanpassen en de drie delen met twee # 4-40 schroeven en moeren (draaddiameter: 3,05 mm) in de onderste uitlijning gaten te bevestigen.
    2. Stel een acupunctuurnaald (diameter: 180 μm, lengte: 30 mm) volledig in de naaldgaten aan op de voorste of achterste kap van het apparaat ( Figuur 3D ). Giet met een micropipette voldoende vloeibare agarose (~ 1 ml voor de vijf kanalen) op het onderste halfdeel om elk van de cilindrische kanaalhelften te vullen.
    3. Plaats het bovenste halve stuk van het apparaat onmiddellijk over de onderste helft en druk de druk in tot het stevig in zitPlaats om de cilindrische kanalen te voltooien (wrijving tussen de kappen en het bovenstuk zal de laatste op zijn plaats houden). Wacht ~ 5 min bij kamertemperatuur na agarose-toevoeging om de gelering ervan in de kanalen van het apparaat toe te staan.
    4. Pak de naald handmatig uit elk van de gaten op de kapjes van het apparaat. Verwijder de schroeven en manueel scheid de twee caps en de bovenste helft van het onderste halve stuk, waar de laatste de hydrogelmicrokolommen zal houden.
    5. Gebruik fijne pincet om de microkolommen zachtjes van de kanalen op het onderste halve stuk te verwijderen en plaats ze in de eerder bereide Petri schotel die DPBS bevat (stap 1.1.1). Hergebruik het apparaat voor een andere ronde van microkolomfabrikatie. Ga verder naar deel 1.4.
  3. Micro-kolom fabricage met behulp van capillaire buizen
    1. Breng glazen capillaire buizen over (diameter: 398,78 μm, lengte: 32 mm) aan de binnenzijde van de biosafety-kast. Manueel breken deLange buizen in fragmenten van 2,0-2,5 cm en voeg één acupunctuurnaald (diameter: 180 μm, lengte: 30 mm) in elk fragment in ( zie figuur 2A ).
    2. Breng 1 ml vloeibare agarose over van de beker naar het oppervlak van een lege Petri-schotel. Houd de capillaire buis en de geïntroduceerde naald, plaats het ene uiteinde van de buis in contact met het vloeibare agarosepoel om het door capillaire werking te vullen. Roer de buis om de capillaire stijging te bevorderen.
      OPMERKING: Vul de capillaire buizen met vloeibare agarose zo hoog als de capillaire werking toestaat; Daarna kunnen deze microkolommen in kleinere constructies worden gesneden afhankelijk van de gewenste lengte. Het 1 ml agarosepoel wordt typisch gebruikt voor slechts één buis, aangezien de agarose snel koelt en gelegelt, waardoor verdere capillaire werking voorkomt.
    3. Wanneer de vloeistof ophoudt, verwijder de capillaire buis uit het zwembad en plaats hem horizontaal op het oppervlak van een Petri-schotel. Wacht 5 minuten om de agarosegel in de buizen te laten liggen.
    4. Plaats de duim en wijsvinger aan weerszijden van de buis en druk er tegen. Gebruik de andere hand om de naald snel uit te trekken terwijl u de duim en wijsvinger gebruikt om te voorkomen dat de microkolom uit de buis glijdt. Steek een 30-gauge naald in de capillaire buis om de microkolom langzaam te duwen in een schotel met DPBS (stap 1.1.1).
  4. Micro-kolom trimmen en sterilisatie
    1. Verplaats één micro-kolom van DPBS delicaat naar een lege schotel met fijne tang. Voeg 10 μL DBPS aan de bovenkant van de microkolom toe met een micropipet om drogen te voorkomen. Plaats de laatste schotel onder een stereoscoop voor visuele begeleiding.
      OPMERKING: In het protocol verwijst micro-kolom drogen of uitdroging naar de verwerving van een verfrommelde structuur die visueel onderscheidbaar is met de typische gehydrateerde uitstraling van deze constructen. Uitgedroogde microkolommen stevig vastmaken aan het oppervlak van Petri-schotels en cAnnot kan gemakkelijk verplaatst worden, terwijl gehydrateerde constructen over het oppervlak glijden, na het manipuleren met tang. Een fase-contrastbeeld van een volledig gedroogde microkolom wordt getoond in Figuur 8A .
    2. Trim de microkolom met een microscalpel om het te verkorten tot de gewenste lengte (hier 2-5 mm). Vervoer de getrimde microkolom met fijne tang naar de andere DPBS Petri-schotel, bereid in stap 1.1.1.
    3. Herhaal stappen 1.4.1 en 1.4.2 voor elke vervaardigde microkolom.
    4. Steriliseer de microkolommen in de DPBS-bevattende Petri-schotels onder ultraviolet (UV) licht gedurende 1 uur. Bewaar de Petri-schotels bij 4 ° C voor ECM-toevoeging en celplating.

2. Primêre Neuronkultuur en Gedwongen Cell Aggregatie Methode

  1. Voorbereiding van de piramidale micro-well-array
    OPMERKING: In deze sectie wordt een 3D-gedrukte vorm gebruikt die bestaat uit een cilindrische basis (diameter: 2,2 cm, hoogte: 7,0 mm) aNegen vierkante piramides bovenaan (zijlengte: 4,0 mm, schuine hoek: 60 °), georganiseerd in een 3 x 3 array, zoals getoond in figuur 3E . Het additieven productieproces met behulp van commercieel verkrijgbare 3D printers is goed gedocumenteerd. Computer-aided design software kan gebruikt worden om de vorm te ontwerpen. Het resulterende ontwerpbestand kan dan digitaal worden omgezet in een gereedschapspad voor een 3D-printer. Elke printer heeft verschillende specificaties, en de instructies voor het opzetten en bedienen van een 3D-printer variëren dienovereenkomstig.
    1. Gebruik een 3/32 "boorstuk om 16 gaten in een 4 x 4 array te plaatsen (zijlengte: 4 cm, gatafscheiding: 1 cm), centraal in de deksel van een 10 cm Petri-schotel. In een chemische dampkap gebruiken Het onderste stuk van de Petri-schaal om 27 g polydimethylsiloxaan (PDMS) en 3 g hardingsmiddel af te wegen (voor een verhouding 1:10). Roer met een microspatel om het middel gelijkmatig te verdelen.
    2. Bedek het PDMS / uithardingsmiddel met het doorlopen deksel. Sluit het ene uiteinde van een slang aan op de vacuuM poort van de dampkap en steek het andere uiteinde in de steel van een trechter (monddiameter: 10 cm, stamlengte: 3 cm, stengeldiameter: 1,5 cm).
    3. Maak een opening met een 3/32 "boorstuk bovenaan een 1 ml pipetbol en plaats een 1000 μL micropipetpunt in de opening (met het puntige uiteinde naar boven). Plaats de lamp en de tip in de slang en trek De slang naar boven totdat de lamp de slang in de steel van de trechter afdicht.
    4. Zet de trechter op de doorspoelde schaaldeksel en bevestig de slang met een beschikbare stabiele steun. Open de vacuümklep gedurende 5 minuten naar zuigkracht en breng de luchtbellen naar het oppervlak.
    5. Sluit de klep, verwijder de trechter en raak de Petri-schaal tegen het oppervlak van de dampkoker ~ 3 keer om eventuele overblijvende luchtbellen te barsten.
    6. Plaats een pyramidaal-goed-bedrukte schimmel in elk van de putjes in een kweekplaat met 12 putjes, met de piramiden naar boven gericht. Giet het PDMS / verhardingsmiddel bovenop de matrijzen tot elke putje tHij bord is gevuld. Bedek de 12-putjesplaat met deksel en laat het 1 uur bij 60 ° C drogen.
    7. Verwijder voorzichtig alle PDMS micro-bronnen ( Figuur 3F ) van de plaat met een microspatel. Bedek de PDMS-arrays met aluminiumfolie en steriliseer door autoclaving. Plaats in een biosafety-kast een micro-well-array in elke putje van een 12-putjesplaat ( figuur 2B ).
  2. Cortische neuron isolatie van ratfetussen
    1. Voeg ~ 20 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) toe aan elk van vier tot zes 10 cm Petri-schotels (een voor elk dissected tissue) in een biosafety-kast. Breng deze gerechten over op een dissectiekap en plaats ze op ijs. Steriliseer dissectie-instrumenten, zoals microscalpels, scharen en tangen, met een hot bead sterilisator.
    2. Pre-warm embryonale neuron basaal medium + 2% serumvrij supplement + 0,4 mM L-glutamine (aangeduid als "cultureel medium" hierafteR) en 0,25% trypsine + 1 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bij 37 ° C. Ontdooi deoxyribonuclease (DNase) I door het op kamertemperatuur te plaatsen. Berei 1,5 ml van een 0.15 mg / ml DNAse I oplossing in HBSS op en houd de oplossing op ijs.
    3. Euthanize een tijd-zwangere embryonale-dag-18-rat door inhalatie van kooldioxide en bevestig de dood door decapitatie. Breng het karkas over naar een steriele dissectiekap en leg het ventraal omhoog. Spoel de buik grondig af met 70% ethanol.
    4. Open de baarmoeder en verwijder de foetussen (gewoonlijk ~ 11) uit de amniotische zakken met een schaar en overzetten met een pincet naar een Petri-schotel met koude HBSS zoals beschreven 48 . Plaats een gekoeld granietblok (-20 ° C) onder de stereoscoop. Plaats de Petri schotel op het oppervlak van dit koude blok om de lage temperatuur van de HBSS te behouden tijdens de gehele dissectie procedure.
    5. Spoel de pups door de HBSS rond te zwaaien en over te brengen naar de volgende schone schotelBevattende HBSS. Verwijder met behulp van de stereoscoop en de dissectie-instrumenten de koppen, de hersenhelften en de cortices van de foetussen opeenvolgend en overdragen elk weefsel met tang naar een nieuwe HBSS-gevulde schotel na elke dissectie 48 .
    6. Aspiratie alleen de cortices met een Pasteur pipette en plaats het weefsel in een steriele 15 ml centrifugebuis. Gooi de andere gedissendeerde weefsels weg. Spoel de cortices driemaal door opeenvolgend ~ 5 ml HBSS te toevoegen en te verwijderen met een serologische pipet. Plaats de buis op ijs wanneer het niet in gebruik is.
    7. Breng de cortices over met een Pasteur pipette naar een 15 ml buis met vooraf verwarmde trypsine-EDTA (4-6 cortices per 5 ml trypsine-EDTA). Roer de buis manueel handmatig en plaats deze bij 37 ° C. Omkeer de buis om de 3 minuten om te voorkomen dat het weefsel klont.
    8. Stop de blootstelling aan trypsine na ~ 10 minuten door het weefsel te verwijderen met een Pasteur pipette en over te brengen naar een schone 15 ml centrifugebuis. Voeg de 0.15 mg / ml DNase I oplossing (1,5 ml) toe aan de buis met een pipet.
    9. Gebruik een Pasteurpipet om de weefselklompjes handmatig te breken en dan vortex (~ 30 s) tot de oplossing homogeen is en er geen resterende weefselfragmenten in de vloeistof zijn. Als het niet mogelijk is de oplossing volledig te homogeniseren, verwijder u de onoplosbare fragmenten door ze in de punt van een Pasteur pipet te trekken.
    10. Centrifugeer de homogene celoplossing verkregen in stap 2.2.9 bij 200 xg gedurende 3 minuten. Verwijder de supernatant met een Pasteur pipette, let erop dat de gepelleteerde cellen niet worden verstoord. Voeg 2 ml kweekmedium toe met een serologische pipet en vortex om de cellen te resuspenderen.
    11. Tel het aantal cellen in de oplossing bereid in stap 2.2.10 met behulp van een hemocytometer; De verwachte opbrengst is 3,0-5,0 x 106 cellen / corticale hemisfeer. Bereid 1 ml of meer cel suspensie in kweekmedium, met een dichtheid van 1,0-2,0 x 106 cellen / ml.
  3. Vorming van neuronale celaggregaten
    1. Voeg bij een micropipet 12 μl van de 1,0-2,0 x 10 6 / ml cel suspensie in elke microput van de PDMS array (die in stap 2.1.7 in de plaat werd geplaatst).
      OPMERKING: De celconcentratie kan worden aangepast afhankelijk van de microkolom ID en de gewenste celaggregaatgrootte, aangezien hogere concentraties grotere aggregaten opleveren.
    2. Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 5 minuten om de aggregatie van cellen aan de onderkant van de microputjes te dwingen ( Figuur 2B ). Voeg voorzichtig ~ 2 ml kweekmedium toe aan de bovenkant van elke PDMS-array om alle gepolijste microbronnen te bedekken, let erop dat de gecombineerde cellen niet worden verstoord.
    3. Als cellen niet met een virale vector worden getransduceerd, incubeer de plaat gedurende 12-24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 en ga verder naar sectie 3. Als de aggregaten worden getransduceerd, sla de incubatie over en ga verder naar sectie 2.4 .
  4. TranSductie met een virale vector om calciumsignalen te waarnemen
    Opmerking: Deze stappen worden uitgevoerd om neuronen te transduceren met een virale vector die een genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) bevat. De resultaten in dit artikel werden verkregen met behulp van een commercieel verkrijgbaar adeno-geassocieerd virus (AAV) (serotype 1) met GCaMP6f, een GECI met snelle kinetiek bestaande uit groen fluorescerend eiwit (GFP), calmoduline (CaM) en het M13 peptide, Aangedreven door de menselijke Synapsin I promotor. De virale vectoroplossing kan verdunning nodig hebben in steriele DPBS vóór transductie, afhankelijk van de concentratie van de voorraadoplossing. De celgezondheid / morfologie en GCaMP6f signaalsterkte moeten in de loop van de tijd worden waargenomen voor een reeks vectorconcentraties. Deze optimalisatieprocedure moet door elke onderzoeker worden uitgevoerd om de juiste titer voor hun eigen celculturen te bepalen. De typische GCaMP6f expressietijd is 7-8 dagen na de transductie die plaatsvindt tijdens de incubatie die in stEp 2.4.2.
    1. Voeg bij een micropipette het vereiste volume van de virale vectoroplossing toe (voor een uiteindelijke concentratie van ~ 3,0 x 10 9 genomische kopieën per aggregaat) naar het kweekmedium dat de aggregaten bedekt. Langzaam pipetten omhoog en omlaag om ervoor te zorgen dat de vectoroplossing homogeen verdeeld is door het kweekmedium.
    2. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 om de virale transductie van GCaMP6f toe te laten met de gepoederde pyramidale microbronnen.

3. Ontwikkeling van de cellulaire component van micro-TENNs

  1. ECM kernfabriek
    1. Na gecombineerde incubatie, voeg type I collageen en laminine toe aan het kweekmedium (voor een concentratie van 1 mg / ml elk) in een microcentrifugebuis om de ECM-oplossing te bereiden. Voer stap 3.1.2-3.1.4 bij kamertemperatuur uit, maar houd de buis met ECM op ijs wanneer het niet gebruikt wordt om te vroegtijdige gelering te voorkomen.
      OPMERKING: De typische uitgaven zijn 4 μL ECM oplossing voor elke microkolom (lengte: 5 mm, ID: 180 μm).
    2. Pas de pH van de ECM-oplossing aan door 1-2 μL op litmuspapier over te brengen om de initiële pH te verifiëren, waar nodig 1 μL 1 N natriumhydroxide (NaOH) en / of 1 N zoutzuur (HCl) aan de ECM toevoegen, En herhalen tot de pH 7,2-7,4 is. Zorg voor homogenisatie van de ECM-oplossing door pipettering omhoog en omlaag, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
    3. Breng de microkolommen met gesteriliseerde tang uit de afwas in stap 1.4.3 om lege 35- of 60-mm Petri-schotels leeg te maken. Werk op 4-5 microkolommen tegelijkertijd om uitdroging te voorkomen. Bevestig een 10-uL-tip die is bevestigd aan een 1000-uL-tip aan een micropipette. Met behulp van de stereoscoop voor visuele begeleiding, plaats de tip aan het ene uiteinde van de microkolommen en zuig om resterende DPBS en luchtbellen uit het lumen te verwijderen.
    4. Maak snel 4-5 μL ECM in een micropipette. Observeren onder een steReoscoop, plaats de punt van de micropipet aan één van de uiteinden van de microkolommen en ontlont voldoende ECM om het lumen te vullen. Bevestig de afwezigheid van luchtbellen in het lumen, omdat deze de axonale uitgroei door de ECM kunnen remmen. Als er luchtbellen bestaan, verwijder de ECM, zoals beschreven in stap 3.1.3, en voeg de ECM opnieuw toe.
    5. Om uitdroging te voorkomen, voeg ~ 2 μL ECM om elke microkolom toe. Incubeer de hydrogel / ECM microkolommen in de Petri schalen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 25 minuten. Ga onmiddellijk na het zaaien van de cel na directe incubatie.
      OPMERKING: De incubatieperiode in stap 3.1.5 is bedoeld om tijd te geven voor de polymerisatie van collageen en laminine in de microkolommen.
  2. Neuronale cel zaaien in de microkolommen
    OPMERKING: Om het kweekmedium van de getransduceerde aggregaten te veranderen, kantelt u de plaat aan, gebruik een micropipette om het medium dat op de muur van de put zwemt te verwijderen en voeg vervolgens langzaam ~ 1 ml toe tegen deMuur (om de aggregaten in de pyramidale microbronnen te voorkomen). Herhaal deze gemiddelde verandering een tweede keer.
    1. Na de incubatieperiode in stap 3.1.5, overbrengen ongeveer 10-20 μL kweekmedium naar twee vrije gebieden in de Petri-schotels die de microkolommen houden. Gebruik een micropipette om de aggregaten individueel over te brengen naar de Petri-schotel die de constructen bevat en hen te verplaatsen naar een van de kleine pools van cultuurmedium om de gezondheid van de cellen te behouden.
    2. Terwijl u onder een stereoscoop observeert, voegt u een aggregaat in elk uiteinde van de microkolommen voor bidirectionele micro-TENN's of in één uiteinde voor een unidirectionele architectuur (zoals gewenst) met behulp van tang. Bevestig de plaatsing van de aggregaten in de microkolommen met behulp van de stereoscoop. Gebruik pincet om de zaaide microkolommen naar het andere kleine zwembad van cultuurmedium te verplaatsen om uitdroging te voorkomen en om de totale gezondheid te behouden.
    3. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 45 minuten tot aLaat de aggregaten letten op de ECM. Controleer of de aggregaten aan de uiteinden van de microkolommen blijven, met behulp van de stereoscoop; Herplaats de celaggregaten opnieuw en herhaal de incubatietrap als nodig.
    4. Overstrom de Petri-schotels met de micro-TENNEN voorzichtig met kweekmedium (3 of 6 ml voor respectievelijk een 35 of 60 mm petrischaal) met behulp van een serologische pipet. Zet de afwas in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor de lange termijncultuur.
    5. Doe de halfmediawijzigingen elke 2 dagen met kweekmedium. Verwijder de helft van het oude medium met een pipet voorzichtig en gebruik de stereoscoop voor visuele begeleiding om de micro-tennens niet te zuigen. Vervang door langzaam toevoegen van vers, voorverwarmd medium met een pipet.
    6. Om de PDMS micro-well-arrays opnieuw te gebruiken, verwijder het kweekmedium, kook de arrays in gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten en steriliseer in een autoclaaf voor een andere ronde van de aggregatievorming en -cultuur.
      OPMERKING: Bij gewenste tijdstippen, deCytoarchitecture van micro-TENNs kan worden geverifieerd met behulp van fase-contrast microscopie. Hier werd gebruik gemaakt van een belichtingstijd van 5-8 ms en 10X (0,64 μm / pixel) en 20x (0,32 μm / pixel) doelstellingen om de fase-contrastbeelden vast te leggen. De fluorescentie geassocieerd met calciumconcentratieveranderingen in virale transduced micro-TENNEN werd gevangen met een fluorescentiemicroscoop met een hoge snelheid met een blootstellingsduur van 50 ms, een 10x objectief (0,64 μm / pixel) en solid state licht met bandpasfilters van ~ 480 Nm en ~ 510 nm voor excitatie en emissie, om het GCaMP6f fluorescentiesignaal te visualiseren.

4. Immunocytochemie voor In Vitro Studies

Opmerking: Voor de hier weergegeven beelden werden de volgende primaire antilichamen gebruikt: muis anti-Tuj-1 / beta-III tubuline (1: 500) en konijn-anti-synapsine-1 (1: 500) voor de etikettering van axonen en pre -synaptische boutons, respectievelijk. De secundaire antilichamen waren donkey anti-mouse 568 (1: 500) en ezel anti-konijn 488 (1: 500). De vereiste volumes van de bereide primaire en secundaire antilichaamoplossingen, evenals de volumes van de formaldehyde-, paardserum- en detergentoplossingen, zijn afhankelijk van het volume dat nodig is om de constructies volledig te bedekken. Deze volumes kunnen worden geminimaliseerd met behulp van een hydrofobe barrière pen om het gebied rond elke microkolom te beperken.

VOORZICHTIG: In deze sectie worden formaldehyde en Hoechst gebruikt. Formaldehyde is een giftige verbinding die kankerverwekkend is en Hoechst is een bekende mutage. Daarom moeten deze verbindingen in een geschikte afvalcontainer worden verwijderd. Hanteer ze altijd in een chemische afzuigkap terwijl u passende persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt, zoals een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen.

  1. Bereid een formaldehydeoplossing van 4,0% volume / volume (v / v) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een chemische dampkap.
  2. Verwijder het kweekmedium uit de Petri dishesNg de micro-TENNEN met een micropipette. Voeg voldoende volume van de formaldehydeoplossing toe aan de afwas om de micro-TENNELS volledig te bedekken. Week de micro-TENNEN in de formaldehydeoplossing gedurende 35 minuten bij 18-24 ° C om de cellen in de microkolommen vast te zetten.
  3. Verwijder de 4,0% formaldehydeoplossing uit de Petri-schotels met een pipet en gooi ze weg volgens passende richtlijnen voor verwijdering van gevaarlijke stoffen.
  4. Voer twee snelle spoelen uit door voldoende PBS toe te voegen om de vaste micro-TENNELS volledig te bedekken en vervolgens de PBS te verwijderen met een pipet. Voer een derde lange spoel uit door de constructies gedurende 10 minuten in de PBS te laten ontdoen.
    VOORZICHTIG: Verwijder de PBS die wordt gebruikt voor het spoelen, eventueel met sporen formaldehyde.
  5. Bereid een 0,3% v / v oplossing van niet-ionisch detergens in 4% v / v paardserum in PBS. Verwijder de PBS uit de petrischalen die de vaste micro-TENNEN bevatten en voeg een voldoende volume van de 0,3% wasmiddeloplossing toe om de constructies te bedekken. Week 60 minuten om 18-24 & #176; C om de cellen te permeabiliseren.
  6. Verwijder de wasmiddeloplossing met een pipet. Voer twee snelle spoeltjes uit door de PBS toe te voegen en vervolgens te verwijderen. Vervolgens, voer drie langer spoelwater door de constructies gedurende 5 minuten gedurende elke 5 minuten in de PBS in te slikken.
  7. Verdun primaire antilichamen in 4% paardserum. Verwijder de PBS uit de petrischalen die de vaste en doorlaatbare micro-TENNEN bevatten. Voeg voldoende primaire antilichaamoplossing toe aan de microkolommen om ze volledig te bedekken. Verzegel de petrischalen met parafilm om verdamping te voorkomen en incubatie gedurende de nacht (12-16 uur) bij 4 ° C.
  8. Verwijder de primaire antilichaamoplossing uit de afwas en spoel zoals beschreven in stap 4.6. In het donker bereiden u de secundaire antilichaamoplossing in 4,0% paardserum. Voeg voldoende secundaire antilichaamoplossing toe om de constructies volledig te bedekken, de afwas met aluminiumfolie te bedekken en gedurende 2 uur bij 18-24 ° C te incuberen.
  9. Bereid de Hoechst-oplossing (1: 10.000) in PBS om de kernen te vleken.
  10. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en incubeer de micro-TENNS in de Hoechst-oplossing gedurende 10 minuten bij 18-24 ° C. Voer vijf spoelen met PBS uit, elke 5-10 minuten. Vloei de Petri-schotel met PBS om de gekleurde micro-TENNELS te bedekken, draai de schaal in aluminiumfolie en berg deze bij 4 ° C tot het afbeelden wordt uitgevoerd.
    OPMERKING: Beelden voor de immunomerkte micro-TENNEN werden genomen met een laser confocale microscoop met een resolutie van 2.048 (~ 8 s / frame), een 10X objectief (0,64 μm / pixel), 487 nm excitatie en ~ 525 nm emissie golflengten voor Groene fluorescentie, 561 nm excitatie en ~ 595 nm emissie golflengten voor rode fluorescentie en ~ 3,22 μm / plakje met ~ 60 snijden gemiddeld voor de z-stapels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Micro-TENN's werden gecontroleerd met behulp van fase-contrast microscopie om hun cytoarchitectuur en axonale uitgroei te beoordelen ( Figuur 4 ). Binnen unidirectionele 2 mm lange micro-TENNEN werden neuronale aggregaten beperkt tot het ene uiteinde van de microkolom en geprojecteerd een bundel axonen door de binnenste kern. Axons strekte de volledige lengte van de kolom door 5 dagen in vitro (DIV) ( Figuur 4A ). Er was een grotere aanvanke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CNS letsel en ziekte resulteert typisch in het verlies of de disfunctie van de long-distance axonale pathways die de hersenverbinding omvatten, met of zonder gelijktijdige neuronale degeneratie. Dit wordt gecompenseerd door de beperkte capaciteit van het CNS om neurogenese en regeneratie te bevorderen. Ondanks het streven naar herstelstrategieën zoals groeifactor-, cel- en biomateriaalafgifte als individuele of combinatorische benaderingen, falen deze technieken tegelijkertijd niet alleen de degeneratie van neuronale ce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiële steun is verstrekt door de National Institute of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) en F31-NS090746 (Katiyar)), de Michael J. Fox Foundation (Therapeutische Pijpleiding Programma 9998 (Cullen) De Cullen, de National Science Foundation (DN-1321851, Struzyna en Adewole), de afdeling Veteranenzaken (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), de American Association Neurologische Chirurgen en Congres van Neurologische Chirurgen (Codman Fellowship in Neurotrauma en Critical Care) (2015-2016) en het Amerikaanse Geneeskunde-onderzoeks- en materiaalkommando (# W81XWH-13-207004 (Cullen) en W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Laser cutterUniversal Laser SystemsPLS4.75Wordt gebruikt om de lasergesneden microkanaalvorm te maken.
Laser-gesneden micro-kolom fabricageapparaatOp maat gemaakt--------------Neem contact op met onze onderzoeksgroep als u geïnteresseerd bent. Afmetingen en blauwdrukken worden in het manuscript gegeven.
Schroeven----------------------------#4-40 met een draaddiameter van 3,05 mm
Moeren----------------------------#4-40 met een draaddiameter van 3,05 mm
Acupuncturnaald (180 µm diameter)Lhasa Medicalsj.16X40De diameter kan worden gevarieerd volgens de gewenste grootte voor het lumen van de microkolom.
PetrischaalFisher08772B
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS)Invitrogen14200075
Polystyreen wegwerp serologische pipetFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Capillaire buis (398 µm diameter)Fisher21170DDe diameter kan worden gevarieerd volgens de gewenste grootte voor de micro-kolom schaal.
Verwarmde plaatFisherSP88857200
MagneetstaafFisher1451352
MicropipetSigmaZ683884-1EA
25 mm naaldFisher14-826-49
MicroscalpelRoboz SurgicalRS-6270
SchaarFine Science Tools14081-09
ForcepsWorld Precision Instruments501985
Hete kralen sterilisatorSigmaZ378550-1EA
StereoscoopNikonSMZ800NWordt gebruikt voor alle dissectiestappen en voor micro-TENN fabricage.
Rat tail type I collageenCorning354236Bewaar op 4 ºC en verwijder alleen wanneer nodig.  Gebruik ijs om de temperatuur te behouden wanneer in gebruik.
MicrocentrifugebuisFisher02-681-256
Muis laminineCorning354232Bewaar op 4 ºC en verwijder alleen wanneer nodig.  Gebruik ijs om de temperatuur te behouden wanneer in gebruik.
Neurobasaal mediumInvitrogen21103049Basaal medium voor de kweek van pre-natale en embryonale neuronale cellen. Bewaar bij 4ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik.
Natriumhydroxide (NaOH)FisherSS2661
Zoutzuur (HCl)FisherSA48-1
LitmuspapierFisher09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)Invitrogen14170112Bewaar bij 4 ºC.
0,25% Trypsine-EDTAInvitrogen25200056Bewaar bij -20 ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik.
Bovine pancreatische deoxyribonuclease (DNase) ISigma10104159001Bewaar bij -20 ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik.
B-27 SupplementInvitrogen12587010Supplement toegevoegd aan Neurobasal medium voor de kweek van hippocampale en corticale neuronen. Bewaar bij -20 ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik.
L-glutamine Invitrogen35050061Bewaar bij -20 ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik.
Sprague Dawley embryonale dag 18 rattenCharles RiverStrain 001
PasteurpipetFisher22-042816
15 mL centrifugeerbuisEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
CentrifugeFisher05-413-115
HemocytometerFisher02-671-6
Objet30 3D-PrinterStratasys --------------Wordt gebruikt om de piramidale microputjes te fabriceren.
3D-geprinte piramidale putjesvormOp maat gemaakt--------------Neem contact op met onze onderzoeksgroep als u geïnteresseerd bent. Afmetingen en blauwdrukken worden in het manuscript gegeven.
Polydimethylsiloxaan (PDMS) en uithardingsmiddelFisherNC9285739Komt als kit met elastomer en uithardingsmiddel. Gebruik binnen een chemische afzuigkap.
TrechterFisher10-348C
1 ml pipetbulbSigmaZ509035
Micro-spatelkaFisherS50821
12-well kweekplaatEMESCO1194-353043
OvenFisher11-475-154
IncubatorFisher13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373Bewaar bij -80ºC. Commercieel verkrijgbaar adeno-geassocieerd virus (AAV) met de GCaMP6f calciumindicator.
Formaldehyde 40%FisherF77P-4Formaldehyde is een giftige verbinding die kankerverwekkend is en moet in een aparte container worden gedumpt. 
Triton X-100SigmaT8787Niet-ionische oppervlakteactieve stof die wordt gebruikt om celmembranen te permeabiliseren.
Paarden serumGibco16050-122
Muis anti-Tuj-1/beta-III tubulin primaire antilichaamSigmaT8578-200ULBewaar bij -20ºC.
Kon

Referenties

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16 (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67 (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27 (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. , at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31 (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48 (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27 (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26 (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11 (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6 (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106 (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6 (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11 (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3 (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20 (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. , Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14 (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23 (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. , (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116 (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24 (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25 (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44 (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5 (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Micro TENN sreconstructie van neurale netwerkenaxonale tract engineeringhydrogel microkolommenneuronale aggregatenmodellering van het hersenconnectoomherstel van axonale padencelmigratiesynaptische immunolabelingdriedimensionale neurale netwerken

Gerelateerde artikelen