Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Functioneel herstel komt zelden voor als gevolg van letsel of door de ziekte veroorzaakte degeneratie in het centrale zenuwstelsel (CNS) door de remmende omgeving en de beperkte capaciteit voor neurogenese. We ontwikkelen een strategie om tegelijkertijd neuronale en axonale wegverlies in het beschadigde CNS aan te pakken. Dit manuscript presenteert het fabricageprotocol voor microweefselgemanipuleerde neurale netwerken (micro-TENNs), implanteerbare constructen bestaande uit neuronen en uitgelijnd axonale tracten die het extracellulaire matrix (ECM) lumen van een voorgevormde hydrogelcilinder overspannen, honderden micron in diameter die centimeter kunnen verlengen in lengte. Neuronale aggregaten zijn afgebakend aan de extremen van de driedimensionale omhulling en worden gespannen door axonale projecties. Micro-Tenns zijn uniek gepositioneerd als een strategie voor de reconstructie van het CNS, waarbij aspecten van de hersenbindende cytoarchitectuur worden geïmplementeerd en mogelijk middelen voor netwerkvervanging bieden. De neuRonale aggregaten kunnen samenvallen met gastheerweefsel om nieuwe functionele relais te vormen voor het herstellen en / of moduleren van ontbrekende of beschadigde schakelingen. Deze constructen kunnen ook fungeren als pro-regeneratieve "living scaffolds" die ontwikkelingsmechanismen voor celmigratie en axonale pathfinding kunnen exploiteren, die synergistische structurele en oplosbare signalen op basis van de staat van regeneratie verschaffen. Micro-Tenns worden vervaardigd door vloeibare hydrogel te gieten in een cilindrische vorm die een longitudinale centreerde naald bevat. Zodra de hydrogel gelegerd is, wordt de naald verwijderd, waardoor een holle microkolom wordt gelaten. Een ECM oplossing wordt toegevoegd aan het lumen om een omgeving te verschaffen die geschikt is voor neuronale hechting en axonale uitgroei. Gedissocieerde neuronen worden mechanisch geaggregeerd voor precies zaaien in één of beide uiteinden van de microkolom. Deze methodologie produceert betrouwbaar zelfstandige miniatuurconstructen met langwerpige axonale tracten die de kenmerken van hersenneuranatomie kunnen herkapituleren. Synaptische immNiet-etiketterende en genetisch gecodeerde calciumindicatoren suggereren dat micro-TENN's uitgebreide synaptische verdeling en intrinsieke elektrische activiteit bezitten. Bijgevolg vormen micro-TENNEN een veelbelovende strategie voor gerichte neurochirurgische reconstructie van hersenwegen en kunnen ook worden toegepast als biofidelische modellen om neurobiologische verschijnselen in vitro te bestuderen.
Inleiding
Een algemeen kenmerk van aandoeningen en ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS), zoals traumatisch hersenletsel (TBI), ruggenmergletsel (SCI), beroerte, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson, is de ontkoppeling van axonale wegen en neuronale cellen Verlies 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Bijvoorbeeld, wanneer een ischemische beroerte onbehandeld wordt, wordt geschat dat axonen verloren gaan met een snelheid van 7 mijl axonen per minuut 5 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures die dieren betreffen, werden goedgekeurd door de Institusionele Diervoeder- en Gebruikscommissies aan de Universiteit van Pennsylvania en het medisch centrum van Michael J. Crescenz Veterans Affairs en voerden zich aan de richtlijnen die zijn uiteengezet in het NIH Public Health Service Beleid inzake Humane Care and Laboratory Dieren (2015).
1. Ontwikkeling van de Agarose Hydrogel (Acellulaire Component van Micro-Tenns)
- Bereiding van de agaroseoplossing
- Maak een reservoir voor de microkolommen in een biosafety-kastje door 20 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) over ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Micro-TENN's werden gecontroleerd met behulp van fase-contrast microscopie om hun cytoarchitectuur en axonale uitgroei te beoordelen ( Figuur 4 ). Binnen unidirectionele 2 mm lange micro-TENNEN werden neuronale aggregaten beperkt tot het ene uiteinde van de microkolom en geprojecteerd een bundel axonen door de binnenste kern. Axons strekte de volledige lengte van de kolom door 5 dagen in vitro (DIV) ( Figuur 4A ). Er was een grotere aanvanke.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
CNS letsel en ziekte resulteert typisch in het verlies of de disfunctie van de long-distance axonale pathways die de hersenverbinding omvatten, met of zonder gelijktijdige neuronale degeneratie. Dit wordt gecompenseerd door de beperkte capaciteit van het CNS om neurogenese en regeneratie te bevorderen. Ondanks het streven naar herstelstrategieën zoals groeifactor-, cel- en biomateriaalafgifte als individuele of combinatorische benaderingen, falen deze technieken tegelijkertijd niet alleen de degeneratie van neuronale ce.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Financiële steun is verstrekt door de National Institute of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) en F31-NS090746 (Katiyar)), de Michael J. Fox Foundation (Therapeutische Pijpleiding Programma 9998 (Cullen) De Cullen, de National Science Foundation (DN-1321851, Struzyna en Adewole), de afdeling Veteranenzaken (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), de American Association Neurologische Chirurgen en Congres van Neurologische Chirurgen (Codman Fellowship in Neurotrauma en Critical Care) (2015-2016) en het Amerikaanse Geneeskunde-onderzoeks- en materiaalkommando (# W81XWH-13-207004 (Cullen) en W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Laser cutter | Universal Laser Systems | PLS4.75 | Wordt gebruikt om de lasergesneden microkanaalvorm te maken. |
| Laser-gesneden micro-kolom fabricageapparaat | Op maat gemaakt | -------------- | Neem contact op met onze onderzoeksgroep als u geïnteresseerd bent. Afmetingen en blauwdrukken worden in het manuscript gegeven. |
| Schroeven | -------------- | -------------- | #4-40 met een draaddiameter van 3,05 mm |
| Moeren | -------------- | -------------- | #4-40 met een draaddiameter van 3,05 mm |
| Acupuncturnaald (180 µm diameter) | Lhasa Medical | sj.16X40 | De diameter kan worden gevarieerd volgens de gewenste grootte voor het lumen van de microkolom. |
| Petrischaal | Fisher | 08772B | |
| Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) | Invitrogen | 14200075 | |
| Polystyreen wegwerp serologische pipet | Fisher | 13-678-11D | |
| Agarose | Sigma | A9539-50G | |
| Capillaire buis (398 µm diameter) | Fisher | 21170D | De diameter kan worden gevarieerd volgens de gewenste grootte voor de micro-kolom schaal. |
| Verwarmde plaat | Fisher | SP88857200 | |
| Magneetstaaf | Fisher | 1451352 | |
| Micropipet | Sigma | Z683884-1EA | |
| 25 mm naald | Fisher | 14-826-49 | |
| Microscalpel | Roboz Surgical | RS-6270 | |
| Schaar | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Hete kralen sterilisator | Sigma | Z378550-1EA | |
| Stereoscoop | Nikon | SMZ800N | Wordt gebruikt voor alle dissectiestappen en voor micro-TENN fabricage. |
| Rat tail type I collageen | Corning | 354236 | Bewaar op 4 ºC en verwijder alleen wanneer nodig. Gebruik ijs om de temperatuur te behouden wanneer in gebruik. |
| Microcentrifugebuis | Fisher | 02-681-256 | |
| Muis laminine | Corning | 354232 | Bewaar op 4 ºC en verwijder alleen wanneer nodig. Gebruik ijs om de temperatuur te behouden wanneer in gebruik. |
| Neurobasaal medium | Invitrogen | 21103049 | Basaal medium voor de kweek van pre-natale en embryonale neuronale cellen. Bewaar bij 4ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik. |
| Natriumhydroxide (NaOH) | Fisher | SS2661 | |
| Zoutzuur (HCl) | Fisher | SA48-1 | |
| Litmuspapier | Fisher | 09-876-18 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14170112 | Bewaar bij 4 ºC. |
| 0,25% Trypsine-EDTA | Invitrogen | 25200056 | Bewaar bij -20 ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik. |
| Bovine pancreatische deoxyribonuclease (DNase) I | Sigma | 10104159001 | Bewaar bij -20 ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik. |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 12587010 | Supplement toegevoegd aan Neurobasal medium voor de kweek van hippocampale en corticale neuronen. Bewaar bij -20 ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik. |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | Bewaar bij -20 ºC en verwarm bij 37 ºC voor gebruik. |
| Sprague Dawley embryonale dag 18 ratten | Charles River | Strain 001 | |
| Pasteurpipet | Fisher | 22-042816 | |
| 15 mL centrifugeerbuis | EMESCO | 1194-352099 | |
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Centrifuge | Fisher | 05-413-115 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| Objet30 3D-Printer | Stratasys | -------------- | Wordt gebruikt om de piramidale microputjes te fabriceren. |
| 3D-geprinte piramidale putjesvorm | Op maat gemaakt | -------------- | Neem contact op met onze onderzoeksgroep als u geïnteresseerd bent. Afmetingen en blauwdrukken worden in het manuscript gegeven. |
| Polydimethylsiloxaan (PDMS) en uithardingsmiddel | Fisher | NC9285739 | Komt als kit met elastomer en uithardingsmiddel. Gebruik binnen een chemische afzuigkap. |
| Trechter | Fisher | 10-348C | |
| 1 ml pipetbulb | Sigma | Z509035 | |
| Micro-spatelka | Fisher | S50821 | |
| 12-well kweekplaat | EMESCO | 1194-353043 | |
| Oven | Fisher | 11-475-154 | |
| Incubator | Fisher | 13 998 076 | |
| AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | UPenn Vector Core | 36373 | Bewaar bij -80ºC. Commercieel verkrijgbaar adeno-geassocieerd virus (AAV) met de GCaMP6f calciumindicator. |
| Formaldehyde 40% | Fisher | F77P-4 | Formaldehyde is een giftige verbinding die kankerverwekkend is en moet in een aparte container worden gedumpt. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Niet-ionische oppervlakteactieve stof die wordt gebruikt om celmembranen te permeabiliseren. |
| Paarden serum | Gibco | 16050-122 | |
| Muis anti-Tuj-1/beta-III tubulin primaire antilichaam | Sigma | T8578-200UL | Bewaar bij -20ºC. |
| Kon |
Referenties
- Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
- Tallantyre, E. C., Bø, L., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
