Methodenartikel

Een multi-hole Cryovial Voorkomt bevriezen Artefacten als spierweefsel direct worden ondergedompeld in vloeibare stikstof

11.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55616

⸱

6 april 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een procedure voor spierweefsel bevriezen door ze rechtstreeks dompelen in vloeibare stikstof. Dit protocol wijst een nieuwe cryovial dat de "blanket effect" stikstofgas kan voorkomen bij vloeibare stikstof contact maakt met het weefseloppervlak van een monster.

Samenvatting

Studies over skeletspier fysiologie staan ​​voor de technische uitdaging van geschikte verwerking van de monsters met secties met duidelijk zichtbare cytoplasmatische compartimenten verkrijgen. Een andere hindernis is de strakke aanbrenging van spiervezels naar de omliggende weefsels. Omdat het proces van weefsel fixatie en inbedding in paraffine leidt tot het krimpen van spiervezels, invriezen optimale middel verharding spierweefsel te snijden. Echter, een algemeen voorkomende probleem de vorming van ijskristallen optreedt tijdens de bereiding van ingevroren secties vanwege het hoge watergehalte van de spier. De hier gepresenteerde protocol beschrijft eerst een eenvoudige en efficiënte werkwijze voor het invriezen goed spierweefsel door onderdompeling in vloeibare stikstof. Het probleem met vloeibare stikstof alleen dat het veroorzaakt de vorming van een stikstof gasbarrière naast het weefsel, die fungeert als een isolator en remt de koeling van de weefsels. Om deze "damp deken" effect te vermijden, een new cryovial is ontworpen om de snelheid van de vloeistofstroming rond het weefseloppervlak te verhogen. Dit werd bereikt door ponsen in totaal 14 inlaatopeningen in de wand van het flesje. Volgens beldynamica, een hogere vloeistofstroom leidt tot kleinere bellen en minder kansen om een ​​gasbarrière te vormen. Wanneer vloeibare stikstof in de cryovial door de inlaat openingen stroomt, de stroomsnelheid rond het weefsel snel genoeg om de gasbarrière te elimineren. Vergeleken met de werkwijze voor het invriezen spierweefsel met behulp van vooraf gekoelde isopentaan, dit protocol is eenvoudiger en efficiënter en kunnen worden gebruikt om spieren bevriezen in een debiet wijze. Bovendien is deze methode is optimaal voor instellingen die geen toegang hebben tot isopentaan, dat is zeer licht ontvlambaar bij kamertemperatuur hebben.

Inleiding

Skeletspier de meest waardevolle component van een vleesproducerende dier uit de voeding en het oogpunt van verwerking. In de vleesindustrie, zijn twee bijzonder belangrijke aspecten: de efficiëntie van spiergroei en de kwaliteit van het vlees verkregen. Als hoofdbestanddeel van de spier, spiervezels rechtstreeks verband met groei en vers vleeskwaliteit bij dieren 1. Bijvoorbeeld, het totaal aantal vezels (TNF) en de Doorsnede van vezels (CSAF) bepalen grotendeels spiermassa en vleeskwaliteit; ook, Fiber Type Composition (FTC) heeft een sterke invloed vers vlees kwaliteit 2. Daarom is de manipulatie van spiervezel eigenschappen bij dieren is een zeer effectieve methode om de kern rentabiliteit en het concurrentievermogen van boerderijen 1 te verhogen.

Tot op heden zijn verschillende intrinsieke en extrinsieke factoren geïdentificeerd aan spiervezels characterist manipulerenics 1. Deze bewerking kan worden bereikt door gerichte selectie van dieren met specifieke genen, zoals het myostatine-gen bij runderen 3, de Callipyge gen bij schapen 4 en de RYR1 en IGF2 genen in varkens 5. Ook, dieet controle en behandelingen met specifieke hormonen spelen een belangrijke rol in de spiervezels elementen 6. Zo zou een benadering die genetische en voedingsfactoren combineert in staat zijn om mager vlees inhoud en kwaliteit van het vlees te verbeteren. Studies on spiervezels zijn beperkt in de vleesindustrie omdat de opheldering van de structuur van de spiervezels nog steeds een uitdaging.

Spiervezel eigenschappen worden geïdentificeerd door histochemische werkwijzen, zoals myosine adenosinetrifosfatase (ATPase) test. Deze werkwijze berust op het feit dat enzymen in dunne (6-8 pm) ingevroren sectiesspiervezels kan chemisch reageren met bepaalde producten. Echter, het watergehalte van spieren is dan 75% bij varkens, konijnen, muizen en mensen, onafhankelijk van de positie (dat wil zeggen, rug, buik of achterbeen) 7. Dergelijke hoge vochtgehalte in de spieren veroorzaakt voorkomende probleem - bevriezing artefacten - tijdens de bereiding van vriescoupes, zoals eerder beschreven 8, 9. In de meeste gevallen is het bijna onmogelijk om adequaat te bevriezen spierweefsel in een slachthuis productielijn, volgens onze ervaring.

De hier gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte werkwijze die in ons laboratorium spierweefsel bevriezen cryosectioning in een high-throughput manier. Het hoogtepunt van deze werkwijze is een nieuwe cryovial die is ontworpen voor flash-bevriezen spierweefsel in vloeibare stikstof. De huidige werkstroom kan gelijktijdig weefsel vergemakkelijktinvriezen en verwerking voor een uitstekende spier cryosectie, met een duidelijk zichtbare cytoplasmische compartiment en de dichte appositie van myovezels aan het omringende weefsel. Bovendien kan dit protocol worden toegepast op een breed scala van mogelijkheden voor weefselanalyse omdat vloeibare stikstof niet mengen met weefsels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De huidige methode is vastgesteld en gevalideerd te oogsten en opslaan van meer dan 1000 spiermonsters voor histologische kleuring in ons laboratorium. Alle procedures met betrekking tot de verzorging van dieren en het gebruik gevolgd de door het ministerie van Landbouw van China richtlijnen.

1. apparatuur voor Sample Collection

  1. Label het monster identiteit op elk cryogene flacon.
    Opmerking: De cryogene flacon is speciaal ontworpen om weefselmonsters verse bevriezen de cryosectie procedure (figuur 1A). De flesjes zijn gemaakt van polypropyleen in een vormfabriek (figuur 1C).
  2. Haal de volgende apparatuur: vloeibare stikstof in een geschikte stikstof tank vloeibare, veiligheidsbril of gezichtsscherm, diepvries handschoenen, 10 cm forceps, 25 cm pincet, piepschuim koeler (binnenafmetingen: 20 cm lang x 12 cm breed x 13,5 cm hoog ; buitenafmetingen: 24 cm lang x 16 cm breed x 15 cm hoog), kunststoffolie (2,5 cm lang x 0,8 cm breed x 0,1 mm dik),een scalpel, en A4 PVC bindende covers (21 cm x 29,5 cm) (Figuur 1B).

2. Bereiding van spiermonsters

  1. Vul het piepschuim koeler met vloeibare stikstof 5 min vóór monstername.
    Opmerking: Het grote vloeistofkolom stikstof is essentieel omdat een deel van de vloeibare stikstof kookt verwijderd en verandert in gas Wanneer monsters aanraken. Om de frequentie van overdracht van vloeibare stikstof te reduceren tot het verlies vullen, moet een geschikte afmetingen piepschuim koeler vooraf verkregen volgens het aantal monsters.
  2. Zodra een monster wordt verkregen, plaats voorzichtig het op een A4 PVC bindende deksel en let op de richting van de spiervezels.
    LET OP: Hier gebruikten we de doorsnede van de longissimus doris spier van de eerste tot de laatste lendenwervel in varkens. De monsters zijn ongeveer 12 cm, 8 cm breed en 5 cm hoog.
  3. Met een scalpel twee parallelle insnijdingen door het monster in de richting van de spiervezels ongeveer 3 cm lang en 0,6 cm. Trim de spier ingesneden tot een rechthoek van ongeveer 0,6 cm breed x 0,6 cm x 1,5 cm lang.
    OPMERKING: De betrouwbaarheid van de meting van de dwarsdoorsnede van de spiervezels hangt meestal af van de vezeloriëntatie van de ingesneden spier.
  4. Met 10 cm tang om zachtjes het monster op een stuk plastic folie, met de lengteas van de ingesneden spier parallel aan de lange zijde van de folie (figuur 2A).
    Opmerking: De kunststof folie heeft twee functies: een vasthoudfunctie die helpt bij het vaststellen van de oriëntatie van de spiervezels en een adhesie functie die scheuren in het monster voorkomt als gevolg van snelle bevriezing.
  5. Behulp van een tang, plaats het spierweefsel in het onderste midden van een gemerkt cryogeen flesje, tussen de inlaat openingen, en vervolgens strak deksel op het vat (figuur 2B).

3. Het invriezen en opslaan spiermonsters

  1. Toepassing van 25 cm pincet snel onderdompelen gehele cryogene flacon in vloeibare stikstof in de voorgekoelde piepschuim koeler, wachten totdat de vloeibare stikstof niet kookt (circa 10-20 s).
    OPMERKING: De cryovial drijven wanneer de vloeibare stikstof kookt, zo zorgvuldig dompel de flacon in de kokende vloeibare stikstof gedurende 10-20 s.
  2. Breng de spiermonsters een vloeibare stikstof opslagtank of een -80 ° C vriezer voor langetermijnopslag.

4. prepareren

  1. Voorkoelen een cryostaat tot tussen -20 ° C en -22 ° C.
  2. Verwijder de oude microtoom mes vegen van de meshouder en anti-rolplaat in de cryostaat Plaats een nieuwe microtoom mes in de cryostaat en stel de snijbreedte tot 8 urn.
  3. Breng het monster in de spier cryogene flacon het stikstofatoom vloeistof opslagtank of -80 ° C vriezer om de cryostaat, transporteren in vloeibare stikstof of droogijs.
  4. Wacht 30 minuten voor het monster in evenwicht met de temperatuur van de cryostaat.
    LET OP: Elk apparaat dat het monster zou aanraken moet vooraf worden gekoeld, omdat een hoge temperatuur de vorming van ijskristallen in het monster zou kunnen veroorzaken.
  5. Monteer het monster in de monsterhouder onder optimale snijtemperatuur formulering van in water oplosbare glycolen en hars (oktober). Cut 8-um secties.
    OPMERKING: Stel de snijhoek loodrecht op de oriëntatie van de spiervezels, omdat de CSAF is de dwarsdoorsnede van spiervezels.
  6. Monteer de delen naar het midden van een bij kamertemperatuur microplaat. Onmiddellijk in zijn dia in een schuifkast in een -80 ° C vriezer. Sta niet toe dat de dia drogen bij kamertemperatuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Cryovial de illustratie en de gemeenschappelijke laboratoriummateriaal bevriezen spieren tijdens de bereiding van bevroren secties worden getoond in Figuur 1. De cryovials zijn gemaakt van polypropyleen in een vormfabriek. Elke flacon heeft in totaal 14 inlaatopeningen: men op de dop; een ander is aan de onderzijde; en de resterende 12 vormen vier parallelle lijnen, elk met vier gaten 90 ° ten opzichte van elkaar. Deze inlaatopeningen kunnen versnellen van de stromingssn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een nieuwe, multi-hole cryovial voor het invriezen en bewaren van spierweefsel aan histologische evaluaties van de spier functie uit te voeren. De kritische stap in deze gewijzigde protocol is dat het monster in de multi-hole cryovial direct ondergedompeld in vloeibare stikstof. Voor zover wij weten, is dit de eenvoudigste en rapidest manier om uitstekende ingevroren monsters voor spier cryosectioning tussen de bestaande bevriezing methoden (zie de representatieve resultaten) te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten, financieel of anderszins, worden verklaard door de auteurs.

Dankbetuigingen

Dit project werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC): 31.301.950 en 31.671.288.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cryostat Microtome LeicaLeica CM1950
Digitaal Microscoop NikonNikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic filmOntworpen door onszelf
Vloeibare StikstofAlgemeen gebruikt
ScalpelAlgemeen gebruikt
10 cm pincetAlgemeen gebruikt
25 cm tangAlgemeen gebruikt
VeiligheidsglasAlgemeen gebruikt
Vrieskast handschoenenAlgemeen gebruikt

Referenties

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793(2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Invriezen met vloeibare stikstofvoorbereiding van spierweefseleliminatie van de dampbarri reweefselcoupencryostaatcoupenATPase activiteitsanalyseisopentaan alternatiefskeletspierfysiologieprotocol voor weefselbevriezing

Gerelateerde artikelen