Laparoscopische techniek voor seriële Verzameling van lever en mesenteriale lymfeklieren in makaken

Samenvatting

We beschrijven hier een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor periodieke bemonstering van de lever en mesenteriale lymfeknopen (MLN) bij makaken waarmee verhoogde bemonsteringsfrequentie, en vermindert de kans op operatieve complicaties in vergelijking met het uitvoeren van een laparotomie.

Samenvatting

De mesenteriale lymfeknopen (MLN) en de lever worden blootgesteld aan microben en microbiële producten uit de gastro-intestinale (GI) stelsel, waardoor ze immunologisch uniek. Het maagdarmkanaal en bijbehorende MLN zijn sites vroege virale replicatie in humane immunodeficiëntie virus (HIV) en het MLN waarschijnlijk belangrijk reservoir sites die latent geïnfecteerde cellen zelfs na langdurige antiretrovirale therapie (ART) haven. De lever is aangetoond dat het een belangrijke rol bij immuun responsen op lentivirussen en blijkt een belangrijke rol spelen in de klaring van het virus uit de bloedsomloop. Niet-menselijke primaten (NHP) modellen voor HIV en Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) lijken sterk op deze aspecten van HIV-infectie en periodieke longitudinale bemonstering van primaire gebieden van virale replicatie en de bijbehorende immuunresponsen bij dit model zal helpen om kritieke gebeurtenissen in infectie helderen pathogenese en de impact van verschillende interventiestrategieën op deze gebeurtenissen. Current gepubliceerde technieken lever bemonsteren en MLN samen omvatten een grote operatie en / of necropsie, die het vermogen om deze belangrijke plaatsen op seriële wijze onderzocht bij hetzelfde dier beperkt. We hebben eerder beschreven een laparoscopische techniek voor het verzamelen van MLN. We beschrijven hier een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor seriële longitudinale bemonstering van lever en MLN door dezelfde twee poortlocaties vereist voor het verzamelen van MLN. Het gebruik van dezelfde twee poorten minimaliseert de impact op de dieren geen extra incisies nodig. Deze techniek kan worden gebruikt met een verhoogde bemonsteringsfrequentie vergeleken met een grote buikoperatie en vermindert de kans op operatieve complicaties en bijbehorende lokale en systemische ontstekingsreacties die de interpretatie van de resultaten zou kunnen bemoeilijken. Deze procedure heeft potentieel om studies met NHP modellen terwijl het verbeteren van het welzijn van dieren te bevorderen.

Inleiding

Het gastro-intestinale (GI) kanaal is het lichaam grootste mucosale oppervlak wordt blootgesteld aan een groot aantal antigenen afkomstig uit voedsel, ziekteverwekkers en endosymbiontische bacteriële gewoonlijk aangeduid als microbiome ^{1, 2.} Mesenterische lymfeknopen (MLN) lijn het maagdarmkanaal en zijn voornaamste plaats van immuunfunctie te bevorderen ontstekings- of tolerogene reacties bij deze verschillende antigenen. De fysieke ordening van de MLN creëert een in compartimenten systeem dat kan reageren op antigenen lokaal opwekken zonder systemische responsen ^3. Ook het bloed uit het spijsverteringskanaal afvoeren naar de lever via de poortader alvorens terug te keren om de bloedsomloop, en is dus blootgesteld aan microben en microbiële producten die uit het spijsverteringskanaal hebben translocatie in de lamina propria en ging de bloedbaan ^4. De lever functioneert ook als secundaire lymfe-organen eennd heeft een groot aantal immuuncellen, waaronder gespecialiseerde macrofagen, om translocatie microben ^{5, 6} te verwijderen. Dus de MLN en de lever het primaire immuunorganen blootgesteld aan commensale en pathogene bacteriën van het maagdarmkanaal, en het milieu van antigenen uit andere bronnen, waardoor ze uniek en belangrijk vanuit een immunologisch perspectief.

De MLN zijn kritisch plaatsen voor de evaluatie van de virologische en immunologische effecten van menselijke immunodeficiency virus (HIV) of pathogene simian immunodeficiency virus (SIV) infectie, en zijn waarschijnlijk betrokken in de vroege verspreiding van SIV na intrarectale uitdaging. -Darm-geassocieerd lymfeweefsel is bekend als een belangrijke plaats van persistent HIV replicatie ondanks effectieve controle van viremie moderne antiretrovirale therapie (ART) ^7. SIV infectie modellen hebben aangetoond dat MLN belangrijke reservoirs van latent virus en kande primaire reservoir ^{8, 9.} De lever is ook belangrijk lentivirale infectie bewezen door de accumulatie van SIV specifieke CD8 ⁺ T cellen in de levers van makaken tijdens acute SIV-infectie ^10. Verder is het de belangrijkste orgaan verantwoordelijk voor het opruimen van het virus uit de omloop ^11.

HIV en SIV-infectie zijn geassocieerd met veranderde GI microbiota, verstoord GI epitheel integriteit en verhoogde translocatie van microben en microbiële producten van de dikke darm in de perifere circulatie en ^{12, 13.} Deze processen zijn geassocieerd met de lokale en systemische immunologische activering en verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij HIV geïnfecteerde individuen ^14. SIV-infectie, zijn translocatie bacteriën waargenomen in de MLN ^15, terwijl de accumulatie van micRobial producten in de lever is aangetoond dat het resulteert in ontsteking en beschadiging van het orgaan ^16. Dus in de context van HIV en SIV infecties, de MLN en lever kan zeer informatief zijn voor het begrijpen van de ontstekingsprocessen aangedreven door GI-resident bacteriën.

Hier presenteren we een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor periodieke bemonstering van de MLN en lever bij niet-humane primaten (NHP's). We demonstreren succesvolle uitvoering van deze techniek op twee gezonde vrouwelijke rhesus makaken (RMS), het bemonsteren van elk dier twee keer, met 160 dagen tussen elke operatie. We gaan op deze monsters te gebruiken om zeer consistente gegevens tussen de twee tijdstippen evalueren en vergelijken sleutel leukocyten en lymfocyten populaties in elk orgaan met behulp van flowcytometrie, en demonstreren.

Protocol

De dieren werden gehuisvest en verzorgd in Vereniging voor de evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALACi) erkende voorzieningen, en alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Washington en goedgekeurd Washington National Primate Research Center.

1. Chirurgische Voorbereiding, anesthesie en analgesie

1. Sedatie en inductie
   1. Sedate van makaak met een intramusculaire injectie van 10 mg / kg ketamine en 0,015 mg / kg dexmedetomidine (gecombineerd in een spuit). Waarborgen zonder terugtrekking reflexen voorafgaand aan verwijdering uit de kooi.
   2. Intuberen het dier en het dier in een vlak van algemene anesthesie via isofluraan (1,0-2,5%) en 100% zuurstof. Zie referenties voor meer informatie over intubatie en algemene anesthesie bij makaken ^17,ref "> ^{18, 19.}
2. Anesthesie Ondersteuning en Monitoring
   1. Plaats een perifeer veneuze katheter en bieden isotone intraveneuze vloeistoffen (zoals lactaat Ringers oplossing) met een snelheid van 5 ml / kg / uur gedurende anesthesie en chirurgie. Breng een steriel oog smeermiddel aan het hoornvlies uitdroging te voorkomen.
   2. Analgesie verschaffen, zoals een vertraagde afgifte van buprenorfine (0,2 mg / kg, subcutaan).
      Opmerking: Een NSAID (zoals meloxicam of ketoprofen) kan ook worden verschaft tijdens anesthesie herstel, mits het experimentele protocol maakt NSAID toediening en dier normotensieve en goed gehydrateerd tijdens anesthesie.
   3. Monitoren anesthesie diepte (bijv kaak toon), hartslag, ademhalingssnelheid, ECG, bloeddruk, hartslag oxygenatie, eindtidale _CO2 en lichaamstemperatuur gedurende anesthesie en chirurgie.
      OPMERKING: Wanneer de buik wordt ingeblazen, mag het dier hypoventilate.Bieden mechanische ventilatie wanneer ademhaling afneemt, of eindtidale _CO2 niveaus boven 45 mmHg.
   4. Na de operatie toedienen atipamezol (0,15 mg / kg, intramusculair) voor dexmedetomidine omkering.
3. chirurgische Voorbereiding
   1. Voeren meerdere warm water klysma's om het volume van de ontlasting te verminderen in de colon te visualiseren en intestinale manipulatie steun ²⁰ tijdens de procedure.
   2. Gebruik tondeuse met een nummer 40 blad om haar van het chirurgische veld te verwijderen. Scheren van de ribben nok aan het schaambeen en van links naar rechts flank.
   3. Aseptisch bereiden het operatiegebied met behulp van geschikte antiseptica, zoals afwisselende chloorhexidine-alcohol of povidon-jodium-alcohol scrubs.
   4. Positioneer het dier op de operatietafel op zijn dorsum, onder een hoek halverwege tussen rug- en rechter laterale decubitus. Bind de armen en benen met touw in een uitgestrekte positie. Zorg voor een laatste chlorhexieten en alcohol prep wanneer het dier beweegt naar de operatiekamer en gepositioneerd voor chirurgie.

2. Chirurgie

Opmerking: Voor nadere informatie laparoscopie kleine dieren, zie referentie ^21.

1. Laparoscopische instrument Bereiding
   1. Draperen het dier met een steriele doek met opening.
   2. Met de hulp van een niet-steriele assistent, wikkel de digitale camera met de steriele camera laken en sluit de kabel aan op de toren. Bevestig de stijve ruimte om de camerakop.
   3. Bevestig de steriele lichtkabel de stijve reikwijdte en sluit de kabel aan de lichtbron. Witbalans van de camera volgens de instructies van de fabrikant.
   4. Bevestig de steriele insufflator slang aan op de insufflator.
2. laparoscopische Entry
   1. Met behulp van een # 15 scalpel, maak een ~ 5 mm incisie door de huid om de diepte van de buikspieren, approximately 1-2 cm links van de navel.
   2. Met behulp van de niet-dominante hand, til de buikwand craniaal van de plaats van de incisie. De dominante hand, plaats het uiteinde van de Veress naald door de incisie en de hoek de punt craniaal.
      OPMERKING: De penetratiehoek van de Veress naald is afhankelijk van de conditiescore van het dier. Bijvoorbeeld in een dikke dier, de Veress naald moet nagenoeg loodrecht op de buikwand te voegen. In een dunne, dient de toepassing Veress naald craniaal worden gedraaid om het risico van contact brengen van de ingewanden te verminderen.
      1. Die de as (niet de naaf) van de Veress naald, duw de naald door de buikwand dringen in de buikholte. Een duidelijke "klik" en een afname van de weerstand wordt gevoeld als de scherpe punt penetreert het peritoneum en de stompe punt van de Veress naaldveren voren in de buikholte.
         LET OP: Als de naald passeert op de juiste wijze in de te buikholte, zal er weinig weerstand wanneer deze wordt voortbewogen en teruggetrokken 1-2 cm.
   3. Sluit de _CO2 insufflator slang aan de naald en open de kraan. Breng het abdomen tot niet meer dan 10-12 mmHg om een ​​pneumoperitoneum te creëren.
      LET OP: De buik is ideaal inblazen bereikt als het symmetrisch is uitgebreid en er is een verlies van de normale scherpe contouren van de ribben marges. De druk moet voldoende ruimte voor het insteken van de canule / trocar verschaffen zonder risico met de ingewanden.
3. canule Placement
   1. Zodra de buik volledig is opgeblazen, maken ~ 5-7 mm incisie met een # 15 scalpel door de huid van de linker craniale buik om de buikspieren ~ 2-4 cm caudaal van de rib.
   2. Plaats een 5 mm trocar-canule samenstel door de huid incisie en de hoek het ~ 45-60 graden caudomedially. Doordringen in de buikholte op een diepte van 1-2 cm. screw de schroefdraad canule in de buik door rotatie van de canule (~ 0,5-1 cm verder) tot een diepte van 1,5-3 cm, en verwijder de trocar.
   3. Verwijder het insufflator slang van de Veress naald, zet de kraan en verwijder de naald. Sluit de insufflator slang aan op de canule en open de kraan naar een pneumoperitoneum te handhaven op niet meer dan 10 - 12 mmHg.
   4. Steek de stijve toepassingsgebied door de canule en in de buikholte.
   5. Onder camera visualisatie, blijft een kleine incisie met een # 15 scalpel door de buikspieren en peritoneum bij het vorige huidincisie voor Veress naaldinbrenging. De camera wordt gebruikt om de buikzijde van de incisie visualiseren vaten vermijden en bloeden minimaliseren.
      OPMERKING: Controleer de incisie door de spier en peritoneum groot opneming van de sonde en uittreding van het mesenterium (-0,5 cm) te vergemakkelijken. Een grotere incisie vereist om mesent exterioriserenery bij dieren met overmatige mesenteriale vet.
   6. Leg het dier in de Trendelenburg ²¹ aan de voeten verhoogd ongeveer 15-30 graden boven het hoofd. Dit is optioneel, maar kan gemakkelijker toegang tot mesenteriale lymfeklieren van de dikke darm, zoals de kleine darmkanaal toelaten zal verhuizen naar een meer craniale positie.
4. Mesenteriale lymfklierbiopsie
   1. Onder visualisatie camera, steekt een vaste sonde door de abdominale incisie in stap 2.3.5.
   2. Plaats de probe tussen de omentum en darmen en gebruik een vegende beweging zachtjes vegen het omentum van de darm visualisatie van de onderliggende mesenterium mogelijk. Doorgaan met de zwaaiende beweging gebruiken uit de caudaal van craniale buik. Het omentum kan de juiste craniale abdomen geplaatst zodat het uit het operatiegebied.
   3. Met de probe met de dalende colon beweegt naar links of rechts buikwand. Dit zal een betere visualisatie van t toestaanhij mesenterium om te helpen bij de zoektocht naar mesenterische lymfeklieren.
   4. Gebruik de sonde te vegen door het mesenterium naar de mesenterische lymfeklieren langs de dikke darm en mesenteriale vaten te lokaliseren.
      LET OP: de dikke darm knooppunten langs de mesenteriale grens van de dikke darm, kan links koliek knooppunten worden gevonden bij de afslag punten van de vaten, en de inferieure mesenteriale knopen zijn te vinden langs de inferieure mesenterische vaten. Mesenterische lymfeknopen zijn goed zichtbaar in magere dieren. Wanneer begraven in mesenteriale vet zullen ze vaak geven een iets verhoogd, glinsterende verschijning aan de bovenliggende mesenterium en kunnen meer een meer grijsachtige bruine kleur dan omliggende mesenteriale vet. Bovendien mesenterische lymfeknopen neiging langs lymfevaten en mesenteriale vasculatuur te liggen.
   5. Zodra een lymfeknoop geïdentificeerd, verwijder de sonde en steek de ratcheted Maryland pincet in de buikholte. Met de tang om het mesenterium grijpen nabij het doelknooppunt. Trek het mesenterium naar de inciSion, en verwijder de reikwijdte van de canule.
   6. Schakel de insufflator en laat de canule kraantje open naar de buik drukloos om uittreding van het mesenterium vergemakkelijken. Trek het mesenterium buiten het lichaam via de incisie. Eenmaal buiten gebracht, pakt het mesenterium met gebogen mosquito hemostats of pincet om toegang te krijgen door de incisie te waarborgen.
   7. Identificeer de lymfklier (en) binnen de geëxterioriseerde mesenterium door palperen van de steviger lymfeknoop en / of directe visualisatie van de grijzere kleur of nodulaire uiterlijk van de lymfeklier.
      1. Eenmaal geïdentificeerd, een kleine opening (~ 3-5 mm) in het mesenterium nabij het knooppunt via gebogen hemostats. Gratis bijlagen bij het mesenterium met behulp van stompe dissectie met de gebogen hemostats. Afbinden het vaatstelsel met 4-0 nietabsorbeerbare monofilamenthechtdraad als dat nodig is. Gebruik scherpe dissectie met een scalpel om de lymfeknoop verwijderd. Plaats de knooppunten in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium opijs.
   8. Onderzoek de geëxterioriseerde mesentery voor bloeden. Als bloeden wordt opgemerkt passende hemostase door afsluiten van de vaten met hemostats of ligaturen (4-0 nietabsorbeerbare monofilamenthechtdraad), of door middel van cauterisatie. Laat het mesenterium en insufflate de buik naar 10-12 mmHg om het mesenterium terugkeren naar de buikholte.
   9. Herhaal de stappen 2.4.1 tot 2.4.8 om extra lymfknoopbiopsies verkrijgen.
5. leverbiopsie
   1. Terug naar de tafel horizontaal.
   2. Plaats een schroefdraad canule in de buik door de incisie eerder voor lymfklierbiopsie verzameling (incisie gemaakt in stap 2.3.5). Zorgen de insnijding groot genoeg is (~ 5-7 mm) mogelijk te maken canule plaatsing zonder trocar inbrengen. Steek de starre bereik door deze canule naar de schedelholte buikholte en breng de craniale abdomen en de lever.
   3. Onder camera visualisatie, plaatst de biopsie forceps door de canule eerder geplaatste in de linker craniale abdomen (incisie gemaakt in stap 2.3.1).
   4. Lever biopsieën, plaatst de biopsietang onder de geselecteerde leverkwab marge met het beweegbare deel van de kaak tegenover de lever, opent de forceps en laat de marge te vallen in de open kaken. Verzekeren dat er geen omentum tussen de lever en de biopsietang. Pas de positie van de tang en sluit het instrument via gewenste monstergebied.
      1. Handhaaf druk gedurende ongeveer 20-30 s hemostase te verzekeren. Met de tang gesloten, verwijdert het monster door voorzichtig aan de tang omhoog door de canule. Dit zal voorzichtig scheur de biopsie van de lever. Plaats leverbiopsieën in RPMI 1640 medium op ijs.
         OPMERKING: De leverbiopsie grootte ongeveer 5 mm x 2 mm x 2 mm met behulp van 5 mm biopsietang.
   5. Onderzoek de biopsie site voor bloeding met behulp van camera visualisatie. Als bloeding wordt waargenomen, plaats een zoutoplossing moistened steriel wattenstaafje door de canule en druk uit op de biopsieplaats. Alternatief pack de biopsieplaatsen met steriele gel foam hemostase bevorderen.
   6. Herhaal de stappen 2.5.3 tot 2.5.5 om extra lever biopten te verkrijgen.
      OPMERKING: Hier, 3 biopsies per dier per procedure werden verzameld, wat voldoende is voor alle daaropvolgende analyses.
6. chirurgische Sluiting
   1. Onderzoek de buikholte bloeding.
      LET OP: Dit is niet gebeurd tot op heden. Indien overmatig bloeden wordt opgemerkt, bepaalt de plaats van bloeding en voldoende hemostase door druk met steriele wattenstaafjes of het gebruik van gel foam.
   2. Schakel de insufflator en open de canule kranen. Pas lichte druk met de hand op de buik volledig drukloos de buikholte. Verwijder het canules.
   3. Sluit elk van de buikwand insnijdingen met 1-2 eenvoudige onderbroken hechtingen per site. 4-0 absorbeerbare hechtdraad wordt aanbevolen.
   4. Voer een splash blok door het plaatsen van 0,1-0,3 cc bupivacaine in elke incisie lokale analgesie vóór wondsluiting.
   5. Sluit de huid met 1-2 begraven onderbroken hechtingen (4-0 absorbeerbare hechtdraad wordt aanbevolen) per site. Weefsellijm kan worden toegepast.

3. Leverbiopsie Verwerking en analyse lymfocyt

1. Slaan verschillende stukken van leverweefsel (ongeveer 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm groot) in cryopreservatie buizen, in een voorkeurs RNA opslagoplossing, en 10% formaline voor latere histologische en moleculaire analyses.
   1. Leg de resterende leverbiopsies in 50 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 1 x penicilline / streptomycine, 40 ug / ml van een in de handel verkrijgbaar collagenase oplossing, en 4 ug / ml DNAse in een steriele 250 ml plastic beker met een deksel. Roer krachtig gebruikmaking van een magnetische roerstaaf en roerplaat gedurende 1 uur bij 37 ° C.
2. Verdeel het gedigereerde weefsel gieten. Grind het gedigereerde weefsel (uit stap 3.1.1) over twee 70 urn filters passen in twee 50 ml conische buizen in een enkele celsuspensie met het einde van een steriele 5 ml spuit. Breng het volume van beide buizen tot 50 ml in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1 x penicilline / streptomycine (R10).
3. Centrifugeer de cellen bij 840 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C. Decanteren van het supernatans. Concentreer de cellen in een 50 ml conische buis door suspenderen cellen uit beide buizen in 5 ml en R10 samen het volledige 50 ml conische buis. Breng volume op 50 ml met behulp van R10. Aantal cellen met behulp van een hemocytometer om cellulaire opbrengst te bepalen.
   1. Centrifugeer de cellen bij 840 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in 1 ml R10, gelijkmatig te verdelen in twee 5 ml rondbodem polystyreenbuizen en breng het volume van elke buis 4 mL met R10, targeting voor> 500.000 cellen per buisje.
4. Centrifugeer de cellen bij 840 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C. Schenk de supernatant en resuspendeer de celpellet in 4 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer bij 840 xg gedurende 6 min bij 4 ° C.
5. Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 ul PBS langzaam door vortexen. Voeg 1,5 ul van een opgelapt worden dode cellen vlek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
6. Voeg de volgende onverdund oppervlaktekleuring antilichamen titers aanbevolen door de fabrikant: CD45-PerCP (kloon D058-1283), CD3-PE-CF594 (kloon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (kloon 2H7), CD4-BV605 ( kloon OKT4), CD8-BV570 (kloon RPA-T8), en CD14-BV785 (kloon M5E2). Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
7. Voeg 4 ml PBS en centrifugeer bij 840 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in 250 gl 1% paraformaldehyde in PBS.
   Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
8. Analyseer de celpopulaties met een flow cytometer als beschreven in referentie ^22.

Resultaten

Methoden voor het verwerken van verzamelde laparoscopisch MLN, alsmede cellulaire opbrengst en leukocyten frequenties in deze organen zijn eerder beschreven ^13. Figuur 1 toont cellulaire opbrengst en levensvatbaarheid vergelijken van de MLN en leverbiopsieën verzameld op twee tijdstippen 160 dagen behalve twee gezonde vrouwelijke RM's met deze laparoscopische techniek. We vonden dat cellulaire opbrengst uit de MLN was significant hoger dan bij de lever (P = 0,0021), met een gemiddelde van 33,5 x 10 ⁶ en 6,74 x 10 ⁶ cellen verkregen resp. Dode cel kleuring en analyse met flowcytometrie bleek dat> 90% van de cellen geïsoleerd uit beide organen levensvatbaar.

cytometrie met behulp van stroom, we geëvalueerd en vergeleken de overvloed van leukocyten en lymfocyten in de MLN en de lever. Een representatieve gating schema voor de lever in Figuur 2, waar we eerst gated op enkelvoudige cellen tot aggregaten uit te sluiten, gevolgd door selectie van alleen levensvatbare cellen, vervolgens selectie van CD45 ⁺ cellen, en ten slotte CD3 ⁺ cellen. Vanaf het CD3 ⁺ bevolking, evalueerden we abundanties van CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T-cellen, terwijl we geëvalueerd dichtheden van CD14 ⁺ en CD20 ⁺ cellen van de CD3- populaties. Representatieve doorstroomcytometrie grafieken die CD45 ⁺ en CD3 ⁺ populaties van de MLN en lever van zowel dieren op dag 0 en dag 160 worden getoond in figuur 3, terwijl figuur 4 toont leukocyten en lymfocyten abundanties van beide bemonsteringen van beide dieren. De MLN toonde significant hogere dichtheden van CD45 ⁺ cellen dan wel de lever (gemiddeld 76,9% en 7,66% van de levensvatbare cellen, respectievelijk p = 0,0002). Niet verrassend, de MLN toonde significant hogere verhoudingen van CD3 ⁺ T-cellen (P0; 0,0001) en CD4 ⁺ -T-cellen (P = 0,0004). Omgekeerd werd de lever aanzienlijk verrijkt op CD14 ⁺ leukocyten vergelijking met MLN (P = 0,0036). De MLN vertoonde een hogere gemiddelde van CD8 ⁺ T-cellen, maar dit was niet significant. Verrassenderwijs deze twee dieren beide organen toonde vergelijkbare dichtheden van CD20 ⁺ B-cellen. De cellulaire opbrengsten en dichtheden van verschillende leukocyten en lymfocyten subsets van de MLN in dit onderzoek eerder bevestigd gerapporteerde waarden ^23.

Figuur 1. Het totale cellulaire opbrengst (boven) en levensvatbaarheid van de cellen (onderste) vanaf Serieel Collected MLN en leverbiopten. De MLN toonde significant hogere cel opbrengsten dan deed de lever. Echter, beide soorten monsters verschaft voldoende cellen voor downstream analyses. Cellevensvatbaarheid gemeten door flow cytometrically behulp van een fixeerbaar dode cellen amine kleuring toonde dat beide soorten monsters leverde kenmerkend> 90% levensvatbaarheid van de cellen na dissociatie weefsel. Foutbalken standaardafwijking tussen monsters. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Vertegenwoordiger van flowcytometrie Gating Strategy. Eerst werden geaggregeerde cellen uitgesloten, gevolgd door selectie van alleen levensvatbare cellen na kleuring met behulp van een opgelapt worden dode cel amine vlek. Vervolgens werden CD45 ⁺ leukocyten geselecteerd, gevolgd door selectie van CD3 ⁺ T-cellen. Van de CD3 ⁺ populatie, werden CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T-cellen geanalyseerd. Vanaf het CD3 ^- bevolking, CD14 ⁺ en CD20 ⁺ cellen werden geanalyseerd. Thi s gating strategie werd ook gebruikt voor de MLN. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Flowcytometrie Plots van MLN en lever van Twee dieren langsrichting. MLN en levermonsters werden 160 dagen na elkaar verzameld voor zowel dieren. (A). MLN CD45 ⁺ cellen (leukocyten); (B) lever CD45 ⁺ cellen (leukocyten); (C) MLN ⁺ CD3 ⁺ cellen (T-cellen); (D) Lever CD3 ⁺ cellen (T-cellen). Voor beide dieren, de MLN vertoonde grotere hoeveelheden CD45 ⁺ en CD3 ⁺ cellen vergeleken met de lever. In de tijd, de frequenties van deze populaties waren gelijk voor beide dieren.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Frequenties van CD45 ⁺ cellen (links) en diverse leukocyten en lymfocyten subpopulaties (rechts) over 23 individuele Samplings. De MLNs weergegeven aanzienlijk groter frequenties van CD45 ^+, CD3 ⁺ en CD4 ⁺ cellen, terwijl de lever toonde significant grotere frequentie van de CD14 ⁺ leukocyten, het aantonen van de unieke functies van elk orgaan. Foutbalken standaardafwijking tussen monsters. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Hier tonen we een minimaal invasieve techniek voor seriële collectie van MLN en leverbiopten dat een 100% succes in deze en andere dieren die niet in deze studie beschreven gehad. Verder gebruik van deze techniek bij dezelfde dieren in de tijd niet geassocieerd met enige bijwerkingen. Inderdaad zijn er geen complicaties als gevolg van het gebruik van deze techniek in andere cohorten van dieren die waren geïnfecteerd met SIV, simian / human immunodeficiency virus (SHIV) of Zika virus (ongepubliceerde gegevens) geweest. Evenzo is deze operatie succesvol gebleken, zelfs bij dieren die eerder een grote buikoperatie hadden ondergaan, en in trombocytopenische dieren (niet-gepubliceerde gegevens). We hebben aangetoond dat deze monsters kunnen worden verzameld via dezelfde twee havens door het omkeren van de camera locatie bij het overschakelen van MLN aan de lever vermijden van de behoefte aan extra incisies. Factoren die van invloed de collectie van MLN zijn eerder gerapporteerd ^13.

Tot vier collecties van 3 MLN en 3 leverbiopten elk zijn uitgevoerd in de tijd op de individuele dieren zonder complicaties, veranderingen in de slagingspercentages, of wijzigingen in de gegevens die zijn verzameld. Bovendien is deze laparoscopische MLN / leververzamelingskast techniek is succesvol gecombineerd met andere werkwijzen zoals het verzamelen van perifere LN, endoscopische bovenste en onderste MD biopsieën, beenmergaspiratie, cerebrospinale vloeistof verzamelen en venapunctie bij dezelfde narcose gebeurtenis waardoor uitgebreide evaluatie van virologische en immunologische responsen op seriële wijze (ongepubliceerde gegevens).

De gehele procedure duurt gewoonlijk 30-45 minuten in beslag en wordt bereikt door twee -0,5 cm incisies. Bij obese dieren, kan het nodig zijn om een ​​grotere incisie (~ 1-1,5 cm) te halen MLN door en kan extra tijd in beslag nodig. Dieren met uitgebreide mesenteriale vet vereisen vaak aanzienlijke ervaring op differentiate MLN uit de omliggende vet. MLN zijn vaak te vinden langs de mesenteriale vaatstelsel en lijken vaker in de buurt van tak punten in de vaten te zijn. Een kritisch aspect van deze techniek is dat het geselecteerde MLN voldoende mobiliteit in het mesenterium wordt naar buiten gebracht door de abdominale incisie. Dientengevolge kan deze techniek niet worden gebruikt om MLN dichtbij de wortel van het mesenterium verzamelen. Als gevolg van de vergroting, is het soms makkelijker om MLN identificeren met de camera, en grijpen in de nabijheid van de MLN kan helpen bij het opsporen en identificeren van het knooppunt zodra deze is naar buiten genomen.

Gebruik van de Trendelenburg positie niet altijd vereist voor MLN verzamelen, en als MLN eenvoudig terug te vinden zonder het gebruik van Trendelenburg positie kan het leverbiopten makkelijker het zal voorkomen dat de organen verschuiven craniaal te maken. Soms, na plaatsing in Trendelenburg, de lever verschoven tegen het membraan en most worden voorzichtig terug op zijn plaats voorafgaand aan biopsie collectie gemanipuleerd. Als poort plaatsing voor het verzamelen MLN naar links worden leverbiopten kenmerkend uit de linker laterale en mediale linker leverlobben aangezien zij dichter bij de canule.

MLN verzameld en leverbiopten voorwaarde dat voldoende celopbrengsten voor verschillende stroomafwaartse analyses en vertoonden hoge levensvatbaarheid van de verzamelde cellen. Hier werden de cellen gekleurd voor flowcytometrische analyse van leukocyten en lymfocyten populaties en belangrijkste verschillen tussen deze twee belangrijke immuunorganen opgehelderd. Zo werden de MLN sterk verrijkt op CD4 ⁺ T-cellen vergeleken met de lever, gezien het belang van de MLN als centrale punten voor het verzamelen en verspreiden van adaptieve immuunreacties, alsmede het belang van CD4 ⁺ T voor het beheren inflammatoire en tolerogene respons op het milieu antigenen afgeleid van inname en GI-resident microorganismens = "xref"> 24. Nochtans, werd de lever aanzienlijk verrijkt op CD14 ⁺ leukocyten in vergelijking met de MLN. CD14 wordt voornamelijk tot expressie gebracht op monocyten en macrofagen en is een belangrijk onderdeel van het receptorcomplex voor bacterieel lipopolysaccharide (LPS) ^25. Inderdaad, verhoogde plasmaconcentraties van oplosbaar CD14 worden geassocieerd met microbiële translocatie en immuun activatie van HIV en SIV pathogene infecties ^26. Aldus hogere frequenties van CD14 ⁺ leukocyten in de lever waarschijnlijk resulteren uit een grotere bacteriële belasting in dit orgaan in vergelijking met de MLN.

Hier tonen we een snelle en minimaal invasieve chirurgische techniek voor seriële collectie van MLN en de lever biopten met behulp van slechts twee kleine incisies voor laparoscopische vermelding die niet heeft geleid tot negatieve resultaten. Deze monsters een bruikbare route om belangrijke immunologische, virologische en microbiologische processen die pla nemen evaluerence in de MLN en lever, die afzonderlijke en unieke aan systemische immuniteit. Ook lever biopten zijn van cruciaal belang voor de evaluatie van de gevolgen van HIV / SIV, drug therapieën, en translocatie microben, die vaak worden gecombineerd om aanzienlijke schade aan de lever ¹⁶ induceren op lange termijn. Verder, omdat de MLN en de lever zijn immuunorganen blootgesteld aan GI microbiota, de mogelijkheid om immuniteit in deze organen in de tijd te evalueren biedt een uitstekend platform voor het begrijpen van de rol die de microbiome speelt bij het handhaven van gastheer immuun homeostase. Bij elkaar genomen, de evaluatie van de lever en MLN is van groot belang in het kader van het vaccin en therapeutische werkzaamheden, SIV virale reservoir ontruiming, en algemene mucosale immuniteit. De mogelijkheid om deze monsters te verzamelen door middel van een minimaal invasieve benadering houdt in dat er minder risico van ontsteking in verband met de procedure dan bestaat met de huidige gepubliceerde technieken en minder impact op de fysiologie van de dieren. In de futuur, zullen we het potentieel evalueren om het verzamelen van MLN en de lever met de inning van de milt combineren door middel van dezelfde twee poort locaties mogelijk te maken voor de bemonstering van een ander belangrijk en onderscheiden deel van het immuunsysteem dat is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen in een aantal ziektemodellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Patterson Veterinary	97-890-8152
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub	Patterson Veterinary	07-842-6153
Vedco Alcohol, Isopropyl 70%	Patterson Veterinary	07-869-6434
Vedco Vetadine Scrub	Patterson Veterinary	07-869-6772
Hospira Lactated Ringer's 250 mL	Patterson Veterinary	07-800-9325
Adolescent Laparotomy Surgical Drape	Medline	DYNJP3004
Access 40 L Insufflator	Dyonics	7205832
300XL Xenon Light Source	Dyonics	7206084
460P 3 – CCD Digital Camera with Head	Dyonics	72200086
Universal Camera Drape, 7” x 96”	Endoscopy Support Services	ESS-6920
Universal Light Guide, 7.5 Ft	Endoscopy Support Services	US.OU225
Insufflator Tubing	Endoscopy Support Services	TM-102
Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree	Endoscopy Support Services	B30-0007-00
Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock	Endoscopy Support Services	B10-0025-00
Rigid scope, 5 mm x 300 mm	Endoscopy Support Services	B30-0071-00
Veress Needle, 2 mm x 80 mm	Endoscopy Support Services	8302.08
Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm	Endoscopy Support Services	8383.661
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm	Endoscopy Support Services	8390.2054
Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm	R. Wolf	8391.4063
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm	Endoscopy Support Services	8903.072
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm	Endoscopy Support Services	8919.333
Blunt Tip Trocar	Endoscopy Support Services	8903.101
Pyramidal Tip Trocar	Endoscopy Support Services	8903.121
CO2	Airgas	CD USPE
RPMI 1640	Fisher Scientific	SH30027FS	with L-Glutamine
RNAlater Stabilization Solution	ThermoFisher Scientific	AM7021
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Liberase TM Research Grade	Sigma Aldrich	5401119001	Commercially available colleganse solution
Dnase I from bovine pancrease	Sigma Aldrich	D5025
70 µm cell strainers	Morganville Scientific	CSS0200
5 mL Syringe	BD	309646
50 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339652
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	SH3007003
5 mL Round-Bottom polystyrene tubes	Fisher Scientific	14-959A
PBS	Fisher Scientific	SH3025601
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher Scientific	L34957	Amine dead cell stain
CD45-PerCP (clone D058-1283)	BD Biosciences	558411
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2)	BD Biosciences	562406
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4)	Biolegend	317438
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1)	BD Biosciences	560179
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7)	BD Biosciences	555624
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2)	BD Biosciences	563698
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN	Fisher Scientific	50-980-487
LSR II Flow Cytometer	BD	NA