Analyse van retinoïnezuur geïnduceerde neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in twee en drie-dimensionale embryoiden organen

Samenvatting

We beschrijven een werkwijze voor het gebruiken van muriene embryonale stamcellen voor het genereren van twee- of driedimensionaal embryoïde lichamen. Vervolgens hebben we uitgelegd hoe neurale differentiatie van de embryoid lichaamscellen door retinolzuur, en hoe ertoe te bewegen hun staat van differentiatie te analyseren door voorlopercellen cel marker immunofluorescentie en immunoblotting.

Samenvatting

Muis embryonale stamcellen (SER) geïsoleerd uit de binnenste massa van de blastocyst (gewoonlijk op dag E3.5), kan worden gebruikt als in vitro modelsysteem voor het bestuderen vroege embryonale ontwikkeling. Bij afwezigheid van leukemie remmende factor (LIF), SER differentiëren standaard tot neurale voorlopercellen. Ze kunnen worden vergaard in een driedimensionale (3D) sferisch aggregaat aangeduid embryoiden lichaam (EB) vanwege zijn gelijkenis met het vroege stadium embryo. EBS kunnen worden gezaaid op fibronectine beklede dekglaasjes, waar ze uitbreiden door kweken tweedimensionale (2D) extensies of geïmplanteerd in 3D collageenmatrices waar ze blijven groeien als sferoïden en differentiëren tot drie kiembladen: endodermale, mesodermale en ectodermale. De 3D collageen cultuur bootst de in vivo omgeving beter dan de 2D-EBS. De 2D EB cultuur vergemakkelijkt de analyse van immunofluorescentie en immunoblotting om differentiatie te volgen. We hebben een twee-staps neurale differentia ontwikkeldtie protocol. In de eerste stap worden EB opgewekt door de hangende druppel techniek en tegelijkertijd worden geïnduceerd om te differentiëren door blootstelling aan retinoïnezuur (RA). In de tweede stap neurale differentiatie verloopt in een 2D- of 3D-formaat bij afwezigheid van RA.

Inleiding

SER afkomstig van de blastocyst binnenste celmassa. Deze cellen zijn pluripotent, dat wil zeggen zij hebben het vermogen om te differentiëren in elk celtype van het organisme van herkomst. ESC in vitro differentiatie is van groot belang als een experimenteel systeem voor het onderzoeken van ontwikkelingstrajecten en mechanismen. Het biedt een krachtige en flexibele modelsysteem om nieuwe therapeutische benaderingen voor de correctie van cellen en weefsels dysfunctie te testen. EBS recapituleren vele aspecten van celdifferentiatie tijdens de vroege embryogenese. In het bijzonder kan EBS worden gebruikt wanneer embryonische letaliteit bemoeilijkt de cellulaire basis van de embryonale gebreken ^{1, 2} bepalen. EBS kan hetzij worden gevormd door de hangende druppel of vloeibare suspensietechnieken ^3. Het voordeel van de eerste is de mogelijkheid om EB consistente grootte en dichtheid te genereren, waardoor experimentele reproduceerbaarheid vergemakkelijkt.

interactie met extracellulaire matrix (ECM) adhesie eiwitten kunnen de motiliteit en overleving van hechtende cellen beïnvloeden. In de 2D-cultuur systeem, wordt fibronectine vaak toegepast op cel adhesie te verhogen tot het substraat. Fibronectine is een basale lamina component herkend door 10 soorten celoppervlak integrine heterodimeren ^4.

RA is een kleine lipofiele metaboliet van vitamine A die neurale differentiatie ^{5, 6} induceert. Hoge concentraties van RA bevorderen neurale genexpressie en onderdrukt mesodermale genexpressie tijdens EB vorming ^{7, 8.} RA wordt door vitamine A oxidatie tot retinaldehyde door een alcohol of retinol dehydrogenase, gevolgd door retinaldehyde oxidatie tot het uiteindelijke product door retinaldehyde dehydrogenase ^9. Neurale differentiatie vereist transport van RA uit het cytoplasma de kern van cellulaire RA-bindend eiwit 2 (CRABP2). In de kern, RA bindt aan de verwante receptor complex van een RAR-RXR heterodimeer ^10. Dit leidt tot rekrutering van transcriptionele co-activatoren, en initiatie van transcriptie ^{9, 11.} Bovendien RA bevordert de afbraak van gefosforyleerd (actieve) Smad1, dus tegenwerken van BMP en Smad signalering ^12. Naast deze activiteiten RA verhoogt Pax6 expressie, een transcriptiefactor die neuronale differentiatie ¹³ ondersteunt. RA signalering wordt gemoduleerd door sirtuine-1 (Sirt1), een nucleair nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) - afhankelijk enzym dat CRABP2 deacetylates interfereren met zijn translocatie naar de kern, en dus met RA binding aan de RAR-RXR heterodimeer ^{14, 15, 16.}

e_content "> Ons doel bij het ontwerpen van de RA-behandelde EB protocol hier beschreven neurale differentiatie optimaliseren om in vitro analyse van de signaleringspaden die ESC differentiatie reguleren in neuronale voorlopercellen te vergemakkelijken. Een voordeel van dit protocol is vergemakkelijking van de analyse van celfunctie door immunofluorescentie. 3D EB's niet goed gepenetreerd door antilichamen en moeilijk beeld. EB dissociatie in een 2D monolaag op specifieke tijdstippen tijdens neurale differentiatie bevordert immunokleuring en beeldvorming van de cellen met confocale microscopie.

Protocol

1. Cultuur van de muis embryonale fibroblasten (MEF)

1. Bereiden MEF medium, Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM hoge glucose) aangevuld met 15% foetaal runderserum (FBS).
2. Coat 100 mm celcultuurschalen met 0,5% gelatine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
3. Count MEF met behulp van een cytometer. Verwijder de gelatineoplossing en giet onmiddellijk MEF medium voorverwarmd tot 37 ° C. Snel ontdooien flesjes mitomycine-C behandelde MEFs in een 37 ° C waterbad gedurende 2 min, vervolgens zaad 2,8 x 10 ⁶ MEFs per 100 mm met gelatine gecoate schaal. Pas aantal cellen dienovereenkomstig bij gebruik van gerechten uit andere maten. Incubeer MEF overnacht bij 37 ° C, 5% _CO2.
4. Verander het medium op de volgende dag. Cultuur voor 2-3 dagen tot de MEF laag confluent.

2. Mouse ESC Cultuur

1. Bereid ESC medium, Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM), aangevuld met 15% FBS en 103 U / ml leukemie remmende factor (LIF), 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 55 mM 2-mercaptoethanol, penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), gentamicine (200 ug / ml) en 0,2% mycoplasma antibioticum.
2. Verwijderen MEF medium van de plaat bereid in stap 1 en vervangen 37 ° C voorverwarmd medium ESC.
3. Ontdooien een ESC flesje en zaadcellen bovenop de MEF laag. Incubeer bij 37 ° C, 5% _CO2 totdat SER confluentie bereiken.
4. Bereid nieuwe celcultuur platen met een confluente monolaag van MEFs. Om doorgang van de SER, eenmaal met PBS en los met 0,25% trypsine / EDTA gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C, 5% _CO2. Stop de behandeling met trypsine door toevoegen van verse IMDM met 15% FBS aan de cellen los, breng de celsuspensie aan een 15 ml buis en centrifugeer bij 160 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Verwijder het supernatant, resuspendeer SER vers IMDM en een vijfde passage van de cellen voor elke nieuwe MEF-gecoate schaal; Incubeer totdat de cellenbereiken samenvloeiing (meestal 4-5 dagen).

3. Zuig MEFs en cultuur SER op gelatine-gecoate platen

1. Zodra ECSS confluentie bereikten, loshaken en MEFs met 0,25% trypsine / EDTA zoals in stap 2.4, resuspendeer de cellen in vers IMDM transfer naar een niet-hechtende bacteriologische petrischaal en incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ° C, 5% CO _2.
2. Zorg dragen SER en MEF-bevattend medium in nieuw gelatine beklede platen met behulp van een 5 ml pipet vermijden herhaald pipetteren. De cellen die nog in de petrischaaltjes zijn MEF, omdat SER niet voldoen.
3. Passage de SER om de 3-4 dagen. Minder vaak passage kan ESC pluripotentie verminderen. Neem niet meer dan 60% samenvloeiing, want het onderscheid kan worden bevoordeeld.
4. Herhaal stap 3,2-3,3 drie keer of meer, indien nodig, totdat MEF's niet meer aantoonbaar door een celcultuur microscoop, met behulp van een 20X objectief, om ervoor te zorgen MEF niet aanwezig zijn.
5. Controleer ESC pluripotentie door het controleren van ESCkweek of de cellen gevormd dichte kolonies met typische ESC polygonale morfologie (figuur 1A). Testcel stemness door kwantitatieve reverse transcriptase polymerase kettingreactie (qRT-PCR) ^{17, 17} immunoblotting of immunofluorescentie van de kern pluripotentie transcriptiefactoren ¹⁷ (figuur 2).

4. EB Formation

1. Bereid all-trans-RA voorraadoplossing van 10 mM in DMSO en aliquot in 1,5 ml microfuge-licht beschermd buizen. De oplossing is stabiel bij -80 ° C gedurende maximaal twee weken. Beschermen tegen licht.
2. Trypsinize SER zoals in stap 2.4; replate in vers IMDM zonder LIF als een eencellige suspensie.
3. Aantal cellen met behulp van een hemocytometer, en stelt een 5 x 10 ⁵ cellen / ml suspensie in IMDM met 0,5 uM RA.
4. Plaat 100 20-pl-druppels per 100 mm petrischaal met een 8-kanaals pipet en 200 pi tips, invertde gerechten, en vul de omgekeerde deksel met PBS tot opknoping vallen van uitdroging te voorkomen. Protect-RA met cultuur media tegen licht.
5. Cultuur EBS in hangende druppels bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende 4 dagen.

5. 2D EB Cultuur

1. Coat 12 mm ronde glazen dekglaasjes met 30 ug / ml fibronectine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Plaats elke dekglaasje in een putje van een 24-wells plaat en voeg 1 ml IMDM per putje.
2. Oogst 3 dagen gekweekt opknoping druppel EB's een voor een met 200 pi pipetpunten en zaden ze op met fibronectine gecoate dekglaasjes, 20 EBS per putje, met dezelfde pipetpunten.
   LET OP: 3-daagse EBS zijn de voorkeur boven 4-daagse EBS, omdat ze beter om de dekglaasjes hechten.
3. Doorgaan cultuur met IMDM-15% FBS zonder LIF. Vervang medium om de 3-4 dagen. Verzamel de gebruikte medium voor eiwituitscheiding analyse nodig.

6. Detectie van Uitgescheiden Proteïnes

1. Overdracht 500 pi van EB medium tot 10 kDa cutoff centrifugale filters spinnen bij 20.000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C.
2. Onderzoek de overige in de centrifugale filters elke 15-20 min om overdadige verrijking te voorkomen dat medium. Centrifugeren stopt wanneer het volume van het resterende medium is gedaald tot 25 pl.
3. Verzamel de resterende geconcentreerde medium na het omkeren van het filter en centrifugeren bij 160 x g bij 4 ° C, volgens de instructies van de fabrikant.
4. Detecteren de uitgescheiden eiwitten door immunoblotting met antilichamen ^17.

7. 3D EB Cultuur

1. Verzamel de EBS 4 dagen gekweekt in opknoping druppels zoals beschreven in stap 5.2 en plaats ze in 1,5 ml centrifugebuizen (30 EB per buis).
2. Bereid collageen gel oplossing volgens de instructies van de 3D collageen cultuur kit (zie ook Materiaal / Equipment Table). Verdunde geschikte volumes collageenoplossing en 5x DMEM (kit component); voeg de neutralization oplossing (een kit component) en meng goed onmiddellijk en bewaar op ijs.
3. Pipet een geschikt volume van gekoelde collageenoplossing in de buis 1,5 ml bevattende de EBS, en voorzichtig te dragen aan de putjes van een 6-wells plaat met een 1 ml pipet tip. Vermijd het maken van bubbels.
4. Geeft de plaat over te brengen naar 37 ° C, 5% _CO2, gedurende 60 min collageen polymerisatie te initiëren.
5. Overlay de EB-bevattende plaat met IMDM.
6. Veranderen medium elke 3-4 dagen.

8. EB Dissociatie

1. Verzamel de dag 4 EBS (van stap 4) één voor één, met 200 pi pipetpunten en overbrengen naar een niet-hechtende bacteriologische petrischaal met IMDM met 15% FBS; kweken bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende nog 4 dagen. Controleer de EBS twee keer per dag om ervoor te zorgen dat ze niet hechten aan de bodem; schud de schotel EB bevestiging aan de bodem te voorkomen.
2. Centrifugeer de EB bij 185 xg gedurende 5 minuten bijRT in een benchtop centrifuge.
3. Verwijder het supernatants. De pellet mag niet meer dan 100 pl in elke buis.
4. Naar gepelleteerde EBS 1 ml 0,25% Type I collagenase per buis, aangevuld met 20% FBS in PBS.
5. Incubeer de EB-collagenase mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% _CO2, het voorzichtig pipetteren elke 20 minuten, onder toepassing van 1 ml pipet tips.
6. Was de cellen voorzichtig 3x met PBS. Als cel aggregaten aanwezig zijn, gebruikt een cel zeef met een 100 urn gaas te verwijderen.
7. Replate de cellen op een met gelatine beklede 60 mm schalen in IMDM. Incubeer daarna bij 37 ° C, 5% _CO2.

9. Transfectie van Gescheiden EBS

1. Voor qRT-PCR en immunoblotting, laag een 6-wells plaat met 0,5% gelatine.
2. Voor immunofluorescentie, laag dekglaasjes met 30 ug / ml fibronectine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Plaats elke dekglaasje in een putje van een 24-well plaat. IMDM toevoegen.
3. Seed 4.75 x 10 ⁵ of 1 x 10 ⁵ EB gedissocieerde cellen (stappen 8,4-8,7) per putje in 6 of 24 putjes, respectievelijk.
4. Groeien de cellen tot 70% confluentie voor transfectie.
5. Transfecteren cellen door een liposomale lipide stamcel optimaal reagens ¹⁷ (zie Materialen / Apparatuur Table), volgens de instructies van de fabrikant.
   NB: Het reagens we gebruikten typisch een transfectie-efficiëntie van 50% bereikt (zie Representatieve resultaten).
6. Analyseer de monsters met qRT-PCR of door immunoblotting ¹⁷ 2 of 3 dagen na transfectie, respectievelijk.

10. Analyse van EB Differentiatie Immunofluorescentie

1. Wassen EBS 2D of 3D gedissocieerd EBS met PBS en bevestig met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen 3x met PBS te verwijderen zwevende celresten.
   OPMERKING: Paraformaldehyde is een huid- en oogirritatie; gebruik voorzichtigheid bij het hanteren van het.
2. Voeg 1% Triton X-100 in PBS aan de cellen voor 20 minuten permeabilize bij KT, daarna wassen 3x met PBS.
3. Verwijder PBS en geblokkeerd met 5% BSA in PBS gedurende 30 min.
4. Bereid primaire antilichaam verdunning in 1% BSA / PBS aangevuld met 0,03% Triton X-100. Vervang de blokkerende oplossing door de primaire antilichaamoplossing. Incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C, daarna wassen cellen 3x met PBS.
5. Breng secundair antilichaam in PBS volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, daarna wassen cellen 3x met PBS.
6. Mount dekglaasjes op glasplaatjes met een anti-fade medium voor optische microscopie.

Resultaten

Oct4, Nanog, en SOX2 de kern transcriptiefactoren die ESC zelfvernieuwing en pluripotentie verlenen. We pasten bovenstaande protocol bij de neurale differentiatie van SER vergelijken van wild type en van een stam van genetisch gemodificeerde muizen waarbij Syx, een gen dat codeert voor het RhoA specifieke exchange factor Syx wordt verstoord. We hadden Syx betrokken bij angiogenese ^18. Wij merkten verschillen in het gedrag van EBS geaggregeerde van Syx...

Discussie

In dit protocol presenteren we een betrekkelijk eenvoudige en toegankelijke wijze neurale differentiatie van muis SER bestuderen. In eerdere protocollen werd RA toegevoegd aan het medium op dag 2 en dag 4 van de EB hangende-druppel ⁸ of suspensiecultuur ^7, respectievelijk, of onmiddellijk na de EB opknoping druppel ²¹ aggregatie. In het protocol we bedacht, werd RA eerder toegevoegd. Ondanks de eerdere invoering van RA EBS gevormd door suspensiekwee...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materialen
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Celcultuurschaal (60 mm)	Eppendorf	30701119	Celcultuur
Celcultuurschaal (100 mm)	Falcon	353003	Celcultuur
Petrischaal (100 mm)	Corning	351029	Hangende druppels
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfectie
Donkere 1,5 mL centrifugeerbuis	Celltreat Scientific Products	229437	RA stockoplossing
Microscoopdekglas	Fisherbrand	12-545-80	Circulair, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscoopglazen	Fisherbrand	12-550-15
3D collageencultuurkit	EMD Millipore	ECM675	3D cultuur
Effectene Transfectie Reagens	Qiagen	301427	Stamcellen transfectie
Microcon Centrifugeerfilters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Eiwitconcentratie
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs cultuur
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs cultuur
Fetaal bovien serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs cultuur
Gelatine	Sigma-Aldrich	G2625	Schotelcoating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	Om ESC pluripotentie te behouden
MEM Niet-Essentiële Aminozuren Oplossingen	Gibco	11140050	Celcultuur
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Celcultuur
Penicilline-Streptomycine	Gibco	15140122	Celcultuur
Gentamicine	Gibco	15750060	Celcultuur
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Celcultuur
0,25% Trypsine-EDTA	Gibco	25200-072	Celcultuur
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoïnezuur	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Inductie van neurale differentiatie
Bovien Serum Albumine	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blokking en antilichaamverdunning
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Celmembraanpermeabilisatie
Celzeef	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagens met DAPI	Life Tech.	P36931	Montage reagens
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Celfixatie
Fibronectine	R&D Systems	1030-FN	Schotelcoating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociatie
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Primaire Antilichamen
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detectie van neurale differentiatie
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detectie van neurale differentiatie
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detectie van neurale differentiatie
Sox2	Cell Signaling	3579	Detectie van neurale differentiatie
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detectie van neurale differentiatie
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Secundaire Antilichamen
Donkey anti-Muis-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-muis-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Instrumenten
Wide-field microscoop	Nikon	Eclipse TS100	Celcultuur beeldvorming
Confocale microscoop	Nikon	C2	Immunofluorescence beeldvorming