Hier geven we een stap-voor-stap protocol van de lange lengte elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) methode. Dit is een nieuwe methode die het mogelijk maakt voor het eerst kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamidering isovormen door shotgun proteomics.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Karakterisatie van eiwitdeamiderende is noodzakelijk om de rol (len) en de mogelijkheden van deze eiwitten posttranslationele modificatie (PTM) in humane pathologie en andere biochemische context ontcijferen. Ter karakterisering van eiwitten deamidatie voeren, hebben wij onlangs een nieuwe lange-length elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) werkwijze die het glutamine (Gln) en asparagine (Asn) isovorm kan scheiden producten van de deamidatie van modelverbindingen zeer complexe biologische monsters. LERLIC-MS / MS is dus de eerste shotgun proteomics strategie voor de scheiding en kwantificering van Gin deamidatie isovormen. We tonen ook als noviteit, dat het monster verwerkingsprotocol geschetste stabiliseert het succinimide tussenliggende waardoor de karakterisering van LERLIC-MS / MS. Toepassing van LERLIC-MS / MS zoals weergegeven in deze video artikel kan u helpen om op te helderen de op dat moment onbekenden moleculaire arrays van eiwit deamidatie. Bovendien LERLIC-MS / MS verschaft verder inzicht in de enzymatische reacties die deamidatie bij onderscheiden biologische achtergronden omvatten.
Inleiding
Deamidering is een proteïne posttranslationele modificatie (PTM) dat een negatieve lading aan het eiwit skelet geïntroduceerd door middel van modificatie van asparagine (Asn) en / of glutamine (Gln) resten 1. Deze modificatie terwijl beïnvloeden Asn residuen genereert de isomere producten isoaspartaamzuur (isoAsp) en n -aspartic acid (Asp) bij een gemeenschappelijke 3: 1 verhouding 2. Ondanks deze verhouding kan worden gewijzigd door tussenkomst van de reparerende enzym L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4. Evenzo deamidering van Gln residuen gen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Verpakking de lange lengte Anion exchange (LAX) Capillaire kolom
(Noot: Hoewel de LAX kolom kan in-huis verpakt als we in dit protocol beschrijven LOS kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar, zie tabel van Materialen en Reagentia voor verdere details).
- Suspendeer 50 mg zwakke anionenuitwisselende pakkingsmateriaal in 3,5 ml verpakking buffer (tabel 1) aan de slurrie te bereiden.
- Monteer het uiteinde van de capillaire kolom (50 cm lengte - 200 urn inwendige diameter (ID) slang) met een vrouwelijk naar vrouwelijke koppeling, een plak en een moer. Plaats een scherm 1/16" O....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deamidatie of Gin en Asn residu wordt beschouwd als een degeneratieve eiwitmodificatie (DPM) betrokken bij een aantal chronische en dodelijke ziekten 14. Is aangetoond dat dit PTM de halfwaardetijd en afbrekende toestanden van antilichamen en andere moleculen kunnen voorspellen in het menselijk lichaam en soortgelijke biologische backgrounds 1, 15. De betekenis van eiwitdeamiderende, in feite, gaat verder .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze video-artikel geven we een stap-voor-stap protocol van LERLIC-MS / MS 3, een werkwijze om diepgaande karakterisering voeren en nauwkeurig de mate van proteïne deamidering en enzymatische processen dit eiwitmodificatie. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op het gebruik van een lange lengte (50 cm) LOS volgens het elektrostatische repulsie-hilic (Erlić) 27. Het gebruik van een lange-kolomlengte, zoals in onze studie 3, maximaliseert het potentieel va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Singapore ministerie van Onderwijs (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council van Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) en NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). We willen graag onze dankbaarheid en meest oprechte dank aan Dr. Andrew Alpert en PolyLC team uit te drukken voor vriendelijk voorzag ons van het verpakkingsmateriaal dat mogelijk deze studie gemaakt.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science onder Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting voor 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut voor microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC-systeem | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock buizen | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Roestvrijstalen kralen. 0,9 – 2,0 mm. 1 lb. Niet-steriel. | Next Advance | SSB14B | |
| Centrifuge op tafel | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standaard digitaal verwarmd circuerend bad, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 ontzoutingscartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite massaspectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade gemodificeerd trypsine | Promega | V5111 | |
| Protease-remmercocktailtabletten | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Fosfaatbufferoplossing 10x (verdund tot 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammoniumacetaat | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Natriumdeoxycholaat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Forminezuur | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammoniakhydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitril HPLC-kwaliteit | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC-kwaliteit | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC-kwaliteit | Sigma-Aldrich | 14263 |
Referenties
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
