LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Summary

Hier geven we een stap-voor-stap protocol van de lange lengte elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) methode. Dit is een nieuwe methode die het mogelijk maakt voor het eerst kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamidering isovormen door shotgun proteomics.

Abstract

Karakterisatie van eiwitdeamiderende is noodzakelijk om de rol (len) en de mogelijkheden van deze eiwitten posttranslationele modificatie (PTM) in humane pathologie en andere biochemische context ontcijferen. Ter karakterisering van eiwitten deamidatie voeren, hebben wij onlangs een nieuwe lange-length elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) werkwijze die het glutamine (Gln) en asparagine (Asn) isovorm kan scheiden producten van de deamidatie van modelverbindingen zeer complexe biologische monsters. LERLIC-MS / MS is dus de eerste shotgun proteomics strategie voor de scheiding en kwantificering van Gin deamidatie isovormen. We tonen ook als noviteit, dat het monster verwerkingsprotocol geschetste stabiliseert het succinimide tussenliggende waardoor de karakterisering van LERLIC-MS / MS. Toepassing van LERLIC-MS / MS zoals weergegeven in deze video artikel kan u helpen om op te helderen de op dat moment onbekenden moleculaire arrays van eiwit deamidatie. Bovendien LERLIC-MS / MS verschaft verder inzicht in de enzymatische reacties die deamidatie bij onderscheiden biologische achtergronden omvatten.

Introduction

Deamidering is een proteïne posttranslationele modificatie (PTM) dat een negatieve lading aan het eiwit skelet geïntroduceerd door middel van modificatie van asparagine (Asn) en / of glutamine (Gln) resten ^1. Deze modificatie terwijl beïnvloeden Asn residuen genereert de isomere producten isoaspartaamzuur (isoAsp) en n -aspartic acid (Asp) bij een gemeenschappelijke 3: 1 verhouding ^2. Ondanks deze verhouding kan worden gewijzigd door tussenkomst van de reparerende enzym L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) ^{3, 4.} Evenzo deamidering van Gln residuen genereert isomere gamma-glutaminezuur (γ-Glu) en alfa-glutaminezuur isovormen (α-Glu) en een verwachte 1: 7 verhouding van ^{3, 5,} doch deze verhouding kan worden geschoven door de werking van de alomtegenwoordige enzym transglutaminase 2 en andere transglutaminasen, zoals transglutaminase 1, enzyme onlangs geïdentificeerd als geassocieerd met extracellulaire blaasjes in de hersenen ^6.

De oorsprong van deamidatie kan hetzij spontaan of enzymatisch worden, de eerste is vooral gebruikelijk op Gin residuen waarin transglutaminasen en andere enzymen mediëren inter / intramoleculaire verknoping via transamideringsprodukt (zie ³ voor meer details over Gin transamideringsprodukt en de implicaties verschillende chronische en dodelijke ziekten bij de mens). Daarom, deamidering is een doorvoermechanisme die een cruciale weerslag op de structuur en functie van de betrokken moleculen ^{4, 7, 8} heeft en vereist een uitgebreide chemische karakterisering ³ in het licht van de diverse biochemische gevolgen inbegrip van de service moleculaire klok van veroudering ⁹ .

Hoewel deamidering Asn residuen is relatief goed gekenmerkt door bottom-up shotgun proteomics ^{1, 10,} deamidatie of Gln-residuen nog steeds geen geschikte karakteriseringsmethode buiten de uitdagende analyse van modelverbindingen door elektronen radicaal fragmentatie ^11. We hebben onlangs een nieuwe één dimensie shotgun proteomics strategie (LERLIC-MS / MS) ³ die gescheiden Gin en Asn deamidering isovormen uit complexe biologische monsters en modelverbindingen maakt in een enkele analyse. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op de scheiding van de tryptische peptiden gedigesteerd met behulp van een lange lengte (50 cm) ionenuitwisselingskolom (LAX) aan elektrostatische afstoting-hilic (Erlić) stand en gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC MS / MS). Deze nieuwe analytische strategie is toegepast voor het karakteriseren en kwantificeren betrekkelijk de omvang van elk gedeamideerd residuen in humane hersenweefselsf "> 3. Niettemin zal de hier geschetste protocol videobeelden van LERLIC-MS / MS doel de eigenaardigheden van eiwitdeamiderende bestuderen de biochemische context van belang.

ETHISCHE UITSPRAAK

Alle procedures van dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Nanyang Technological University in Singapore en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.

Protocol

1. Verpakking de lange lengte Anion exchange (LAX) Capillaire kolom

(Noot: Hoewel de LAX kolom kan in-huis verpakt als we in dit protocol beschrijven LOS kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar, zie tabel van Materialen en Reagentia voor verdere details).

1. Suspendeer 50 mg zwakke anionenuitwisselende pakkingsmateriaal in 3,5 ml verpakking buffer (tabel 1) aan de slurrie te bereiden.
2. Monteer het uiteinde van de capillaire kolom (50 cm lengte - 200 urn inwendige diameter (ID) slang) met een vrouwelijk naar vrouwelijke koppeling, een plak en een moer. Plaats een scherm 1/16" OD van 1 micron poriegrootte in het vrouwelijk naar vrouwelijke koppeling (NB:. Het scherm hier gebruikt moet kleiner poriëngrootte dan de deeltjesgrootte van het verpakkingsmateriaal om lekkage van het materiaal te voorkomen hebben de kolom).
3. Verpak de capillair met een slurrie onder een druk pomp bedreven bij 4.500 psi. (Let op: Verpak de Column totdat het verpakkingsmateriaal zichtbaar aan de ingang van de kolom).
4. Monteer het andere uiteinde van de capillaire kolom zoals beschreven in punt 1.2.

2. Monstervoorbereiding

Dit protocol beschrijft de toepassing van LERLIC-MS / MS menselijke hersenweefsels als model proteoom analyse. (Opmerking: Als ander weefsel of proteomische samples, dient de monsterbereidingsprocedures worden aangepast.)

1. Weefsel homogenisatie:
   een. Wassen hersenweefsels (50-100 mg) met 1x fosfaatbufferoplossing gedurende vijf minuten driemaal.
   b. Homogeniseren het weefsel 1: 1: 2,5 tissue / metallic kralen / SDC homogenisatiebuffer (Tabel 2) verhouding (w / w / v) gedurende 5 min bij 4 ° C in veiligheidskapjes buizen bij maximale intensiteit met een tissue homogenisator. (Noot: SDC homogenisatiebuffer kan proteaseremmers omvatten zoals hiervoor in ³ aangegeven)
   c. Centrifugeer de weefselhomogenaat, fro verkregenm de vorige stap, bij 10.000 x g, 4 ° C gedurende 10 minuten en verzamel de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis.
   d. Herhaal stap bc voor de resterende pellets en combineer de supernatanten zo vaak als nodig totdat er geen korrel wordt waargenomen. (Let op: Als u de stappen bc meer dan twee keer te herhalen, beweegt het monster en de kralen aan een nieuwe safe-lock buis om het verlies van het monster tijdens de centrifugatiestap te voorkomen).
   e. Kwantificeren van de eiwitconcentratie van de verkregen homogenaten door bicinchoninezuurbepaling (BCA) ^12.
2. Natrium deoxycholaat (SDC) bijgestane in oplossing tryptische digestie ¹³ van hersenhomogenaten.
   een. Voeg een eindconcentratie van 10 mM dithiothreïtol (DTT) (met de voorraadoplossing die in oplossing 5 van tabel 3) het verkregen homogenaat aan de vermindering van proteïne disulfidebindingen initiëren.
   b. Incubeer het homogenaat gedurende 30 min in een badvooraf ingesteld op 60 ° C.
   c. Toevoegen homogenaat een eindconcentratie van 20 mM joodacetamide (IAA) met de voorraadoplossing die in Oplossing 7 van tabel 4.
   d. Incubeer het homogenaat met IAA bij kamertemperatuur in het donker gedurende 45 min.
   e. Verdun het hersenhomogenaat twee vouwen behulp verdunningsbuffer (Oplossing 6 van tabel 3).
   f. Incubeer het monster voor de tweede reductietrap gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
   g. Add sequencing-grade modified trypsin opgelost in Oplossing 2 van tabel 2 aan eiwit tot enzym verhouding van 1:50 (w / w).
   h. Digereer het homogenaat met trypsine door overnacht incubatie bij 30 ° C.
   ik. Schrik de enzymatische digestie op de volgende dag door toevoeging van 0,5% eindconcentratie mierenzuur (FA). (NB: Toevoeging van FA wordt precipitatie van de zouten SDC onder zure condities leiden.)
   j. Voorzichtig vortex de monsters die SDC precipiLIDSTATEN.
   k. Pellet door het SDC zouten door centrifugeren van de monsters bij 12.000 x g, 4 ° C gedurende 10 min.
   l. Verzamel de bovenstaande vloeistof en breng de oplossing op een schone nieuwe buis. (Let op: Zorg ervoor dat tijdens het pipetteren van deze stap om niet opnieuw op te schorten en / of het verzamelen van zouten uit de SDC pellet.)
   m. Opnieuw oplossen SDC SDC pellet opnieuw oplossende buffer (tabel 5) onder krachtig vortexen gedurende 1 minuut.
   n. Herhaal stap JL tweemaal neergeslagen peptiden herstellen en combineren de bovenstaande vloeistoffen. (NB:. Zie Serra et al 2016 ¹³ voor meer informatie over de SDC ondersteunde in oplossing tryptische digestie protocol hier aangepast.)
3. Ontzouten van tryptische gedigereerde monsters.
   een. Voeren ontzouten van gedigereerde monsters met behulp van een 1 g C-18 patroon. (Opmerking: het gebruik van een groot volume cassette (5 ml) onafhankelijk van de hoeveelheid eiwit verkregen garanties goede reiniging overgebleven SDC zouten in de monsters voorafgaandeLC-MS / MS injectie).
   b. Voeren conditionering van de 1g C-18 cassette met 5 ml acetonitril (ACN).
   c. Passeren 5 ml sanering buffer (Tabel 6) van het geconditioneerde 1g C-18 cartridge om eventueel achtergebleven organisch oplosmiddel te verwijderen.
   d. Laad het monster op de 1g C-18 patroon.
   e. Voeren 3-5 sanering stappen om het monster in de 1g C-18 kolom met 5 ml buffer sanering elke stap.
   f. Elueer het ontzout peptiden uit de 1g C18 cartridge via 5 ml elutiebuffer (Tabel 7).
   g. Droog de geëlueerde peptiden in een vacuümconcentrator.
   c. Reconstitueer het gedroogde monster in een eindvolume van 200 pl elutiebuffer. (NB:. Gebruik krachtige en lange (> 10 min) vortexen, gevolgd door daaropvolgende sonicatie in een bad sonicatie gedurende 30 minuten volledig resuspenderen van de gedroogde peptiden in injectiebuffer)
   d. Pas het injectievolume van het monster voor LERLIC-MS / MS analyseren tussen 1-3 ug eiwit.

3. Eén-dimensionale LERLIC-MS / MS Scheiding

1. Vloeistofchromatografie voorwaarden:
   Mobiele fasen:
   A: 0,1% FA in water (tabel 8).
   B: 0,1% FA in ACN (tabel 9)
   Stroomsnelheid: 0,4 pL / min
   Kolom: LAX capillaire kolom (50 cm lengte - 200 um ID)
   een. Gebruik de volgende 1.200 min-gradiënt: 95% B gedurende 40 min, 95-85% B gedurende 434 min, 85-70% B gedurende 522 min, 70-35% B gedurende 124 min, 35-3% B gedurende 45 min , isocratisch 3% B gedurende 5 min, 3-95% B in 7 min en bewaard isocratisch bij 95% B gedurende 23 min.
   b. Voeren scheiding van peptiden via de LAX capillaire zoals in Serra en Gallart-Palau et al. ³ met behulp van ultra-hoge druk vloeistofchromatografie.
2. Mass spectrometer configuratie:
   een. Configureren scan gebeurtenisdetails aan gegevensverwerving alternerende betwe voerenen full Fourier-transformatie-massaspectrometrie (FT-MS) en Fourier transformatie-tandem massaspectrometrie (FT-MS / MS) met de volgende parameters:
   a.1. Data acquisitie-modus: positief
   a.2 FT-MS parameters:
   Massagebied: 350 - 2.000 m / z
   Resolutie: 60.000
   Microscans: 1 per spectrum
   Automatische versterkingsregeling: 1 x 10 ⁶
   a.3 FT-MS / MS-parameters:
   Fragmentatie-modus: Hoog-energetische botsingen dissociatie (HCD)
   a.4 massagebied: 150 - 2.000 m / z
   A.5 Resolutie: 30.000
   a.6 Top N ionen: 10
   Microscans: 1 per spectrum
   Laadtoestand:> 2+
   Isolatie breedte: 2 Da
   A.7 Automatische versterkingsregeling: 1 x 10 ⁶
   b. Uitvoeren van massaspectrometrie detecteren van peptiden zoals aangegeven in ³ via een orbitrap massaspectrometer uitgerust met een nanoelectrospray ionenbron die bij 1,5 kV.

4. Data Analysis

1. Voer protein databankonderzoek de LERLIC-MS / MS gegevens verkregen met de volgende parameters behulp van een specifiek proteomics software: (Opmerking: Zie ³ voor meer details).
   een. Ion tolerantie: 10 ppm
   b. Fragmentionen tolerantie: 0,05 Da
   c. False Discovery Rate (FDR): 1%
   d. Database: UniProt menselijke database
   e. Vaste modificaties: Carbamydomethylation bij Cys
   f. Variabele modificaties (indien vereist door de software): Oxidatie (Met), Deamidatie (Asn en Gln).
2. Zekere karakterisering en kwantificering van gedeamideerd isomere produkten LERLIC-MS / MS gegevens:
   een. Export databank zoekresultaten van LERLIC-MS / MS om een ​​spreedsheet software voor analyse.
   b. Zoek en pak de hele lijst van gedeamideerd peptiden en hun niet-deamidated tegenhangers.
   c. Met de lijst van de verkregen peptiden als referentie, extraheer het ion chromatogrammen (XICs) van deze peptiden via een bestemde software bij 5 dpm massatolerantie. (Notitie:Zie ³ voor meer informatie over de software die wordt gebruikt voor de winning van XICs.)
   d. Inspecteer de verkregen XICs de gescheiden dubbele piek elutie van de isomere producten te identificeren aangegeven ^3. (Opmerking: Isomere producten van die peptiden die bij MS / MS niveau kan gemakkelijk gevonden worden geleid door de aanwezigheid van twee verschillende retentietijden in het zoekresultaatdatabase.)
   e. Relatieve kwantificatie van de isomere producten uit elke gedeamideerd site / peptide moet worden uitgevoerd op basis van het piekgebied van elk element isomeer verkregen XICs.

Results

Deamidatie of Gin en Asn residu wordt beschouwd als een degeneratieve eiwitmodificatie (DPM) betrokken bij een aantal chronische en dodelijke ziekten ^14. Is aangetoond dat dit PTM de halfwaardetijd en afbrekende toestanden van antilichamen en andere moleculen kunnen voorspellen in het menselijk lichaam en soortgelijke biologische backgrounds ^{1, 15.} De betekenis van eiwitdeamiderende, in feite, gaat verder ...

Discussion

In deze video-artikel geven we een stap-voor-stap protocol van LERLIC-MS / MS ^3, een werkwijze om diepgaande karakterisering voeren en nauwkeurig de mate van proteïne deamidering en enzymatische processen dit eiwitmodificatie. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op het gebruik van een lange lengte (50 cm) LOS volgens het elektrostatische repulsie-hilic (Erlić) ^27. Het gebruik van een lange-kolomlengte, zoals in onze studie ^3, maximaliseert het potentieel va...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material)	PolyLC Inc.	Special order
Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID	PolyLC Inc.	Special order
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length	SGE Analytical Science onder Trajan Scientific Australia	620050
Female-to-female fitting voor 1/16" OD tubbing	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Female nut voor microferule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Pressure Bomb NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC-systeem	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Safe-lock buizen	Eppendorf	T9661-1000EA
Roestvrijstalen kralen. 0,9 – 2,0 mm. 1 lb. Niet-steriel.	Next Advance	SSB14B
Centrifuge op tafel	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Standaard digitaal verwarmd circuerend bad, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 ontzoutingscartridge 50 mg	Waters	WAT020805
Vacuum concentrator	Eppendorf	Concentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite massaspectrometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	TCSI-SS2
Incubator INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
Sequencing-grade gemodificeerd trypsine	Promega	V5111
Protease-remmercocktailtabletten	Roche	11836170001 (ROCHE)
Fosfaatbufferoplossing 10x (verdund tot 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Ammoniumacetaat	Sigma-Aldrich	A1542
Natriumdeoxycholaat	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	i6125
Forminezuur	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Ammoniakhydroxide	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitril HPLC-kwaliteit	Sigma-Aldrich	675415
Isopropanol HPLC-kwaliteit	Sigma-Aldrich	675431
Water HPLC-kwaliteit	Sigma-Aldrich	14263