LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Summary

Hier geven we een stap-voor-stap protocol van de lange lengte elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) methode. Dit is een nieuwe methode die het mogelijk maakt voor het eerst kwantificering en karakterisering van glutamine en asparagine deamidering isovormen door shotgun proteomics.

Abstract

Karakterisatie van eiwitdeamiderende is noodzakelijk om de rol (len) en de mogelijkheden van deze eiwitten posttranslationele modificatie (PTM) in humane pathologie en andere biochemische context ontcijferen. Ter karakterisering van eiwitten deamidatie voeren, hebben wij onlangs een nieuwe lange-length elektrostatische repulsie-hilic-tandem massaspectrometrie (LERLIC-MS / MS) werkwijze die het glutamine (Gln) en asparagine (Asn) isovorm kan scheiden producten van de deamidatie van modelverbindingen zeer complexe biologische monsters. LERLIC-MS / MS is dus de eerste shotgun proteomics strategie voor de scheiding en kwantificering van Gin deamidatie isovormen. We tonen ook als noviteit, dat het monster verwerkingsprotocol geschetste stabiliseert het succinimide tussenliggende waardoor de karakterisering van LERLIC-MS / MS. Toepassing van LERLIC-MS / MS zoals weergegeven in deze video artikel kan u helpen om op te helderen de op dat moment onbekenden moleculaire arrays van eiwit deamidatie. Bovendien LERLIC-MS / MS verschaft verder inzicht in de enzymatische reacties die deamidatie bij onderscheiden biologische achtergronden omvatten.

Introduction

Deamidering is een proteïne posttranslationele modificatie (PTM) dat een negatieve lading aan het eiwit skelet geïntroduceerd door middel van modificatie van asparagine (Asn) en / of glutamine (Gln) resten ^1. Deze modificatie terwijl beïnvloeden Asn residuen genereert de isomere producten isoaspartaamzuur (isoAsp) en n -aspartic acid (Asp) bij een gemeenschappelijke 3: 1 verhouding ^2. Ondanks deze verhouding kan worden gewijzigd door tussenkomst van de reparerende enzym L-isoaspartyl methyltransferase (PIMT) ^{3, 4.} Evenzo deamidering van Gln residuen gen....

Protocol

1. Verpakking de lange lengte Anion exchange (LAX) Capillaire kolom

(Noot: Hoewel de LAX kolom kan in-huis verpakt als we in dit protocol beschrijven LOS kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar, zie tabel van Materialen en Reagentia voor verdere details).

1. Suspendeer 50 mg zwakke anionenuitwisselende pakkingsmateriaal in 3,5 ml verpakking buffer (tabel 1) aan de slurrie te bereiden.
2. Monteer het uiteinde van de capillaire kolom (50 cm lengte - 200 urn inwendige diameter (ID) slang) met een vrouwelijk naar vrouwelijke koppeling, een plak en een moer. Plaats een scherm 1/16" O....

Results

Deamidatie of Gin en Asn residu wordt beschouwd als een degeneratieve eiwitmodificatie (DPM) betrokken bij een aantal chronische en dodelijke ziekten ^14. Is aangetoond dat dit PTM de halfwaardetijd en afbrekende toestanden van antilichamen en andere moleculen kunnen voorspellen in het menselijk lichaam en soortgelijke biologische backgrounds ^{1, 15.} De betekenis van eiwitdeamiderende, in feite, gaat verder .......

Discussion

In deze video-artikel geven we een stap-voor-stap protocol van LERLIC-MS / MS ^3, een werkwijze om diepgaande karakterisering voeren en nauwkeurig de mate van proteïne deamidering en enzymatische processen dit eiwitmodificatie. LERLIC-MS / MS is gebaseerd op het gebruik van een lange lengte (50 cm) LOS volgens het elektrostatische repulsie-hilic (Erlić) ^27. Het gebruik van een lange-kolomlengte, zoals in onze studie ^3, maximaliseert het potentieel va.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material)	PolyLC Inc.	Special order
Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID	PolyLC Inc.	Special order
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length	SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia	620050
Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Female nut for microferule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Pressure Bomb NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC system	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Safe-lock tubes	Eppendorf	T9661-1000EA
Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile.	Next Advance	SSB14B
Table-top centrifuge	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg	Waters	WAT020805
Vacumm concentrator	Eppendorf	Concentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	TCSI-SS2
Incubator INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
Sequencing-grade modified trypsin	Promega	V5111
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11836170001 (ROCHE)
Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	i6125
Formic acid	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitrile HPLC grade	Sigma-Aldrich	675415
Isopropanol HPLC grade	Sigma-Aldrich	675431
Water HPLC grade	Sigma-Aldrich	14263