Een protocol wordt gepresenteerd voor de productie van tRNA (UUU) en de analyse van tRNA (UUU) in complex met het enzym TcdA door middel van agarose gel retardatie assays.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Wij tonen methoden voor de expressie en zuivering van tRNA (UUU) in Escherichia coli en de analyse door gel-retardatie assays van de binding van tRNA (UUU) tot TcdA, een N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehydratase, die de threonylcarbamoyl cycliseert Zijketen verbonden aan A37 in de anticodon stamlus (ASL) van tRNAs tot cyclische t 6 A (ct 6 A). Transcriptie van het synthetische gen dat codeert voor tRNA (UUU) wordt geïnduceerd in E. coli met 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en de cellen die tRNA bevatten worden 24 uur na inductie geoogst. De RNA fractie wordt gezuiverd met behulp van de methode voor extractie van zure fenolen. Zuiver tRNA wordt verkregen door middel van een gelfiltratiechromatografie die de kleinere tRNA-moleculen efficiënt scheidt van grotere intacte of gefragmenteerde nucleïnezuren. Om TcdA binding aan tRNA (UUU) te analyseren wordt TcdA gemengd met tRNA (UUU) en gescheiden op een native agarosegel bij 4 ° C.De vrije tRNA (UUU) migreert sneller, terwijl de TcdA-tRNA (UUU) complexen een mobiliteitsvertraging ondergaan die kan waargenomen worden bij het kleuren van de gel. We tonen aan dat TcdA een tRNA (UUU) bindend enzym is. Deze gel retardatie assay kan worden gebruikt om TcdA mutanten te bestuderen en de effecten van additieven en andere eiwitten op binding.
Inleiding
De gel retardatie assay 1 (ook bekend als elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay, EMSA) is een elektroforetische methode die is ontworpen om eiwit-nucleïnezuurinteracties te bestuderen en karakteriseren. Het laat de analyse van eiwit-DNA evenals eiwit-RNA-interacties en in het bijzonder interacties tussen tRNA en tRNA-bindende eiwitten toe, met behulp van ofwel gezuiverde componenten of complexe mengsels van eiwitten ( bijvoorbeeld cellysaten) of nucleïnezuren ( bijvoorbeeld tRNA zwembaden). We hebben gelretarderingsbepalingen toegepast op de studie van de interactie tussen gezuiverd tRNA (UUU) en TcdA, een N 6- threonylcarbamoyladenosine (t 6 A) dehydratase, die de threonylcarbamoylzijketen aan A37 in de anticodonstamloop (ASL) cycliseert. Van tRNA's tot cyclisch t6 (ct 6A) 2 , 3 . TcdA staat ook bekend als CsdL 3 ,F "> 4. Het tcdA / csdL- gen vormt een cluster met de csdA- en csdE- genen 5 , die het cysteïne-desulfurase en de zwavelacceptor van het cysteïne-sulfinase-desulfinaat (CSD) -systeem coderen en vereist is om TcdA-functie in vivo 3 te onderhouden.
De redenatie achter de gel retardatie assays is dat, terwijl vrije nucleïnezuurmoleculen snel op de voorkant van acrylamide of agarose gels migreren op grond van hun grote negatieve lading, wordt de elektroforetische mobiliteit van eiwitcomplexen van dezelfde nucleïnezuren dramatisch verminderd. De reductie van mobiliteit wordt weergegeven als een "shift" in de nucleïnezuur-eiwit complexen, die oplossen als discrete banden. Positief geladen en groter nucleïnezuur-eiwit complex laten een grotere verschuiving of vermindering van mobiliteit op een gel zien.
Sinds lading neutralisatie van het complex is een universeel fenomeenVoor eiwit-nucleïnezuur complexen kan de gel retardatie assay worden toegepast op een breed scala van complexen en nucleïnezuur typen. De methode is eenvoudig, goedkoop en kan uitgevoerd worden in laboratoria met minimale apparatuur. Het vereist slechts kleine hoeveelheden eiwitten en tRNA. Dit is een voordeel boven alternatieve biofysische technieken, die meestal grotere hoeveelheden monster verbruiken.
De gel retardatie assay is wijd gebruikt voor de studie van transcriptiefactoren. De analyse is gebruikt om bindende kinetiek, sterkte en specificiteit van transcriptiefactoren voor veel verschillende DNA-sequenties te analyseren. Het was inderdaad op dit gebied dat de EMSA voor het eerst 6 , 7 werd ontwikkeld. Gel retardatie assays met RNA 8 , 9 , 10 , 11 en tRNA moleculen zijn ook gebruikt bij ribosoom onderzoekEn analyseren, zoals we hier doen, de enzymen die tRNA nucleosiden na transcriptie wijzigen.
Veel verschillende parameters beïnvloeden het resultaat van een gel retardatie assay, zoals temperatuur, kwaliteit van het eiwit en tRNA monster, en de sterkte van de binding. Een zorgvuldige planning en uitvoering van het experiment is cruciaal voor de interpretatie van de resultaten van de vrije nucleïnezuur en eiwitgebonden soorten. Hier gebruikten we het synthetische gen dat codeert voor tRNA (UUU) gekloneerd in een expressievector waarvan de promotor de Shine-Dalgarno ribosoom bindingsplaats heeft, die leidt tot de synthese van grote hoeveelheden van de tRNA 2 . Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om een duidelijke gids voor het uitvoeren van tRNA gel retardatie experimenten te geven, terwijl gebruikelijke fouten voorkomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voorzichtigheid: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Verscheidene van de in dit protocol gebruikte chemicaliën zijn giftig en bijtend. Gebruik geschikte praktijken bij het uitvoeren van de extractie van tRNA met behulp van fenol, met inbegrip van het gebruik van een afzuigkap en persoonlijke beschermende uitrusting (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, broek met volledige lengte, gesloten-schoenen, enz .). Dit protocol gebruikt een niet-toxische nucleïnezuurvlek. Het gebruik van alternatieve vlekken kan extra voorzorgsmaatregelen en gespecialiseerde verwijdering van het kleurmiddel vereisen indien het giftig en / of kankerverwekkend is ( bv . Ethidiumbromide).
1. Bereiding van de agarosegel
- Weeg 2 g agarose en voeg het toe aan een glazen fles om een 2% w / v agarosegel te bereiden.
- Voeg 100 ml 1x tris-boraat-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (TBE) loopbuffer toe aan de agarose bevattende fles. Smelt door verwarming in een magnetron. Wissel met 30 seconden de inhoud om te mengenNou en herhaal deze stap tot de agarose volledig is opgelost. Laat de agarose oplossing afkoelen tot ongeveer 50-60 ° C.
- Tape de open randen van een gelbak om een mal te vormen, plaats een passende kam om de putjes te maken en de gesmolten agarose erin te plaatsen. Vermijd belvorming en laat het stollen bij kamertemperatuur.
- Zodra het is gelast, plaats de gelbak in een elektroforese-eenheid en vul het met TBE-buffer tot de gel volledig bedekt is.
2. Bereiding van het tRNA
- Express tRNA (UUU) in E. coli
- In de ochtend gebruik een flesje bevroren E. coli BL21 (DE3) getransformeerd met de expressievector pET23d-EcUUU 2 (heeft het gen dat codeert voor E. coli tRNA (UUU)), om een Luria Broth (LB) Plaat aangevuld met 100 μg / ml ampicilline. Omkeer de plaat en plaats deze in een 37 ° C incubator totdat colonies verschijnen (late afternoon).
- Gee één goedgroeide, enkele kolonie in 5 ml LB plus 100 μg / ml ampicilline in en groei overnacht bij 220 rpm bij 37 ° C.
- De volgende morgen pellet de cellen (6.500 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C), vervang medium met 5 ml verse LB plus 100 μg / ml ampicilline en resuspendeer. Gebruik deze suspensie om 200 ml LB plus 100 μg / ml ampicilline te inoculeren. Groei gedurende 5 uur bij 220 rpm bij 37 ° C.
- Wanneer de optische dichtheid van de cultuur bij 590 nm (OD 590 ) 0,6 tot 0,8 heeft bereikt, voeg 1 mM IPTG toe aan de kweek om de expressie van het tRNA (UUU) gen te activeren. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur.
- Oog de cellen op door de cultuur te centrifugeren bij 6.500 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Lysis en extractie
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml lysisbuffer (0,3 M natriumacetaat, 10 mM EDTA). Vanaf dit punt gebruikt u geautoclaveerde buffers en bewaren alle tRNA-bevattende monsters bij 4 ° C om t te voorkomen dat tRNA-afbraak.
- Voeg 1 volume zuurfenol (pH 4,3) toe aan de geresuspendeerde celpelletje in de dampkap. Meng gedurende 1 minuut door inversie om de cellen te lichten en centrifugeer bij 10.000 xg (10 min, 4 ° C).
- Verzamel de bovenste waterige fase die het oplosbare tRNA (UUU) bevat (en kleinere concentraties van de andere tRNA-zwembaden) met behulp van een pipet die de organische (bodem) fase niet aspireert. Gooi de onderlaag en de pellet, die bestaat uit de organische fase en de celafval, in een voldoende container.
- Neerslaan van het tRNA door de oplosbare (waterige) fase grondig te mengen met 2,5 volume 100% v / v ethanol door inversie gedurende 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer het mengsel bij 15.000 xg (30 min, 4 ° C).
- Dek de supernatant zorgvuldig af en resuspendeer de tRNA-rijke pellet in 4 ml gelfiltratiebuffer (20 mM natriumfosfaat of kaliumfosfaat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Run 5 μL van het geresuspendeerde tRNA-pool op een 2% w / v agarosegel.
NOTITIE:TRNA van goede kwaliteit verschijnt als een enkele band (moleculaire grootte tussen 50-100 bp).
- Zuivering van tRNA (UUU)
- Volg de standaard chromatografische praktijk 12 , het geresuspendeerde tRNA (UUU) op een preparatieve gelfiltreringskolom met hoge resolutie (afmetingen: 16 x 600 mm, bed volume: 120 ml, resolutie bereik: 1.000-70.000 Da) die eerder in gel filtreringsbuffer is geëquilibreerd (mobiele fase). Stel de stromingssnelheid in op 1 ml / min om de monsters te elueren.
OPMERKING: De tRNA (UUU) piek elueert ongeveer op 75,5 ml. Gewoonlijk kan een opbrengst van 0,5-1,0 mg / L tRNA van cultuur worden verkregen. - Analyseer de monsters bij representatieve elutievolumes door 5 tot 10 μl van elk monster op een 2% w / v agarosegel te elektroforeseer.
- Volg de standaard chromatografische praktijk 12 , het geresuspendeerde tRNA (UUU) op een preparatieve gelfiltreringskolom met hoge resolutie (afmetingen: 16 x 600 mm, bed volume: 120 ml, resolutie bereik: 1.000-70.000 Da) die eerder in gel filtreringsbuffer is geëquilibreerd (mobiele fase). Stel de stromingssnelheid in op 1 ml / min om de monsters te elueren.
3. Voorbeeld Bereiding
- Express en zuiver TcdA volgens López-Estepa et al . 2 .
OPMERKING: tot 250 μMTcdA kan gebruikt worden voor de studie. - Pipet de bijbehorende hoeveelheid TcdA zoals per Tabel 1 in de correct gemarkeerde 1,5 ml centrifugebuizen. Voeg 1,6 mM tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) (eindconcentratie) toe en meng zachtjes met een pipet. Sluit het deksel en incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 μM adenosintrifosfaat (ATP) en 50 mM MgCl2 (laatste concentraties) toe. Meng met een pipet en incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg gezuiverd tRNA (UUU) toe (sectie 2.3) volgens Tabel 1 , meng met een pipet en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) toe tot 100 μl eindvolume. Meng goed en voeg glycerol toe aan een uiteindelijke concentratie van 10% v / v.
- Vortex het monster en draai de inhoud van de buis kort (10.000 xg, 1 min, 4 ° C) kortom.
4. Gel laden en elektroforese ontwikkeling
- Plaats de elektroforeseenheid in een dienblad die is gevuld met gebroken ijs om de kamer bij 4 ° C te houden tijdens de elektroforese run.
- Pijp 5 μL van elk monster zorgvuldig in de bijbehorende put. Voeg een geschikte DNA-grootte marker toe.
- Steek de elektroden in de bijbehorende sleuven van de voedingseenheid. Zet de voedingseenheid aan en zet de spanning op 100 V en loop de gel gedurende 90 minuten.
5. Gel-kleuring om tRNA-eiwitinteractie te waarnemen
- Bereid de kleuroplossing door 50 ml TBE met 1x van een geschikte DNA-vlek te mengen. Vermijd blootstelling van de vlekoplossing aan zonlicht door de vlekhouder te bedekken met aluminiumfolie.
OPMERKING: DNA-vlekken worden gewoonlijk opgeslagen als 10.000 of 20.000x geconcentreerde voorraden. - Na 90 minuten elektroforese, verwijder de gel zorgvuldig uit de bak en plaats deze in een houder met kleuroplossing. Plaats het op een rocker bij lage schommelingssnelheid bij kamertemperatuurUre gedurende 30 minuten.
- Verwijder de agarosegel uit de vlekhouder, tik het voorzichtig op een stuk celluloseweefsel of filterpapier om overtollige vloeistof te verwijderen en plaats het direct op een transilluminator. Schakel het UV-licht in om banden met tRNA te visualiseren. Neem een foto van de gel.
- Proteinkleuring (optioneel).
- Verwijder de DNA-vlekoplossing veilig (volgens veiligheidsprocedures) en vervang deze met 50 ml Coomassie Brilliant Blue (CBB) oplossing. Plaats de bak op een rocker bij kamertemperatuur en vlek een nacht (> 12 uur). Gooi de CBB-vlekoplossing uit en vervang deze met 50 ml PBS om overtollige kleurstof te verwijderen. Versteek voor 1 uur op een tuimelschakelaar.
- Visualiseer eiwit bevattende tRNA complexen onder een licht transilluminator en neem foto's van de gel om te vergelijken met de tRNA UV gel foto.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Grote hoeveelheden tRNA (UUU) kunnen worden verkregen door het tRNA-gen in E. coli te onderdrukken onder de controle van een sterk induceerbare T7 promotor. Het uitgedrukte tRNA (UUU) accumuleert in het cytoplasma en is verrijkt over het zwembad van natuurlijk overvloedige tRNAs. Een tweestapszuiveringsproces bestaande uit een opname- / extractiestap en een gelfiltratie- / polijststap werd gebruikt om EMSA-gehalte tRNA te verkrijgen. De opname- / extractiestap maakt gebruik van ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hierin beschreven eiwit-tRNA agarose gel retardatie-analyse kan op een aantal manieren worden gemodificeerd. Ten eerste kan het percentage agarose in de gel verminderd worden om de scheiding en visualisatie van eiwit-tRNA complexen aanzienlijk groter te maken dan de hier geanalyseerde (120 kDa). Ten tweede, als het doelproteïne thermolabiel is, moeten extra voorzorgsmaatregelen worden genomen om ervoor te zorgen dat de temperatuur onder de maximale aanvaardbare temperatuur wordt gehouden door het elektroforeseapparaa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
MCV is lid van het CIB Intramurale Programma "Moleculaire Machines voor Beter Leven" (MACBET). Het onderzoek dat leidde tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van het Spaanse Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 naar MCV), het Spaanse Ministerie van Economie en Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R en SAF2015-72961-EXP naar MCV ), De regionale regering van Madrid (S2010 / BD-2316 tot MCV) en de Europese Commissie (kaderprogramma 7 (KP7)) project ComplexINC (contract nr. 279039 naar MCV). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, dataverzameling en analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiden van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen bevat T7 polymerase bij IPTG-inductie. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d geeft resistentie tegen ampicilline; T7-promotor. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventionele LB Broth, High Salt, kan ook worden gebruikt. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Elke shaker incubator met temperatuurregeling kan worden gebruikt. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Natriumacetaat, watervrij, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), dinatriumzout, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Schadelijk bij inademing. |
| Centrifuge (gekoeld) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (gekoeld) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Fenoloplossing, Verzadigd met 0,1 M citraatbuffer, pH 4,3 & plusmn; 0,2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing), corrosief |
| Ethanol absoluut voor analyse, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Natriumfosfaat dibasisch dihydraat, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Kaliumdiwaterstoffosfaat, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethaan HCl] | Melford | T1513 | |
| Boorzuur | Melford | B0503 | |
| Microgolfoven | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)fosfine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosie voor metalen en huid. |
| ATP [Adenosine 5′-trifosfaat dinatriumzout hydraat], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesiumchloride (MgCl2), watervrij, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Natriumchloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Kaliumchloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Voeding | Consort | EV261 | |
| Elektroforese unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleïnezuurkleuring | Real Laboratory | RBMSAFE | 20.000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brillant Blauw G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
Referenties
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606(2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
