Cardiac Spier Cell-gebaseerde Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - Deel 2

Samenvatting

In deze studie worden een biologische actuator en een zelfstabiliserende zwemmende biorobot met gefunctionaliseerde elastomere cantilever armen geplant met cardiomyocyten, gekweekt en gekarakteriseerd voor hun biochemische en biomechanische eigenschappen in de tijd.

Samenvatting

In de afgelopen jaren zijn hybride apparaten die bestaan ​​uit een levende cel of weefselcomponent, geïntegreerd met een synthetische mechanische ruggengraat, ontwikkeld. Deze apparaten, genaamd biorobots, worden alleen aangedreven door de kracht die voortvloeit uit de contractiele activiteit van het levende component en kan door hun vele inherente voordelen een alternatief zijn voor conventionele volledig kunstmatige robots. Hier beschrijven we de methoden om te zaaien en een biologische actuator en een biorobot te karakteriseren die is ontworpen, vervaardigd en gefunctionaliseerd in het eerste deel van dit tweedelig artikel. Geproduceerde biologische actuator en biorobotinrichtingen samengesteld uit een polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en een dunne filmcantilever werden gefunctionaliseerd voor celbevestiging met fibronectine. Na de functionalisatie werden neonatale ratkardiomyocyten op een hoge dichtheid op de PDMS-cantileverarm gezaaid, wat resulteerde in een confluente celplaat. De apparaten werden elke dag afgebeeld en de beweging van de cantiHendel armen werden geanalyseerd. Op de tweede dag na het zaaien hebben we de buiging van de cantilever armen gezien als gevolg van de krachten die door de cellen werden uitgeoefend tijdens spontane samentrekkingen. Bij kwantitatieve analyse van het cantilever buigen werd een geleidelijke toename van de door de cellen uitgeoefende oppervlakspanning uitgeoefend, waarna ze over de tijd werden gerijpt. Evenzo hebben we de beweging van de biorobot waargenomen door de activering van de PDMS cantilever arm, die als een vink optrad. Bij kwantificering van de zwemprofielen van de toestellen werden verschillende voortstuwingswijzen waargenomen, die door de rusthoek van de vin beïnvloed werden. De bewegingsrichting en de klopfrequentie werden ook bepaald door de rusthoek van de vin en een maximale zwemsnelheid van 142 μm / s werd waargenomen. In dit manuscript beschrijven we de procedure voor het bevolken van de vervaardigde apparaten met cardiomyocyten, evenals voor de beoordeling van de biologische actuator en biorobotactiviteit.

Inleiding

Biorobots zijn apparaten gebaseerd op levende cellen die zijn opgenomen in een mechanische ruggengraat die meestal bestaat uit zachte, elastische materialen, zoals PDMS of hydrogelen ¹ . De cellen ondergaan ritmische contracties, hetzij spontaan of in reactie op stimuli, en functioneren dus als een actuator. De kracht die wordt gegenereerd door cellcontractie, rijdt op verschillende biorobots. Mammale hartcellen (cardiomyocyten) en skeletspiercellen worden vaak gebruikt voor biorobotactivering door hun contractiele eigenschappen. Afgezien van cardiomyocyt- en skeletspiercellen, zijn andere celsoorten, zoals insectespierweefsels ² en geexplanteerde spierweefsels ³ , gebruikt. Insectspierweefsels maken de werking van biologische actuatoren bij kamertemperatuur mogelijk.

De functie en prestatie van een biorobot worden voornamelijk bepaald door de sterkte en consistentie van de biologische actuator ( dwz. Spiercellen), terwijl de mechanische ruggengraatstructuur voornamelijk de mechanismen van locomotie, stabiliteit en kracht bepaalt. Aangezien deze apparaten uitsluitend worden gedreven door krachten die door cellen worden gegenereerd, bestaan ​​er geen chemische verontreinigende stoffen of bedieningsgeluiden. Daarom vormen ze een energie-efficiënt alternatief voor andere conventionele robots. Diverse literatuurbronnen hebben de verschillende methoden om levende cellen en weefsels in biorobots ^{1 , 4 , 5 te} integreren besproken. Voorschotten in microfabricatie en weefseltechniek hebben de ontwikkeling van biorobots mogelijk gemaakt die kunnen lopen, grepen, zwemmen of pompen ^{5 , 6} . In het algemeen worden cellen rechtstreeks op de mechanische (polymere) ruggengraat gekweekt als een samenvloeiend celblad of worden ze gevormd in 3-dimensionale bedieningsstructuren binnen steigers zoals ringen en strips. Meestal zijn biorobotsVervaardigd met behulp van cardiomyocyt vellen ^{6 , 7} , aangezien deze cellen een aangeboren vermogen hebben om spontane samentrekking zonder externe stimuli te tonen. Aan de andere kant zijn rapporten over skeletspiercelbladen beperkt door hun behoefte aan stimuli om contracties in vitro te initiëren om de membraan depolarisatie ⁸ te starten.

Dit protocol beschrijft eerst hoe u kardiomyocyten op een functionele biologische actuator uit een dunne PDMS cantilever zaait. Het beschrijft vervolgens in detail de zaaien en analyseren van de zwemprofielen. De cantilever is gefunctionaliseerd met een cel kleefmiddel eiwit, zoals fibronectine en wordt samen met kardiomyocyten samengezaaid. Naarmate de cellen op het toestelcontract zaaien, veroorzaken ze dat de cantilever buigt en dus als een actuator optreedt. Na verloop van tijd, als de cellen volwassen worden, traceren we de veranderingen in de oppervlakspanning op het apparaat door video's van de video te analyserenCantilever buigen. De hier ontwikkelde biologische actuator kan worden gebruikt om de contractiele eigenschappen van elk celtype, zoals de fibroblasten of geïnduceerde pluripotente stamcellen, te bepalen, aangezien ze differentiëren ondergaan.

Veel van het vroegere onderzoek naar biorobots is gericht op het ontwikkelen van biologische actuatoren, terwijl de optimalisatie van de biorobotarchitectuur en functionele mogelijkheden grotendeels verwaarloosd was. Onlangs hebben enkele studies aangetoond dat de zwemmodi in biorobots geïmplementeerd zijn die door de natuur geïnspireerd zijn. Bijvoorbeeld, zwemmen biorobots met motionella op basis van flagella, kwallen ⁹ , en biohybrid stralen ⁴ zijn ontworpen. In tegenstelling tot andere werken in de literatuur, richten we hierbij op het variëren van de eigenschappen van de mechanische ruggengraat om een ​​zelfstabiliserende structuur te creëren. De biorobot die in deze studie is ontwikkeld, kan een constante toonhoogte, rol en im behoudenMersion diepte als het zwemt. Deze parameters kunnen worden aangepast door de dikte van elk basiscomposiet te variëren. De fabricagestappen die betrokken zijn bij het ontwikkelen van de PDMS-actuator, de submergible biorobot en de functionalisatie van het apparaat worden in detail beschreven in Deel 1 van dit tweedelig artikel, evenals in ons recente werk ^7. De hier ontwikkelde techniek kan de Manier voor de ontwikkeling van nieuwe, zeer efficiënte biorobots voor diverse toepassingen, zoals lading.

Het isolatieproces dat gevolgd wordt in deze studie is vergelijkbaar met het proces dat is beschreven in een eerder werk ¹⁰ , evenals in recentelijk gepubliceerd werk ⁷ . De microfabricatiemethoden die worden gebruikt voor het vervaardigen van de PDMS-actuatoren en biorobot-apparaten worden in detail beschreven in Deel 1 van dit tweedelige manuscript. Het protocol gedeelte van dit manuscript beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het zaaien van cardiomyocyten op de vervaardigde PDMS aCtuator en de biorobot na hun functionalisatie met cel kleef eiwitten.

Protocol

Alle procedures die hier beschreven zijn, zijn uitgevoerd met behulp van een goedgekeurd protocol en in overeenstemming met de voorschriften van het Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee van de Universiteit van Notre Dame.

1. Cell Seeding and Culture

1. Voor de aanvang, berei de benodigde artikelen voor: een kleine trechter, pipetten en warm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% Fetale Bovine Serum (FBS) en 1% Penicilline antibioticum (DMEM compleet).
2. Neem T-25 flessen samen met het gefunctionaliseerde apparaat (biologische actuator of de biorobot) erin. Raadpleeg sectie 4 van deel 1 van dit tweedelig manuscript voor details over de voorbereiding, functionalisatie en opslag van apparaten voorafgaand aan het zaaien van cellen.
3. Bereid een trechter, die kan worden gemaakt door een klein vierkant plastic vel te rollen. Plaats het over de biologische actuator of biorobot in de T-25 fles. Pas de diameter van het brede uiteinde aan om het gehele apparaat aan te passenEn de hoogte zodat het goed past wanneer de bovenkant van de fles wordt aangescherpt.
   1. Voor de biorobots, gebruik een magneet om het apparaat in de bodem van de fles vast te houden tijdens het zaaimachine.
      Opmerking : hier is een enkele neodymiumschijfmagneet (1,26 inch diameter) gebruikt, maar elke magneet van gelijke grootte en sterkte kan ook gebruikt worden om de biorobot vast te houden met de composietbasis van de magnetische nikkel-PDMS.
   2. UV-steriliseer het plastic vel gedurende minstens 30 minuten voor gebruik.
4. Zorg ervoor dat er geen grote kloof is tussen de basis van de trechter en de fles.
5. Resuspendeer de cardiomyocyten in DMEM compleet met een dichtheid van 1,6 x ¹⁰⁷ cellen / ml en laat 400 μL suspensie langzaam op het apparaat druppelen door de trechter. Gebruik een hemocytometer of een andere celteller om het aantal verkregen cellen te bepalen.
6. Verplaats het systeem langzaam in de incubator zonder het apparaat en de trechter te storenhin. Cultuur gedurende 24 uur bij 37 ° C.
7. Na de incubatieperiode, verwijder de trechter langzaam, doe het monster met PBS voorzichtig af en vul de fles met 10 ml verse DMEM compleet.
   Opmerking : Verwijder de magneet voor de biorobots, zodat het apparaat op het water staat.

2. Biochemische karakterisering

1. Calciumflux assay
   Opmerking : De calciumfluxanalyse wordt uitgevoerd om de interconnectiviteit van de cel te beoordelen. De procedure voor het laden van de cellen met de fluorescerende, calciumionspecifieke kleurstof volgt het proces beschreven in een eerder vastgesteld protocol ¹¹ .
   1. Bereid eerst de benodigde materialen voor, calcium fluo-4-acetomethyl (AM) ester, niet-ionogene oppervlakteactieve polyol (zie de Tabel van Materialen ) en Tyrode's zoutoplossing .
   2. Met behulp van lange pincet, verplaats het toestel zachtjes van de kolffles naar een 35 mm Petri-schotel met 2 ml Tyrode's zoutolu tie.
   3. In een aparte centrifugebuis, neem 1 ml warme Tyrode-oplossing (opgewarmd tot 37 ° C) en voeg 3-5 μl voorraad calcium fluo-4 AM kleurstof toe (werkconcentratie: 3-5 μM) en een gelijke hoeveelheid niet-ionogene oppervlakteactieve stof Polyol (werkconcentratie: 0,2%). Vervang de monsteroplossing met de warme Tyrode oplossing, aangevuld met de calcium indicator kleurstof, fluo-4 en 0,2% nonionische oppervlakteactieve stof. Incubeer gedurende 25 - 30 minuten bij 37 ° C.
   4. Verwijder de kleurstofoplossing en wrijf het monster voorzichtig met verse Tyrode's oplossing. Re-incubateer het monster in 2 ml frisse DMEM compleet gedurende nog 30 min bij 37 ° C voorafgaand aan beeldvorming.
      Opmerking: de resultaten van deze analyse en gerelateerde video zijn te vinden in het eerder gepubliceerde werk ⁷ .
2. immunofluorescentie
   Opmerking : De dubbele immunostaining van alle monsters werd uitgevoerd op basis van eerder vastgesteld protocol> 12.
   1. Bereid eerst 10% geitenserum (GS) op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 4% paraformaldehyde (PFA) in diH20, 0,1% cellichtmiddel (zie de Tabel van Materialen ) in PBS, primaire antilichamen (anti- Monoklonaal antilichaam hart-troponine-I en anti-konijn monoklonaal antilichaam connexins-43), secundaire antilichamen (Alexa 594 conjugaat en geit anti-muis IgG (H + L) Alexa 488 conjugaat) en DAPI.
      Let op: paraformaldehyde is kankerverwekkend.
   2. Verwijder de steekproef uit de fles en doe het voorzichtig twee keer met PBS. Raadpleeg sectie 4 in Deel 1 van dit tweedelig manuscript voor meer informatie over het voorbereiden van de monsters en functionalisatie.
   3. Voeg een druppel PBS op een kleine deklaag (diameter: 12 mm of 15 mm). Houd de basis van het apparaat voorzichtig vast met de pincet en snijd de dunne PDMS-armen (cantilever, Figuur 1 ) met behulp van een schaar vanaf het uiteinde waar het op de bovenkant van de basis aansluite. Breng de cantilever armen over op de druppel met de celadapter naar boven gericht. De PBS druppel voorkomt dat de cellen drogen.
   4. Bevestig de monsters met 4% PFA en voer dubbele immunostaining van de monsters, zoals eerder beschreven ¹² .
   5. Na immunostaining, monteer de monsters op een schone glazen glijbaan met behulp van anti-fade montagereagens en plaats 24 uur in de duisternis, ongestoord.
   6. Herhaal de procedure voor alle monsters.
      Opmerking : De resultaten van deze analyse en de bijbehorende afbeeldingen worden uitvoerig besproken in het eerder gepubliceerde werk ⁷ .

3. Beeldvorming

1. Plaats de T-25-fles rechtop in een CO _2- incubator en berei het afbeeldingssysteem in de incubator op. Neem het apparaat op met een camera (zie de Tabel van Materialen ) met een zoomlens (zie de Tafel van Materialen ). Voor een lichtbron,Gebruik een strip LED-lichten.
   Opmerking: hier is een strip witte LED's gebruikt, maar ook normale LED's werken ook.
2. Sluit de camera aan op een besturingssysteem en open de camera- specifieke software (zie de Tabel van Materialen ). Klik op het camerabeeld onder het tabblad 'Bestand' in het bovenste paneel om alle camera-opties te openen en kies de juiste camera.
3. Kies 'live' uit de lijst met tabbladen in het bovenste paneel binnen de software.
4. Breng de afbeelding handmatig in de hand door de lenswiel aan te passen. Selecteer 'Crop naar regio van belang (ROI)' in het bovenste paneel. Trek dan handmatig een rechthoek in het videolijst, dat het biologisch bedieningsapparaat en de cantilever armen omhult, om de ROI te markeren.
   Opmerking : Het kiezen van een passende ROI minimaliseert de grootte van de afbeeldingsbestanden.
   1. Bij biorobots moet u het hele scherm vastleggen om de zwembeweging van het apparaat op te nemen.
      OPMERKING : Het is niet nodig om een ​​ROI te trekken voor de biorobots
5. Voordat u de opname start, selecteert u "Camera instellingen" van een van de tabbladen in het bovenste paneel op het scherm. Stel de beeldsnelheid in door de belichting en de pixelverhouding van het livebeeld aan te passen door de balk voor elk te schuiven of door de waarden handmatig in te voeren. Stel de framesnelheden in op ongeveer 30 ± 2 fps.
   Opmerking : het wijzigen van de belichting en de pixelverhouding verandert de helderheid en het contrast van de live-afbeelding.
6. Klik op de knop "Opnemen" vanaf het bovenste paneel in de software om de video's van de actuators met een resolutie van 1.000 x 1.000 pixels te starten voor precies 30 s. Herhaal het proces voor alle monsters.

4. Beeldanalyse van de biologische actuatoren op een stationaire basis

1. Analyseer de beelden met behulp van een programmeursoftware (bijvoorbeeld Matlab) met het aangepaste script. Zie de tabel van materialen en het aanvullende bestand voor verdere details.
   Opmerking : het script toont elk frame van de opgenomen video's, ontvangt de muisinvoer van de gebruiker om de coördinatie van de punten van de cantilever op de afbeeldingen op te nemen, berekent de diameter en het midden van de cirkel die de ingevoerde punten doorgaat via minimaal vierkante montage en Exporteert alle ingevoerde en berekende gegevens voor verder gebruik.
   1. Open de programmeersoftware door op het pictogram te klikken. Klik op 'Bestand' -> 'Openen' in de menubalk bovenaan en selecteer het .m-scriptbestand voor beeldanalyse. Zorg ervoor dat opgenomen TIFF-afbeeldingen in dezelfde map zijn als het .m-bestand. Klik op "Run" om het script te draaien.
      Opmerking : een interactief scherm verschijnt voor het wijzigen.
   2. Druk op "play" om het actuele programma te starten. Klik op de open knop en zoek het TIFF-bestand dat geanalyseerd wordt.
   3. Klik op de "base & #34; Knop en klik vervolgens op het punt waar de cantilever aan de bovenkant hecht Hit enter. Dit zal een vierkante markering op het beeld voor elk frame plaatsen om de locatie van de cantilever basis te vermelden.
   4. Klik op de knop "Schaal" en klik vervolgens handmatig op één rand van de glazen kraal. Breng de muisaanwijzer naar de andere kant van de glazen kraal en druk op "Enter".
      Opmerking: dit moet een lijn tekenen die de diameter van de glazen kraal meet. Aangezien de glazen kraal 3 mm in diameter heeft, zal dit 3 mm verhouden naar de weergegeven pixels.
   5. Klik op de knop 'Analyse'. Klik langs de cantilever op een korte afstand van de eerste vierkante marker die de cantilever base vertegenwoordigt.
   6. Klik op de knop 'Analyse'. Klik dan op de cantilever op een korte afstand van de eerste vierkante marker die de cantilever base vertegenwoordigt. Blijf doorgaan met de cantilever, inclusief de tip, en druk op enter wanneergedaan. Dit plaatst een "x" op elk punt dat op de cantilever is geklikt.
      Opmerking : Op basis van de coördinatie van de vierkante markering en op de x-markeringen wordt het middelpunt en de diameter van een cirkel berekend met behulp van een minimale vierkante functie (zie het bijgevoegde aanvullende bestand voor het gebruikte script). De cirkel, die de x markers en de vierkante maker overlijdt, wordt automatisch op de afbeelding geplaatst.
   7. Controleer of de bovenstaande cirkel het cantileverprofiel correct opspoort.
      Opmerking : als de cantilever zeer vlak is, is het moeilijk om te beoordelen of het cantileverprofiel correct is opgespoord. Zie figuur 3 .
   8. Klik op de knop "Next Frame". Dit gaat over naar het volgende frame in het TIFF-bestand. De basis en de schaal zijn al in de vorige stap ingesteld.
   9. Herhaal stap 4.1.5 tot en met 4.1.7 totdat alle frames in het TIFF-bestand zijn voltooid. Zodra alle frames zijn uitgevoerdSsed, klik op de "Export" knop.
      Opmerking : dit maakt een spreadsheetbestand met de TIFF-bestandsnaam voor de cantilever die net is geanalyseerd. Bewerk de bestandsnaam om aan te geven welke kant (links of rechts) van de cantilever is geanalyseerd.
2. Stres berekenen in de spreadsheet.
   1. Bereken de oppervlakspanning, "σ," op de cantilever met behulp van de volgende vergelijking:
      
      Waar E, R, v en h de Young's modulus, de krommingsradius, Poisson's ratio en respectievelijk de cantileverdikte zijn.
      Opmerking : De dikte van de cantilever kan veranderd worden om de gevoeligheid te veranderen. In deze studie waren de waarden als volgt: E = 750 kPa, v = 0,49 en h = 25 μm ^{13 , 14} .
   2. Bereken de oppervlakspanning met behulp van de vergelijking in stap 4.2.1. Open de .Xls spreadsheet bestand. Merk op dat de uitvoer meerdere kolommen heeft die eerst de x- en y-coördinaten van de basis en de cirkel tonen en vervolgens de krommingsstraal. Bereken de x- en y-coördinaten van elk punt dat op deze basis is geklikt.
      Opmerking: De spanningen plotten over de time-lapse beeldkaders laten de veranderingen zien in de kracht die op de cantilever wordt uitgeoefend. De trommels tonen de stress op de cantilever tijdens de ontspanning van de cardiomyocyten of de statische stress die wordt uitgeoefend op de cantilever door celkrachtkrachten. De pieken tonen de dynamische stress op de cantilever, die werd uitgeoefend door het kloppen van de cardiomyocyten. Deze waarde komt overeen met de maximale hoeveelheid kracht die wordt gegenereerd door de samentrekking van de cardiomyocyten.

5. Analyse van Zwemmen Biorobots

1. Noteer de positie van de biorobot met behulp van beeldanalysesoftware.
   Opmerking : Raadpleeg de lijst Materialen voor de software die in thIs sectie.
   1. Open de beeldanalysesoftware ( bijv. ImageJ). Druk op "Bestand" en "Openen" en selecteer het zwembiorobot videobestand. Klik op "OK" en laat het programma het bestand laden. Open de spreadsheet software.
   2. In de geladen biorobotvideo vind u een referentie van bekende afmetingen ( bijv. De glazen kraal 3 mm in diameter die in de biologische actuator was ingebed).
      Opmerking : Elk object met een bekende afmeting zal werken. Hiermee worden de verhoudingen tussen pixel en lengte vastgesteld in elke video.
   3. Gebruik het 'Rechte' gereedschap om een ​​lijn over de glazen kraal te trekken. Klik op "Analyseer" en selecteer "Schaal instellen". Stel het veld 'Bekende afstand' in op '3000 μm' en klik op 'Ok'.
      Opmerking : hiermee worden de x- en y-coördinaten ingesteld op micrometers.
   4. Kies een punt op het apparaat dat niet tussen frames kopt om als markering te fungeren.
      Notitie:Het is aan te raden om een ​​hoek van de basis te kiezen.
   5. Wijs naar het geselecteerde punt in 5.1.4 op het eerste frame. Noteer de x- en y-coördinaten op de spreadsheet.
   6. Schakel terug naar het beeldanalysesoftwarevenster en druk op de rechter pijltoets om naar het volgende frame te gaan. Breng opnieuw de marker aan (van stap 5.1.4) en teken de x- en y-coördinaten op op de spreadsheet.
   7. Herhaal stap 5.1.6 voor alle frames.
2. Bereken de zwemparameters van de biorobot met behulp van de spreadsheet van de coördinaten ⁷ .
   1. Bereken de periode tussen frames van de bekende beeldsnelheid van elke video.
   2. Bereken de verandering in de x- en y-coördinaten tussen de frames om de verplaatste afstand te vinden, inclusief de totale afstand.
   3. Bereken de amplitude van de samentrekking van de maximale verandering langs de y-as. Bepaal de slagfrequentie voor elke biorobot van de inverse van de periode tussen twee contracties.
   4. CBereken de zwempnelheid van elk apparaat uit de totale tijd en afstand die in de x-richting is bewogen.
   5. Herhaal stap 5.2 voor elke biorobot-video die werd geanalyseerd.
   6. Normaliseer elke gemeten parameter.
      Opmerking : Normaliseer alle waarden om de verschillen beter te visualiseren. Dit protocol demonstreert normalisatie ten opzichte van een horizontale modus biorobot met laagfrequente contracties (horizontale LF) ( Figuur 4 ) ⁷ .

6. Analyse van Proteïne Expressie

Opmerking: De gemonteerde monsters die werden voorbereid in stappen 2.2.4 en 2.2.5 werden afgebeeld met behulp van een confocale microscoop. Beelden werden verworven bij 20X, 40X en 60X vergroting opeenvolgend in drie kanalen tegelijk: 460 nm, 488 nm en 594 nm. Een set van 5 beelden werd vastgelegd bij 40X vergroting, uit verschillende posities voor elk monster, en elk kanaal werd opgeslagen als een individu. TIFFhet dossier. De belichtingsinstelling werd bepaald door de vergroting van het gebruikte doel en werd constant ingesteld voor alle opnamen bij die vergroting.

1. Open de beeldanalysesoftware en selecteer 'Bestand' -> 'Openen' om de afbeeldingen te laden.
2. Teken een rechthoekige veelhoek op het beeldframe om de ROI te markeren. Selecteer "Analyseer" -> "Meet" om de gemiddelde fluorescerende intensiteit te meten.
3. Herhaal stap 6.2 om de intensiteitsmetingen van alle monsters te verzamelen en de respectievelijke gemiddelde intensiteit voor elke voorwaarde te berekenen.
   Opmerking: hierbij heeft een andere voorwaarde betrekking op verschillende tijdspunten, zoals in dag 1, dag 2 en tot dag 6.
4. Exporteer de resultaten op een spreadsheet voor verdere statistische analyse en voor de productie van data plots.

Resultaten

De biologische actuator gemaakt van een dunne PDMS cantilever (25 μm in dikte) en cardiomyocyten vormt de kern van de zwembiorobot, zoals getoond in de schematische en screenshot van de inrichtingen in Figuur 1 . De cellen beginnen contracties na 24 uur in de cultuur te tonen en buiging van de cantilever armen werd waargenomen op dag 2. Het zijprofiel van het apparaat werd elke dag geregistreerd en de oppervlakspanning werd gekwantificeerd uit de buiging van de cantileve...

Discussie

De hier beschreven procedure beschrijft een succesvolle zaaimethode voor PDMS-gebaseerde actuatoren en biorobots, die de bevestiging van cardiomyocyten vergemakkelijkt. Bovendien is het proces van beeldverwerving en de daaropvolgende analyse die het gedrag van de cellen karakteriseert en de prestatie van de apparaten beschreven.

We hebben na 24 uur spontane samentrekking van cellen op de cantileverarms waargenomen; De intensiteit van de contracties bleef mettertijd gestaag toenemen en bereik...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemicaliën en reagentia
Cardiomyocyten (primaire hartcellen)	Charles River	NA	Geïsoleerd uit 2 dagen oude neonatale Sprague Dawley ratten
Dulbecco’s aangepast eagle’s media (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	met 4500 mg/L glucose, 4,0 mM L-glutamine en 110 mg/L natriumpyruvaat
Fetalclone III serum	Hyclone Industries, GE	16777-240	Fetaal bovien serum (FBS)
Dulbecco’s fosfaatbuffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Penicilline-G natriumzout	Sigma-Aldrich	P3032
Geitenserum	Sigma-Aldrich	G9023
4,6-diamidino-2-fenylindole dihydrochloride poeder (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronectine uit bovien plasma	Sigma-Aldrich	F1141	Oplossing (1 mg/ml)
Calcein-AM en ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)	Molecular Probes	L3224
Calcium Fluo-4, AM	Molecular Probes	F14217	calcium indicator kleurstof
Tyrodes zout oplossing	Sigma-Aldrich	T2397	buffer oplossing
Pluronic F-127	Molecular Probes	P3000MP	nonionische oppervlakteactieve stof - 20 % oplossing in Dimethylsiloxaan (DMSO)
16% Paraformaldehyde	Elektronenmicroscopie	15710	Voorzichtig: Irritante en brandbare stof
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 mL	cel lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)fenyl-polyethyleenglycol, t-Octylfenoxypolyethoxyethanol, Polyethyleenglycol tert-octylfenylether)
ProLong gold antifade reagens	Molecular Probes	P10144	Montagemiddel
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Molecular Probes	A12381	Actine filament marker
Geit anti-konijn IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 594-conjugaat	Molecular Probes	A-11012
pha	Molecular Probes	A-11001
Anti-connexin 43 antilichaam	Abcam	ab11370	Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antilichaam	Abcam	ab10231	Contractiele proteïne
16% EM graad paraformaldehyde oplossing	Elektronenmicroscopie	100503-916
Polydimethylsiloxaan (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
Materialen en apparatuur
Camera	Thor Labs	DCC1545M
LED lichtstrip	NA	NA	Elke witte LED zonder spectrumemissie
Confocale microscoop	Nikkon C2	NA	Confocale microscoop met drie filtersets.
Zoomlens	Infinity	Model# 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	Gebruikt in Sectie 4) voor biologische actuatoranalyse.
Image J	National Institute of Health	NA	Java-gebaseerde beeldverwerkingssoftware. Gebruikt in Sectie 5) voor biorobotanalyse. Gratis beeldverwerkings- en analysesoftware in Java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam	Thor Labs	NA	Camerabesturingssoftware