Dissectie van de alvleesklier muis voor histologisch analyse en metabole profilering

Samenvatting

Dit video artikel vindt u een uitgebreide demonstratie van de procedures die nodig zijn om met succes de alvleesklier van een muis door dissectie voor histologisch analyse en metabole profilering.

Samenvatting

We hebben onderzocht de alvleesklier specifieke transcriptiefactor, 1a cre-recombinase; Lox-stop-lox-Kristen rat Sarcoom, glycine aan asparaginezuur op de 12 codon (Ptf1a^{cre / +}; LSL-Kras^{G12D / +}) stam muis als een model van menselijke pancreatic kanker. Het doel van onze lopende onderzoeken is het identificeren van de roman metabole biomarkers van pancreatic kanker progressie. Wij hebben uitgevoerd metabole profilering van urine, ontlasting, bloed, en alvleesklier weefsel extracten, evenals histologische analyses van de alvleesklier om de progressie van kanker te regisseren. De alvleesklier muis is niet een welomschreven solide orgel als bij de mens, maar is veeleer een diffuus gedistribueerde weke delen, dat is niet gemakkelijk geïdentificeerd door personen onbekend met interne anatomie van de muis of door personen die weinig of geen ervaring uitvoeren hebben muis orgel dissecties. Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde stapsgewijze visuele demonstratie bij beginners in de verwijdering van de alvleesklier muis door dissectie. Dit artikel moet vooral waardevol voor studenten en onderzoekers nieuw onderzoek waarvoor het oogsten van de alvleesklier muis door dissectie voor metabole profilering of histologische analyses.

Inleiding

De muis heeft ontpopt als een belangrijke diermodel voor menselijke pancreatic kanker^1,2. In de Ptf1a^{cre / +}; LSL-Kras^{G12D / +} muismodel, de Kristen rat Sarcoom (K-Ras) oncogen is geactiveerd uitsluitend in de alvleesklier, resulterend in de inleiding van voorstadia laesies in de alvleesklier, bekend als de alvleesklier geest neoplasias (PanINs), dat de vooruitgang aan alvleesklier ductaal adenocarcinomas, kortweg PDACs³. Deze muis modelsysteem biedt een van de beste beschikbare dierlijke modellen voor menselijke alvleesklierkanker^4,5, met het bijkomende voordeel dat de PanINs ontstaan binnen de eerste vijf maanden van het leven en vaak vooruitgang PDAC binnen een Eén jaar^4,5, overwegende dat alvleesklierkanker vaakst bij de mens 60-70 jaar oud optreedt.

Extractie van de alvleesklier door dissectie van de Ptf1a^{cre / +}; LSL-Kras^{G12D / +} muizen op verschillende leeftijden voorziet in gedetailleerde longitudinale histopathologisch onderzoek van de ontwikkeling van kanker in de alvleesklier, variërend van de vroegste stadia van de PanIN de progressie tot PDAC^{3,4 , 5}. de alvleesklier oogsten op leeftijden variërend van vijf tot vijftien maanden kan ook worden gebruikt om te bereiden weefsel extracten te karakteriseren van mondiale veranderingen in de alvleesklier⁴ metabolisme die zich tijdens de overgang van gezond naar zieke weefsel ^{voordoen 6,7}.

Dit artikel presenteert een complete visuele gids voor de stappen die nodig zijn voor het uitvoeren van een muis alvleesklier extractie en worden richtlijnen gegeven voor de opslag van een alvleesklier voor verdere analyse. Deze handleiding zullen even waardevol zijn voor individuen uitvoeren van onderzoek naar andere alvleesklier ziekten, met inbegrip van type I diabetes, en met name nuttig voor studenten en onderzoekers nieuw voor onderzoek waarbij oogsten moeten van het gebruik van de alvleesklier van de muis dissectie voor metabole profilering of histologische analyses.

Protocol

de procedures uitgevoerd in de video hieronder beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Miami.

1. voorbereiding en stimulans Test

1. stellen twee verschillende gebieden voor de chirurgische ingreep, de operatietafel en de tabel na operatie. Etappe van beide gebieden met alle materialen en keukengerei die nodig zijn.
   1. De operationele fase tabel onder een geventileerde kap. De tabel met de apparatuur op een wijze waarmee de continue en onbelemmerde uitoefening van de procedure regelen.
   2. Tot stand brengen van een postoperatieve tabel in dezelfde kamer en in de buurt van de hoofdtabel van operatie. Beide tabellen als steriele omgevingen gedurende de hele procedure handhaven.
2. Plaats van de volgende handelingen uit op de operatietafel leveringen: een glazen pot met deksel, een tube van 15 mL, één paar chirurgische schaar, een squeeze fles van 70% ethanol, twee schuim platen, twee pincet, twee 1 mL 21 gauge spuiten, twee buizen van 50 mL, een centrifugebuis , een cryogene flacon, vier chirurgische pads, tien pinnen, een dispenser van steriliserende doekjes en een container slijpsel.
3. Plaats de volgende leveringen op de tafel na bewerking: een analytische balans, een 4 L dewar van vloeibare stikstof, een ondiepe brede mond dewar, een drijvende microtube rack, één paar chirurgische scharen, twee pincet, vier cryogene flesjes en een dispenser voor steriele doekjes.
4. Vul een 50 mL en één tube van 15 mL tot 75% volume met formaline.
5. Met behulp van een pin in elke hoek, brengt een chirurgische aanvullen tot een geschatte 30 x 30 cm foam board om te dienen als de dissectie van bestuur. Gebruik de resterende vier pinnen tijdens de operatie. Bereiden van een kleinere Raad van bestuur van schuim met een chirurgische pad voor het overbrengen van de organen naar de tabel post-op.
   Let op: Isofluraan (99,9%) is een giftige chemische, en in een vent kap moet worden gebruikt om ervoor te zorgen het maximale niveau van veiligheid van het opruimen van afval verdoving gas ⁸. Aanvullende informatie over de risico's voor onderzoekers die is gekoppeld aan het gebruik van de methode van de open neerzetten met behulp van Isofluraan kan worden gevonden in een artikel door Taylor en Mook ⁸.
6. Plaats een chirurgische pad in de glazen pot en de weken met een paar druppels van Isofluraan (99,9%) en plaats een papieren handdoek over de bovenkant om te voorkomen dat direct contact van de muis met de Isofluraan. Ook het gebruik van een chirurgische pad lijn van de resterende buis en geniet met een paar druppels van Isofluraan en plaats een extra pad over de bovenkant om te voorkomen dat rechtstreeks contact tussen de muis en de Isofluraan.
7. Pour vloeibare stikstof in de ondiepe brede mond dewar totdat het maximum vullen lijn is bereikt.
8. Plaats de muis geselecteerd voor dissectie in de narcose kamer, dat wil zeggen de glazen pot met een zeem gedrenkt met een paar druppels Isofluraan (99,9%) bedekt met deksel, ~ 1 min.
   Opmerking: Deze tijd varieert van muis tot muis. Zodra de muis bewusteloos is, verwijderen uit de kamer en plaats deze op het operationele bord.
9. Oriënteren de muis zodat het liegt ventrale zijde omhoog en met haar hoofd weg van de wetenschapper wees. Plaats van het hoofd in de buis bekleed met een chirurgische pad gedrenkt met een paar druppels van Isofluraan (99,9%) en een stimulans test uitvoeren door een snuifje van de voet om ervoor te zorgen dat de muis niet reageert op prikkels.
   1. Als deze test mislukt en de muis op de voet snuifje proef antwoordt, herhaalt u stap 1.8.

2. Eerste snede hart doorprikken en euthanasie

1. Pin van de ledematen van de muis aan de chirurgische schuim van bestuur en de ventrale zijde van de muis met 70% ethanol nat.
2. Knijpen de vacht/huid in de buurt van de urethrale opening met een tang en trek iets omhoog. Maak een incisie met de chirurgische schaar via de buikholte van de urethrale openstelling, de middellijn beginnend en eindigend op de kin.
   1. In de buurt van het beginpunt van de oorspronkelijke incisie, één zijde van de vacht/huid te grijpen met de pincet en maken een andere snede met de schaar naar beneden en diagonaal naar de achterste poot.
   2. Herhaal dit op dezelfde wijze aan de overkant.
      Opmerking: De vacht/huid maken een grotere opening naar beneden kan worden gespeld, maar is niet noodzakelijk.
3. Zoek het hart en het hartzakje, oftewel de OSS rond het hart, om te voorkomen dat de verstopping van de naald van de spuit verwijderen.
   1. Pak het hartzakje met de pincet en snijd het met de schaar. Uitvoeren van het hart-lek door zorgvuldig de naald van de spuit in het kloppend hart en langzaam beginnen te trekken van de plunjer.
   2. Voor optimale bloedinzameling, gebruiken de plunjer van de naald om te bootsen de pompwerking van het hart en voorkomen te snel tekenen.
      Opmerking: Doorgaans ongeveer 1 mL bloed kunnen worden verzameld.
   3. Na het voltooien van de collectie van het bloed, het bloed te verjagen in de centrifugebuis en gooi de injectiespuit in de container slijpsel.
   4. Na de punctie van het hart wordt uitgevoerd, euthanasie uitvoeren door het verwijderen van de bijlagen die het hart aansluiten.
      Opmerking: Heparine, een anti-coagulant, is niet toegevoegd aan de spuit in deze procedure voorafgaand aan de punctie hart om het bloed te stollen voor serum collectie in deze specifieke studie. Echter, als de onderzoeker voorkomen dat de bloedstolling wilde voor het verzamelen van plasma, heparine konden worden toegevoegd aan de spuit vóór het hart-lek.
4. Als de studie genotypering van de muis omvat, een gedeelte van het oor met de schaar snip en plaats in een centrifugebuis voor de verificatie van een genotype.

3. extractie van de pancreas

1. Zoeken de maag aan de linkerzijde van de muis. Begin zachtjes (teneinde scheuren) scheiden van de alvleesklier van de maag en de twaalfvingerige darm met behulp van twee pincet.
   Opmerking: Wanneer het loskoppelen van de alvleesklier van de maag en darmen, het is heel belangrijk dat de verlostang zachtjes begeleiden de alvleesklier weefsel uit de buurt van de organen te niet verpletteren of scheur de alvleesklier met de pincet zijn gebruikt.
   1. Blijven om te scheiden van de alvleesklier van de dunne darm jejunum en ileum secties, en tot slot van het caecum van de dikke darm.
2. Op het caecum, verplaatsen de verlostang en afscheiding van de alvleesklier langs de resterende colon naar het rectum blijven.
   Opmerking: Op dit punt, het is handig om te knippen en het gedeelte van de maag naar de regio van de dikke darm onmiddellijk voorafgaand aan het rectum verwijderen.
3. Zoek de alvleesklier en milt gekoppeld. Schuif de alvleesklier naar de rechterkant van de muis. De resterende verbindingen tussen de alvleesklier en de borstholte scheidt met de Tang volledig los van de alvleesklier en aaneensluitend milt.
4. Verwijderen van de alvleesklier en het verspreid voor onderzoek. Laat de milt gekoppeld aan de alvleesklier voor identificatiedoeleinden.
   1. Verwijderen alle bindweefsel, vet en mesenterische weefsel uit de alvleesklier.
      Opmerking: Dit weefsel is witter in kleur en dus gemakkelijk kan worden onderscheiden van de alvleesklier weefsel dat is pinker in kleur. Dit is vooral belangrijk als de hele alvleesklier moet worden verwijderd. Bijvoorbeeld, als de alvleesklier moet worden afgewogen en vergeleken met lichaamsgewicht of tussen groepen van dieren. In de Ptf1a ^{cre / +}; LSL-Kras ^{G12D / +} muismodel, specifiek in de oudere maanden hard vezelig alvleesklier weefsel aanwezig kon zijn. In dit geval moet zorgvuldige verwijdering van de alvleesklier worden uitgevoerd, zoals de darmen kunnen worden geïnterlinieerd in tumor weefsel. In geavanceerde gevallen, abnormale milt en lever weefsel kunnen ook aanwezig zijn.
5. Desgewenst verwijderen andere organen op dit punt.

4. gegevensverzameling en -opslag

1. na extractie van de organen, de monsters te verplaatsen naar de postoperatieve ruimte voor behoud.
2. Wegen elk orgaan en plaats hen in hun respectieve cryogene flacon.
   Opmerking: langs with de massa van elke steekproef, onregelmatigheden moeten worden geregistreerd voor toekomstige verwijzing.
3. Zodra de organen worden gewogen, plaats ze in de vloeibare stikstof voor module bevriezing.
4. Na module bevriezing, slaan de organen bij-80 ° C voor langetermijnopslag.
5. Plaatst de formaline opgeslagen monsters op de top van de Bank 's nachts en de volgende ochtend veranderen hun oplossing van formaline naar 70% ethanol.
   Opmerking: Deze monsters moeten worden bewaard bij 4 ° C voor langetermijnopslag.
6. Voor langdurige opslag, bevriezen de punch van het bloed en oor bij-80 ° C.. Toestaan voor de verzameling van het serum uit het bloed, het bloed te stollen voor 30 min dan het centrifugeren. Het gedeelte van de serum met behulp van een precisiepipet verwijderen en op te slaan op -80 ° C.

5. Clean Up

1. Sanitize alle de dissectie tools met de steriliserende doekjes. GLB de buis bekleed met de Isofluraan geweekt chirurgische pad. Vervang de chirurgische pad op het bord van schuim met een verse chirurgische zeem. Beschikken over de delen van de muis die niet werden verzameld per de faciliteit ' s dierlijke verwijdering beleid.

Resultaten

Figuur 1 toont een overzicht van de operationele omgeving en Figuur 2 toont de post operatie gebied. Terwijl deze instelling de minimale hoeveelheid materiaal biedt en enscenering, individuen verkiezen kunnen om te veranderen dit best aan individuele behoeften. Het protocol moet worden geoptimaliseerd volgens de specifieke behoeften van het experiment. Deze procedure wordt uitgevoerd op een wijze die het leven van een muis, die g...

Discussie

Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Terwijl andere informele video's van muis dissecties bestaan, deze video artikel levert de eerste professionele kwaliteit, peer reviewed, visuele demonstratie van alle gedetailleerde stappen nodig zijn voor de extractie en het oogsten van de alvleesklier muis door dissectie¹⁰ . Met de alvleesklier wordt een hoofdorgel voor metabole activiteit en insuline zorgt productie, dissectie en oogsten van de alvleesklier voor het behoud van d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glass Jar	Corning	3140-150	Het glazen potje dat in de video is gebruikt, is niet meer verkrijgbaar.  Dit is de vervanger.
Lid of Glass Jar	Corning	9985-150	Het glazen potje deksel dat in de video is gebruikt, is niet meer verkrijgbaar.  Dit is de vervanger.
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	339650
Surgical Scissors	Fisher Scientific	9201
Squeeze bottle	Fisher Scientific	03-409-10DD
100% Ethanol	Fisher Scientific	22-032-103
Formalin	Fisher Scientific	245-684
Foam Boards	Therapak	562908
Forceps	Fisher Scientific	200205SHN
1 mL 21G Syringes	BD Biosciences	309624
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	339652
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-681-258
Surgical Pads	Fisher Scientific	S67011
T-Pins Length:  2"	Advance Store Products	X32T-05
Sterilizing Wipes	Professional Disposables International Inc.	Q85084
Sharps Container	Fisher Scientific	14-827-122
Analytical Balance	Marshall Scientific	ME-AE200
4L Dewar	Taylor-Wharton	4LD
Shallow Wide Mouth Dewar	Fisher Scientific	F3087-V
Floating Microtube Rack	VWR	60986-100
Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile	Fisher Scientific	10-500-25
Isothesia (Isoflurane)	Henry Schein Animal Health	050033
Liquid Nitrogen	Wright Brothers	NIT-60-XX
Mouse Kras Strain	The Jackson Laboratory	OO8179
Mouse Cre Strain	MMRRC	OOO435-UNC