Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methode voor het bestuderen van bloedplaathechting, verspreiding en afscheiding onder stroming. Dit veelzijdige platform maakt het mogelijk om bloedplaatjesfunctie te onderzoeken voor mechanistisch onderzoek naar trombose en hemostase.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bloedplaatjes zijn essentiële spelers in hemostase, de vorming van trombi om vasculaire breuken te verzegelen. Zij zijn ook betrokken bij trombose, de vorming van trombi die de vasculatuur en de verwondende organen afsluiten, met levensbedreigende gevolgen. Dit motivert wetenschappelijk onderzoek naar bloedplaatjesfunctie en de ontwikkeling van methoden om celbiologische processen te volgen als ze zich voordoen onder stromingsomstandigheden.
Er zijn verschillende stromingsmodellen beschikbaar voor het bestuderen van bloedplaatjeshechting en aggregatie, twee belangrijke verschijnselen in de bloedplaatjesbiologie. Dit werk beschrijft een methode om real-time bloedplaatjes degranulatie te bestuderen tijdens de stroom tijdens de activatie. De methode maakt gebruik van een stroomkamer gekoppeld aan een spuitpompinstallatie die onder een brede veld, omgekeerde, LED-gebaseerde fluorescentiemicroscoop wordt geplaatst. De hier beschreven beschrijving zorgt voor de gelijktijdige excitatie van meerdere fluoroforen die worden afgeleverd door fluorescent gelabelde antilichamen of fluorescerenEnt kleurstoffen. Na live-cell imaging experimenten kunnen de dekselglazen verder worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van statische microscopie ( dwz confocale microscopie of scan elektronenmicroscopie).
Inleiding
Plateletten zijn anucleate cellen die in de bloedstroom circuleren. Hun belangrijkste functie is om vaatbreuken op plaatsen van letsel te verzegelen en om bloedverlies te voorkomen. Op deze plaatsen van letsel worden subendotheliale collageenvezels blootgesteld en worden ze daarna gedekt door het multimere eiwit, von Willebrand factor (VWF). VWF interactieert met de bloedplaatjes in omloop in een mechanisme dat afhankelijk is van het glycoproteïne Ibα-IX-V complex op het celoppervlak 1 , waardoor de snelheid van de bloedplaatjes wordt vertraagd. Dit is vooral belangrijk bij hoge schuifsnelheden. De bloedplaatjes ondergaan vervolgens morfologis....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het lokale medisch ethisch comité van het Universitair Medisch Centrum Utrecht heeft de tekening van bloed voor ex vivo onderzoeksdoeleinden, waaronder die van deze studie, goedgekeurd.
1. Oplossingsvoorbereiding
- Bereid een buffer van 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) Tyrode op door 10 mM HEPES, 0,5 mM Na2 HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 en 5,55 mM D- Glucose in gedistilleerd water.
- Maak twee varianten van de buffer: stel de pH niveaus op respectievelijk 6,5 en 7,4 respectievelijk. Maak elke dag een nieuwe buffer voor experimenten. Supplement met 10 ng / mL pros....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont afbeeldingen van de stroomkamer en experimentele opstelling; De positie en afmetingen van het siliciumplaat; En buizenverbindingen. Figuur 2 geeft details over de afmetingen van de stroomkamer. Figuur 3 en Film 1 tonen een tijdsreeks beelden van plaatjeshechting en verspreiden op geïmmobiliseerde VWF. CD63 is een transmembraneiwit dat in het membraan van intracellulai.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wereldwijd is trombose een belangrijke doodsoorzaak en morbiditeit, en bloedplaatjes spelen een centrale rol bij de ontwikkeling ervan. Dit werk beschrijft een methode voor de live-celafbeelding van bloedplaatjes degranulatie onder stroming. Over het algemeen wordt aangenomen dat wanneer de bloedplaatjes geactiveerd worden alle korrelvormige inhoud direct in oplossing worden gebracht. De bijbehorende resultaten suggereren dat dit niet noodzakelijkerwijs het geval is. Tijdens adhesie en degranulatie behouden bloedplaatje.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
CM erkent financiële steun van de International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht en de Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm dikte. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haën | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house gezuiverd | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe met 14,5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok spuit |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-fenylindoldihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488-conjugaat | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 inch x 125 ft. Rol. |
| Silicone sheet niet-versterkt | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Aangepaste gesneden siliconen sheet met perfusie- en vacuümkanalen | in-house gemaakt | Gemaakt van Silicone sheet niet-versterkt (Nagor, NA 500-1) | |
| 1,5 mL buisjes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescentiemicroscoop | Zeiss Observer Z1 | Uitgerust met LED-excitatieverlichting. | |
| Microscoop software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G naald (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haën | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Kunststof pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL niet steriel, ingerold tot 3 mL. |
| Silicone buis | VWR | 228-0656 | Binnendiameter. x Buitendiameter x Wanddikte = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm. |
| Microscoopglaasjes | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, gemalen randen 45 °, ontdooid eind. |
Referenties
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013). <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
