Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

11K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55658

⸱

10 juli 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical Center Utrecht, 2Department of Pharmaceutics, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methode voor het bestuderen van bloedplaathechting, verspreiding en afscheiding onder stroming. Dit veelzijdige platform maakt het mogelijk om bloedplaatjesfunctie te onderzoeken voor mechanistisch onderzoek naar trombose en hemostase.

Samenvatting

Bloedplaatjes zijn essentiële spelers in hemostase, de vorming van trombi om vasculaire breuken te verzegelen. Zij zijn ook betrokken bij trombose, de vorming van trombi die de vasculatuur en de verwondende organen afsluiten, met levensbedreigende gevolgen. Dit motivert wetenschappelijk onderzoek naar bloedplaatjesfunctie en de ontwikkeling van methoden om celbiologische processen te volgen als ze zich voordoen onder stromingsomstandigheden.

Er zijn verschillende stromingsmodellen beschikbaar voor het bestuderen van bloedplaatjeshechting en aggregatie, twee belangrijke verschijnselen in de bloedplaatjesbiologie. Dit werk beschrijft een methode om real-time bloedplaatjes degranulatie te bestuderen tijdens de stroom tijdens de activatie. De methode maakt gebruik van een stroomkamer gekoppeld aan een spuitpompinstallatie die onder een brede veld, omgekeerde, LED-gebaseerde fluorescentiemicroscoop wordt geplaatst. De hier beschreven beschrijving zorgt voor de gelijktijdige excitatie van meerdere fluoroforen die worden afgeleverd door fluorescent gelabelde antilichamen of fluorescerenEnt kleurstoffen. Na live-cell imaging experimenten kunnen de dekselglazen verder worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van statische microscopie ( dwz confocale microscopie of scan elektronenmicroscopie).

Inleiding

Plateletten zijn anucleate cellen die in de bloedstroom circuleren. Hun belangrijkste functie is om vaatbreuken op plaatsen van letsel te verzegelen en om bloedverlies te voorkomen. Op deze plaatsen van letsel worden subendotheliale collageenvezels blootgesteld en worden ze daarna gedekt door het multimere eiwit, von Willebrand factor (VWF). VWF interactieert met de bloedplaatjes in omloop in een mechanisme dat afhankelijk is van het glycoproteïne Ibα-IX-V complex op het celoppervlak 1 , waardoor de snelheid van de bloedplaatjes wordt vertraagd. Dit is vooral belangrijk bij hoge schuifsnelheden. De bloedplaatjes ondergaan vervolgens morfologische veranderingen terwijl ze activerende impulsen ontvangen van collageen. Dit leidt tot onomkeerbare verspreiding en uiteindelijk tot aggregatie van bloedplaatjes. Beide processen zijn afhankelijk van de afscheiding van de korrelinhoud om transplantatie van bloedplaatjes-bloedplaatjes te vergemakkelijken. Bl.a. bevat plaatjes a-granules fibrinogeen en VWF om de hechting van de bloedplaatjes te ondersteunen en te overbruggenBloedplaatjes samen op integrin-afhankelijke wijze. De bloedplaatjes dichte korrels bevatten anorganische verbindingen 2 , waaronder calcium en adenosine difosfaat (ADP), die bijdragen tot het versterken van de bloedplaatjesactivering. Bovendien bevatten bloedplaatjes mediators van (allergische) ontsteking 3 , complement-controlerende eiwitten 4 en angiogenese factoren 5 , 6 , die de vragen verhogen over of en hoe deze inhoud onder verschillende omstandigheden vrijkomen.

Sinds de jaren tachtig is de studie van bloedplaatjesfunctie in stromingsmodellen waardevol geweest voor het onderzoek van trombotische mechanismen 7 . Sindsdien is veel technische vooruitgang geboekt en stromingsmodellen die fibrinvorming bevatten, worden momenteel ontwikkeld om het hemostatische potentieel van therapeutische bloedplaatjesconcentraten ex vivo 8 te bepalen of omOnderzoek de invloed van verstoringen in schuifsnelheden op trombusmorfologie 9 . De verschillen in de moleculaire en celbiologische mechanismen die stabiele hechting en fysiologische trombusvorming (hemostase) vormen tegen de pathologische trombusvorming (trombose) kunnen zeer subtiel zijn en motiveren de ontwikkeling van stromingsmodellen die de real-time visualisatie van deze subcellulaire processen.

Een voorbeeld van een proces waarvoor een dergelijke opstelling waardevol zou zijn, is de (her) verdeling van intracellulair polyfosfaat en de aanwerving van stollingsfactoren om de tijdsafhankelijke invloed op dit op fibrine-ultrastructuur 10 te ontdekken. Studies zijn vaak beperkt tot eindpuntanalyses. Het hoofddoel van de beschreven methode is het real-time visuele onderzoek mogelijk maken van dynamische subcellulaire processen die plaatsvinden tijdens de bloedplaatjesactivering onder stroming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het lokale medisch ethisch comité van het Universitair Medisch Centrum Utrecht heeft de tekening van bloed voor ex vivo onderzoeksdoeleinden, waaronder die van deze studie, goedgekeurd.

1. Oplossingsvoorbereiding

  1. Bereid een buffer van 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) Tyrode op door 10 mM HEPES, 0,5 mM Na2 HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 en 5,55 mM D- Glucose in gedistilleerd water.
    1. Maak twee varianten van de buffer: stel de pH niveaus op respectievelijk 6,5 en 7,4 respectievelijk. Maak elke dag een nieuwe buffer voor experimenten. Supplement met 10 ng / mL prostacyclin waar aangegeven.
  2. Berei TRIS-gebufferde zoutoplossing (TBS) op door 50 mM Tris en 150 mM NaCl in gedestilleerd water op te lossen en de pH aan te passen op 9,0.
  3. Bereiding van zuurcitraatdextrose (ACD) door het oplossen van 85 mM tri-natriumcitraat, 71 mM citroenzuur en 111 mM D-glucose in disBewerkte water.
  4. Bereid een fixatieve oplossing door 2% (v / v) paraformaldehyde (PFA) toe te voegen aan de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4. Verhit om te oplossen (50 - 70 ° C) en zet de pH op 7.4. Aliquot en opslaan bij -20 ° C. Ontdooien bij 37 ° C voor gebruik.
  5. Bereid blokkerende buffer door 1% (m / v) humaan serumalbumine (HSA) in HEPES Tyrode's buffer op te lossen, pH 7,4
  6. Maak een polyvinylalcoholoplossing door 4,8 g polyvinylalcohol toe te voegen aan 12 g glycerol en meng goed. Voeg 12 ml gedestilleerd water toe en laat het gedurende een nacht op een rotator staan ​​bij kamertemperatuur.
    1. Voeg 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5 toe. Verhit tot 50 ° C tijdens 30 minuten mengen. Voeg 1,25 g 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) toe en meng goed. Centrifugeer bij 1.500 xg gedurende 5 minuten. Aliquot het supernatant (1 ml is voldoende voor 15-20 glijbanen) en opslaan bij -20 ° C. Gebruik de porties een keer.

2. Voorbereiding van de glasplaat

  1. Ontvetten dekselGlazen (25 x 50 mm 2 ) door in de nacht in onverdund chromosulfurzuur te incuberen. Spoel de dekselglazen af ​​met gedistilleerd water en droog ze nachtelijk bij 60 ° C in een oven.
  2. Plak een strip van een paraffine film (10 x 15 cm 2 ) boven op een laboratoriumbank met een druppel water en verwijder de lucht door de paraffinefilm te gladden. Pipet 80 μL druppels 10 μg / ml VWF of 100 μg / ml fibrinogeen op de paraffine film. Breng de bril op de druppels; De eiwitoplossing zal zich verspreiden tussen de twee oppervlakken om de hele achterkant van het glas te bedekken. Incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur (RT).
  3. Verwijder de paraffinefilm en sluit de afdekbril door ze te plaatsen, met de gecoate zijde in een 4-putjesplaat met blokkerende buffer. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of 's nachts bij 4 ° C. Als een controle blokkeren u een afdekglas dat niet is bekleed met VWF of fibrinogeen.

3. Bereiding van bloedplaatjesrijk plasma (PRP)

  1. Verzamel gehit citroen (eindconcentratie: 0,32% natriumcitraat (M / V)) door venipunctuur.
  2. Centrifugeer het bloed gedurende 15 minuten bij 160 xg en RT zonder rem. Verzamel de supernatant ( dwz de PRP) met een plastic Pasteur pipette.
    OPMERKING: Na centrifugatie kunnen drie lagen waargenomen worden (van boven naar beneden): PRP, witte bloedcellen en rode bloedcellen. Zorg ervoor dat de witte en rode cellen niet worden opgenomen. Typisch kan 3 ml PRP worden verzameld na centrifugeren van een 9 ml bloedbuis.
  3. Ga verder naar sectie 4 als het experiment met gewassen bloedplaatjes wordt uitgevoerd. Als PRP gewenst is, ga door met de volgende stap.
  4. Na de PRP-collectie centrifugeer de rest van het bloed (met rode celpelletjes) nog 10 minuten bij 2.000 xg zonder rem. Verzamel het supernatant dat het bloedplaatjesarm plasma bevat (PPP).
    OPMERKING: Typisch kan 2 ml na deze tweede centrifugeringsstap worden verzameld.
  5. Tel het nummer van de pLateletten in de PRP op een celanalysator en verdunnen met de PPP (stap 3.4) naar een concentratie van 150.000 bloedplaatjes / μL.
    OPMERKING: Het totale volume verdund PRP hangt af van de bloedplaatjesgetal van de donor. De bloedplaatjescijfers variëren sterk tussen donoren, en PRP verdunning vereist individueel evaluatie. De bloedplaatjes tellen worden normaal beschouwd als binnen 150.000 en 450.000 bloedplaatjes / μL.
  6. Ga verder naar sectie 5.

4. Bereiding van gewassen bloedplaatjes

  1. Bepaal het gemiddelde bloedplaatvolume (MPV) in de PRP met behulp van een celanalysator.
    OPMERKING: Dit is een indicator voor bloedplaatjesvooractivering 11 . Een normale MPV voor rustende bloedplaatjes is 7,5-11,5 fL 11 . De MPV moet niet met meer dan 1,5 fL toenemen tijdens de bloedplaatjeswasprocedure.
  2. Voeg een 1/10 volume ACD toe aan PRP om te voorkomen dat bloedplaatjes vooractiveren en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem. Verwijder de suPernatant en zorgvuldig opnieuw pelletten in de buffer van HEPES Tyrode, pH 6,5, op het oorspronkelijke volume PRP.
  3. Doe een aliquot van prostacyclin op door TBS toe te voegen aan een concentratie van 10 μg / ml; Hou het op ijs.
  4. Om bloedplaatjesactivering te voorkomen, voeg prostacyclin bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng / ml toe aan de opnieuw gesuspendeerde bloedplaatjes en centrifugeer onmiddellijk gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem. Verwijder de supernatant en verwijder de pellet zorgvuldig in de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4.
  5. Tel het aantal bloedplaatjes (stap 3.5) en bepaal de verandering in MPV (stap 4.1) (de MPV mag niet meer dan 1,5 fL veranderen).
  6. Pas het aantal bloedplaatjes aan met de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, tot een concentratie van 150.000 bloedplaatjes / μL. Laat de bloedplaatjes voor 30 minuten bij RT voor de experimenten herstellen. Gebruik gewassen bloedplaatjes voor experimenten binnen 4 uur na isolatie.

5. Samenstelling van de vloerkamer

OPMERKING: Deze experimenten maken gebruik van een eigen ontwikkelde stroomkamer 12 . Een verscheidenheid van in de handel geproduceerde stroomkamers kunnen gebruikt worden, zolang ze een afdekglas kunnen bevatten, welke bij voorkeur verwijderbaar is voor verdere analyses. De stroomkamer die wordt gebruikt voor de beschreven experimenten is gemaakt van poly (methylmethacrylaat) om precies te passen bij een microscoop-invoegtrap. Het bevat een inlaat en uitlaat ( Figuur 1A - C ; 1, 2), evenals een vacuümverbinding ( Figuur 1A en C ; 3). Een op maat gemaakte siliconenplaat ( Figuur 1A en D ; 4) wordt bovenop geplaatst. Twee uitsnijdingen vormen vacuümkanalen ( Figuur 1A en D ; 5) om het afdekglas ( figuur 1A ; 6) stevig aan de kamer te bevestigen. Een centrale uitsnijding vormt het stroomkanaal ( Figuur 1A En D ; 7; 2,0 mm breedte en 0,125 mm hoogte). De inlaat en de uitlaat zijn aangesloten op het stroomkanaal en het vacuüm is verbonden met het vacuümkanaal.

  1. Bedek de bovenkant van de stroomkamer met gedestilleerd water en plaats de aangepaste siliconenplaat met de gladde kant naar beneden op het water. Vloeien het vel in de positie door het overtollige water te verwijderen, terwijl het vel op zijn plaats blijft.
    OPMERKING: Deze siliconenplaat is opnieuw bruikbaar (siliconen staat bekend om zijn inerte eigenschappen); Over het algemeen zijn bloedplaatjes niet waargenomen om eraan te hechten. De lakens kunnen met reinigingsmiddel worden gereinigd en opnieuw gebruikt worden totdat het materiaal beschadigd raakt ( dwz scheuren, vooral in het gebied tussen kanalen). Over het algemeen kan een vel 20 dagen worden gebruikt met meerdere experimenten per dag.
  2. Incubeer de stromingskamer gedurende 1 uur bij 60 ° C om het restwater te verdampen om het siliconenplaat stevig vast te houden aan de stromingskamer.
  3. Met een plastic Pasteur pipette, voeg een druppel vanHEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, op het stroomkanaal. Plaats het afdekglas (zie sectie 2) met de bedekte zijde naar beneden, op de stroomkanaal. Bevestig de vacuümpomp aan de vacuümaansluiting ( figuren 1A en C ; 3). Dien ~ 10 kPa druk toe.

6. Pre-kleuring van de bloedplaatjes en bereiding van de antilichamen

  1. Bloedplaatjes kleuring
    1. Incubeer de gewassen bloedplaatjes met 10 μg / ml DAPI gedurende 30 min bij 37 ° C in het donker. Om onbound DAPI te wassen en om bloedplaatjesactivering te voorkomen, voeg prostacyclin toe bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng / mL en onmiddellijk centrifugeer gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem.
    2. Herstel de bloedplaatjespelletjes in de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, tot een bloedplaatjesconcentratie van 150.000 bloedplaatjes / μL.
  2. Bereiding van antilichamen
    1. Meng biotine-gemerkt antilichaam met Alexa-gelabelde strepTavidin bij een molverhouding van 1: 1. Incubeer gedurende minimaal 10 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik (stap 7.6).
      OPMERKING: De efficiëntie van biotine-etiketten kan variëren tussen verschillende partijen. Mochten er problemen zijn met de visualisatie van doelmoleculen, zouden controle experimenten moeten worden uitgevoerd om succesvolle biotinylatie te bevestigen, evenals de doelbindende eigenschappen van het specifieke biotinyleerde antilichaam.

7. Perfusie

  1. Start de fluorescentiemicroscoop, evenals de microscoopsoftware. Gebruik de microscoopinstellingen die in tabel 1 zijn vermeld .
    OPMERKING: Start de microscoop- en opname-instellingen voor de live-cel visualisatie en opname van de bloedplaatjes en de gekozen fluorescent gelabelde antilichamen en / of kleurstoffen door een passend experiment in de microscoopsoftware te laden. Voer flow experimenten uit bij RT.
  2. Blok de inlaatbuizen door een 10 ml spuit aan de buis te koppelen en 1% HSA bloeien te aspirerenBuffer in de inlaatbuizen. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT. Spoel de inlaatbuizen door HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, in de inlaatbuis te suggen.
  3. Verbind de geblokkeerde inlaatbuizen en de onbehandelde uitlaatpijp, beide met een diameter van 1,02 mm en een lengte van ~ 20-30 cm naar de inlaat en uitlaat van de kamer. Sluit een 10 ml spuit (of lager volume voor meer nauwkeurigheid) aan op de uitlaatpijp. Zet de spuitpomp aan.
    OPMERKING: De diameter van de injectiespuit in combinatie met de door de pomp ingestelde stroomsnelheid bepaalt de volumetrische stromingssnelheid. Samen met het oppervlak van het stromingskanaal kan de schuifsnelheid berekend worden volgens de formule 13 hieronder. Het is dus mogelijk om de schuifsnelheid te manipuleren door de stromingssnelheid van de spuitpomp te veranderen of de afmetingen van het stromingskanaal te wijzigen. Een schuifsnelheid van 800-1,600 s -1 typisch modellen voor arteriële bloedstroom, terwijl 25-100 s-1 modellen voor veneuze bloedstroom. Voor deze opstelling resulteert een stromingssnelheid van 7,5 μl / min in een schuifsnelheid van 25 s -1 .
    Schuifsnelheid = 6Q / h 2 w in s -1
    Waarin: Q = volumetrische stroming (ml / s), h = hoogte kanaal (cm) (0,0125 cm, dit is de dikte van het siliconenblad), w = breedte kanaal (cm) (0,2 cm in deze kamer).
  4. Leg een druppel onderdompelingsolie op een 100x objectief (totale versterking van 1.000X) en plaats de kamer op de microscoop met het glazen oppervlak naar beneden.
  5. Plaats de toevoerslang in een buis die de buffer van HEPES Tyrode bevat, pH 7,4. Haal de zuiger van de spuit die met de uitlaatpijp is aangesloten, handmatig door en trek de oplossing door de kamer om de lucht van het systeem te verwijderen. Plaats de spuit in de spuitpomp ( Figuur 1B en C ; 8) en draai de pomp kort om de plunjer vast te zetten en stabiliteit te waarborgen.
  6. Antilichamen en / of kleurstoffen toevoegen aan de bloedplaatjesuspensie of PRP zorgvuldigMeng met een plastic pipet en laat het mengsel overbrengen naar een 1,5 ml buis.
    OPMERKING: Voor een typische perfusie van 30 minuten bij schuifsnelheid 25 s-1 (7,5 μl / min) is een minimum van 225 μl bloedplaatjesuspensie nodig. De antilichamen die gebruikt worden voor de representatieve resultaten worden getoond in Tabel 2 .
  7. Verplaats de inlaatbuis, terwijl u uit de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, drukt, naar een 1,5 ml buis die PRP of de gewassen bloedplaatjes en de antilichamen en / of kleurstoffen bevat ( Figuur 1B en C ; 9).
    OPMERKING: Het is belangrijk dat bij het overbrengen van de buis de buis wordt geperst (druk uit de lucht) om te voorkomen dat lucht in de buis komt. Het is mogelijk om hechtende bloedplaatjes te behandelen met een verscheidenheid van reagentia in een volgende stap door de inlaatbuis op een andere buis op een soortgelijke wijze te verplaatsen. Een lijst van potentieel nuttige reagentia is verschaft in tabel 3 .
  8. Selecteer de "live visualizatioN "optie in de software, focus de microscoop op het oppervlak van het gecoate dekselglas en start de pomp met een schuifsnelheid van 1.600 s-1 (484 μL / min) tot de bloedplaatjes de stroomkamer bereiken. Op dit moment, Verminder de afschuifsnelheid tot 25 s-1 door de instellingen van de spuitpomp te veranderen tot een stromingssnelheid van 7,5 μL / min.
  9. Controleer het oppervlak van de gecoate zijde van het afdekglas, wacht tot het eerste plaatje begint te kleven, focus de microscoop op dit plaatje en start met opname door het experiment in de software te starten. Zie tabel 1 voor de opname instellingen die hier worden gebruikt.
  10. Volg de live opname visueel. Stop na 30 minuten de spuitpomp.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de bloedplaatjes in de loop van het experiment in focus blijven. Typisch bevestigen 20-30 bloedplaatjes in het zichtveld bij een vergroting van 1000X; Dit is ongeveer 2.000-3.000 bloedplaatjes in het hele stroomkanaal.
  11. Fixatie met behulp vanDe stroomkamer (optioneel).
    1. Wanneer de stroom is gestopt na het stoppen van de spuitpomp, moet u de inlaatleiding (luchtvrij) overbrengen naar de fixatieoplossing. Start de pomp opnieuw op en voer de fixatiebuffer door het kanaal gedurende tenminste 10 minuten bij dezelfde doorvoersnelheid als vermeld in stap 7.8.
  12. Verwijder de kamer uit de microscoop, reinig de onderdompelingsolie uit het glas, ontkoppel het vacuüm en verwijder het dekselglas zorgvuldig uit de kamer met een 18 G-naald.
    OPMERKING: Voorkom dat het afdekglas het siliconenplaat breekt en beschadigt.
  13. Plaats de afdekplaat (met de cellen naar boven gericht) in een 4-putjesplaat boven op een weefsel, vooraf bevochtigd met gedestilleerd water.
    OPMERKING: dit voorkomt dat het afdekglas zich vasthoudt aan het putoppervlak en dat het drogen voorkomt.
  14. Pipetteer 750 μL fixatieve oplossing bovenop het afdekglas en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Indien de monsters niet direct kunnen worden geanalyseerd,Bewaar ze in 0,5% PFA (verdund met HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4) bij 4 ° C om stabiele fixatie te waarborgen. Ga verder naar sectie 8 om het afdekglas te verwerken voor beeldvorming.
  15. Na gebruik, spoel de kamer, buizen en vel met gedestilleerd water en incubeer de nacht in een wasmiddeloplossing. Vóór het opnieuw gebruiken van de kamer en andere onderdelen, spoelen met gedestilleerd water.
  16. Bewaar de microscoop ruwe gegevensbestanden die alle metagegevens bevatten. Indien nodig, exporteer de films naar .MOV, h.264 gecomprimeerd of .AVI ongecomprimeerd. Sla afzonderlijke frames op als JPEG- of TIF-bestanden.

8. Voorbeeld Bereiding voor Confocal Fluorescentie Microscopie

  1. Breng de dekselglazen over naar nieuwe 4-putjesplaten en spoel 5 keer met 3 ml HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4. Voeg 3 ml / putje blokkerende buffer toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
  2. Verwijder de blokkerende buffer; Voeg 3 ml / putje van 0,15% glycine (M / V) in HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4; En incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
  3. Verwijder glycineoplossing en was 5 keer in 3 ml / putje blokkerende buffer. Optioneel voeg fluorofore-geconjugeerde antilichamen toe die verdund zijn in blokkerende buffer voor extra kleuring. Incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.
  4. Was 5 keer met blokkeerbuffer en 2 keer met gedestilleerd water. Droog het glas door overtollige vloeistof te verwijderen met een weefsel (vanaf de randen naar binnen), zonder de cellen aan te raken.
  5. Pipet 60 μL polyvinylalcoholoplossing op een microscoopschuif. Leg het dekselglas, met de cellen naar boven, op de druppel en laat de polyvinylalcohol tussen de twee oppervlakken verspreiden. Incubeer 's nachts bij RT in het donker.
  6. Analyseer de cellen door middel van confocale microscopie 14 .
  7. Sla de ruwe gegevensbestanden op van de opgenomen stapelgegevens die alle metagegevens bevatten. Indien nodig, verwerk de ruwe gegevensbestanden naar MOV, H.264 gecomprimeerde of .AVI gecomprimeerde bestanden. Sla aparte stapels op als JPEG- of TIF-bestanden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont afbeeldingen van de stroomkamer en experimentele opstelling; De positie en afmetingen van het siliciumplaat; En buizenverbindingen. Figuur 2 geeft details over de afmetingen van de stroomkamer. Figuur 3 en Film 1 tonen een tijdsreeks beelden van plaatjeshechting en verspreiden op geïmmobiliseerde VWF. CD63 is een transmembraneiwit dat in het membraan van intracellulai...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wereldwijd is trombose een belangrijke doodsoorzaak en morbiditeit, en bloedplaatjes spelen een centrale rol bij de ontwikkeling ervan. Dit werk beschrijft een methode voor de live-celafbeelding van bloedplaatjes degranulatie onder stroming. Over het algemeen wordt aangenomen dat wanneer de bloedplaatjes geactiveerd worden alle korrelvormige inhoud direct in oplossing worden gebracht. De bijbehorende resultaten suggereren dat dit niet noodzakelijkerwijs het geval is. Tijdens adhesie en degranulatie behouden bloedplaatje...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

CM erkent financiële steun van de International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht en de Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) VWR441476L
Na2HPO4SigmaS-0876
NaClSigma31434
KClSigma31248
MgSO4Merck KGaA1.05886
D-glucoseMerck KGaA1.04074
Prostacyclin Cayman Chemical18220
Tri-sodium citrateMerck KGaA1.06448
Citric acid Merck KGaA1.00244
Cover glassesMenzel-GläserBBAD02400500#A24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm dikte.
Chromosulfuric acid (2% CrO3)Riedel de Haën07404CAS [65272-70-0].
Von Willebrand factor (VWF)in-house gezuiverd
FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesFIB3L
4 well dish, non-treatedThermo Scientific267061
Human Serum Albumin Fraction VHaem Technologies Inc.823022
Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%Greiner Bio-One455322
Cell analyser Abbott DiagnosticsCELL-DYN hematology analyzer
ParaformaldehydeSigma30525-89-4 
Syringe pumpHarvard Apparatus, Holliston, MAHarvard apparatus 22
10 mL syringe met 14,5 mm diameterBD biosciences305959Luer-Lok spuit
Anti-CD63-biotin Abcam AB134331
Anti-CD62P-biotin R&D SystemsDy137
4’,6-Diamidino-2-fenylindoldihydrochloride (DAPI)Polysciences Inc. 9224
Streptavidin, Alexa Fluor 488-conjugaatThermo ScientificS11223 
Immersion oilZeiss444963-0000-000
Detergent solutionUnilever, Biotex
GlycineSigma56-40-6 
Polyvinyl alcoholSigma9002-89-5Mowiol 40-88.
Tris hydrochlorideSigma1185-53-1 
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)Sigma280-57-9
Sheep Anti-hVWF pAbAbcam AB9378
Alexa fluor 488-NHSThermo ScientificA20000
GlycerolSigma-Aldrich15523-1L-R
Parafinn filmBemisPM-9964 inch x 125 ft. Rol.
Silicone sheet niet-versterktNagorNA 500-1200 mm x 150 mm x 0.125 mm.
Aangepaste gesneden siliconen sheet met perfusie- en vacuümkanalenin-house gemaaktGemaakt van Silicone sheet niet-versterkt (Nagor, NA 500-1)
1,5 mL buisjesEppendorf AGT9661-1000AE
FluorescentiemicroscoopZeiss Observer Z1 Uitgerust met LED-excitatieverlichting.
Microscoop softwareZeiss ZEN 2blue edition
18 G naald (18 G x 1 1/2")BD biosciences305196
NaClRiedel de Haën31248375
TrisRoche10708976
Kunststof pasteur pipetVWR612-1681 7 mL niet steriel, ingerold tot 3 mL.
Silicone buisVWR228-0656Binnendiameter. x Buitendiameter x Wanddikte = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.
MicroscoopglaasjesThermo ScientificABAA000001##12E76 x 26 x 1 mm, gemalen randen 45 °, ontdooid eind.

Referenties

  1. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  2. Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).
  3. May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
  4. Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
  5. Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
  6. Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
  7. Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
  8. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
  9. Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
  10. Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
  11. Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
  12. Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
  13. Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
  14. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
  15. Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
  16. Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
  17. Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
  18. Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
  19. Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Stroomkamerisolatie van bloedplaatjesfluorescentiemicroscopieconfocale microscopieactivatie van bloedplaatjesvon Willebrand factorP selectine mobilisatieCD63 oppervlakseexpressie
Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.