Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Summary

We beschrijven hier protocollen voor het meten van antilichaam-antigeen-bindende affiniteit en kinetiek met vier gebruikelijke biosensor platforms.

Abstract

Label-vrije optische biosensoren zijn krachtige hulpmiddelen in drug discovery voor de karakterisering van biomoleculaire interacties. In deze studie beschrijven we het gebruik van vier routinematig biosensor platforms in ons laboratorium om de bindingsaffiniteit en kinetiek van tien hoge affiniteit monoklonale antilichamen (mAbs) tegen humaan subtilisine proprotein convertase Kexin Type 9 (PCSK9) te evalueren. Terwijl zowel Biacore T100 en Proteon XPR36 zijn afgeleid van de gevestigde Surface Plasmon Resonance (SPR) technologie, de eerstgenoemde vier stroomcellen verbonden door seriële stroom configuratie, terwijl laatstgenoemde stelt 36 reactiemengsel spots in parallel via een geïmproviseerde 6 x 6 kruiselings microfluïdische kanaalconfiguratie. IBIS MX96 werkt ook op basis van de SPR sensortechnologie, met een extra imaging functie die detectie bepaalt ruimtelijke oriëntatie. Deze detectietechniek combinatie met de continue toediening Microspotter (CFM) breidt de doorvoersnelheid pernabling multiplex matrix printen en detectie van 96 reactie sport tegelijkertijd. Daarentegen wordt het Octet RED384 basis van de BioLayer interferometrie (BLI) optisch principe met optische probes als de biosensor aan interferentiepatroon detecteren verandert na binding interacties op het tipoppervlak. In tegenstelling tot de SPR-gebaseerde platforms, heeft de BLI-systeem niet vertrouwen op continue stroom fluidics; in plaats daarvan de sensor tips verzamelen metingen terwijl ze in analytoplossingen van een 384-putjes microplaat worden ondergedompeld tijdens orbitaal roeren.

Elk van deze biosensor platforms heeft zijn eigen voor- en nadelen. 1 moleculair interactiemodel: een directe vergelijking van het vermogen van deze instrumenten om kwaliteit kinetische gegevens, de beschreven protocollen illustreren experimenten die dezelfde test formaat en dezelfde hoge kwaliteit reagens om antilichaam-antigen kinetiek die de simpele 1 stop karakteriseren bieden .

Introduction

De acquisitie van betrouwbare kinetische parameters voor het karakteriseren van antilichaam-antigeeninteracties is een essentieel onderdeel van het proces van geneesmiddelontdekking en -ontwikkeling¹. Optische Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensoren, de 'gouden standaard' voor real-time detectie van deze interacties, worden al ongeveer twee decennia gebruikt om de vroege selectie van criteria-volgende therapeutische antilichaamkandidaten mogelijk te maken^2,3. Naast het verstrekken van een affiniteitsranglijst van antilichaamkandidaten door snelle bindingsscreening van ruwe supernatanten⁴ en rigoureuze bepalingen van kinetische constanten van gezuiverde preparaten⁵, kunnen biosensoren de functionele activiteit van leadkandidaten verder differentiëren via epitope binning studies^6,7.

Om aan de groeiende vraag naar antilichaamgebaseerde producten voor verschillende therapeutische indicaties⁸ te voldoen, is er de afgelopen jaren een breed scala aan innovatieve biosensorinstrumenten ontwikkeld die de efficiëntie van kandidaatidentificatie en -karakterisering verhogen^9,10. Deze instrumenten verschillen in ontwerp van de microfluïdische kanaalconfiguratie en/of in de optische principes die betrokken zijn bij het detecteren van biomoleculaire interacties. Specifiek hebben de Octet RED384¹¹, ProteOn XPR36¹² en IBIS MX96⁷ het aantal interacties gemeten in een enkele bindingscyclus uitgebreid naar respectievelijk 16, 36 en 96, wat een significante doorvoerverbetering betekent ten opzichte van het traditionele Biacore-platform. Hoewel deze verschillende biosensorplatforms allemaal essentiële kinetische gegevens leveren voor het karakteriseren van antilichaam-antigeeninteracties, verschillen ze in experimentele opstelling en operationele procedures vanwege variaties in instrumentele configuraties. Bijvoorbeeld, in de SPR-beeldarrayplatform van IBIS MX96, wordt de multiplex ligand-immobilisatie stap uitgevoerd in een offline modus in een extern afdrukapparaat gescheiden van de detector^7,13; in tegenstelling, de andere drie biosensorplatforms gebruiken een 'all-in-one' setup, waarbij het toevoegen van componenten op het sensoroppervlak, of het nu de activeringsreagens, ligand of analyt is, in real-time en door voorgeprogrammeerde commando's in sequentiële volgorde wordt geregistreerd. In de Octet RED384 is een uniek kenmerk van dit BioLayer Interferometry (BLI)-gebaseerde platform de beschikbaarheid van voorgecoate optische vezelbiosensoren voor onmiddellijk 'dip-and-read' gebruik¹⁴, waardoor de noodzaak voor ligandoppervlaktevoorbereiding en initiërings-/conditioneringsstappen wordt geëlimineerd, die vaak vereist zijn voor de sensorchips in SPR-gebaseerde platforms. Het vloeistof-vrije ontwerp van dit instrument vereenvoudigt ook de mechanica en vermijdt verstoppingen en besmettingszorgen bij het omgaan met ruwe monsters. Met het nieuwe 6 x 6 kriskras vloeistofontwerp in de ProteOn XPR36, kan een 'one-shot' kinetische aanpak worden geïmplementeerd door het schakelen van de stroomkanalen tussen horizontale en verticale richtingen om 36 interactieplekken te creëren¹⁵. In plaats van bindingskinetiek te beoordelen voor één ligand of analytconcentratie per keer, zoals in het traditionele seriële flow Biacore T100-platform, biedt deze aanpak de mogelijkheid om tot 36 verschillende interacties tegelijkertijd in een enkele bindingscyclus te monitoren.

Ondanks hun verschillen worden deze vier biosensorplatforms allemaal wereldwijd veel gebruikt door veel laboratoria. Voor nieuwe gebruikers met weinig praktische ervaring met biosensoren kan het beslissen welk instrument te gebruiken een uitdagende taak zijn, gezien de verschillen in instrumenteel ontwerp. Om het meest geschikte instrument voor hun onderzoeksdoeleinden te bepalen, moeten factoren zoals datakwaliteit, consistentie van prestaties, doorvoer, gebruiksgemak en materiaalverbruik collectief worden overwogen. Terwijl verschillende benchmarkstudies de variabiliteit van kinetische snelheidsconstanten verkregen uit meerdere laboratoria en biosensoren hebben onderzocht^5,16, heeft een recent gepubliceerd head-to-head vergelijkingsonderzoek verder de systematische factoren aangepakt die de gegevensbetrouwbaarheid beïnvloeden vanuit het oogpunt van instrumentele prestaties^17,18. De protocollen die in deze video worden geleverd, richten zich in detail op de experimentele opstelling en procedures, en gaan vergezeld van het onderzoeksartikel getiteld 'Vergelijking van biosensorplatforms in de evaluatie van hoge affiniteit antilichaam-antigeenbindingskinetiek'¹⁷. Deze protocollen zijn niet alleen bedoeld om nieuwe biosensorgebruikers te helpen deze instrumenten te implementeren voor hun onderzoeksdoeleinden, maar ook om aanvullende inzichten te bieden voor huidige biosensorgebruikers met betrekking tot technische uitdagingen en overwegingen in experimentele ontwerpen voor het evalueren van hoge-affiniteit antilichaam-antigeeninteracties.

Protocol

1. Eiwitten en antilichamen

1. Produceren en zuiveren van het humane pro-proteïne convertase subtilisine Kexin Type 9 (PCSK9) en tien muizen afgeleide mAbs tegen PCSK9 zoals eerder beschreven ^17.
2. Beoordeel de zuiverheid van de gezuiverde producten door achtereenvolgens te injecteren 10 ug van elk monster in een kolom analytische grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met gebruik van een UPLC systeem ^19.

2. Kinetic Metingen in de Biacore T100

1. Instrument en reagens Bereiding
   1. Equilibreer de CM5 sensor chip bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   2. Ontdooi twee 200 pi aliquots van 200 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) en twee 200 pi aliquots van 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) bij kamertemperatuur.
   3. Bereid een 1 liter fles 1 x HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA en 0,005% v / v polysorbaat P20) loopbuffer met diLuting 10x HBS-EP + voorraadoplossing in water.
   4. Bereid 1 ml proteïne A / G op 30 ug / ml in 10 mM natriumacetaat (pH 4,5) en 500 pl van elk mAb monster bij 0,063 ug / ml in HBS-EP loopbuffer. Ontdooi een bevroren flesje van menselijke PCSK9 op ijs.
   5. In de besturingssoftware, klikt u op "Extra | Eject Chip", plaatst u de sensor chip in de schede en sluiten. Klik op "Extra | Stel Temperature", voert u "25" ° C als de analyse temperatuur en de "10" ° C als de temperatuur in.
2. Surface Immobilisatie
   1. In de besturingssoftware, klikt u op "File | Open / Nieuw Template Wizard" en selecteer "immobilisatie" uit de lijst in het linker paneel.
   2. Klik op "Nieuw" om de immobilisatie instellingsvenster openen. Kies "CM5" zoals de chip-type en selecteer "1" doorstroomcel per cyclus.
   3. Vink het vakje aan naast elke "Immobiliseer stroom cel 1/2/3/4" naar activaTé de opties. Kies "Doel voor geïmmobiliseerd level" en "Amine" als de methode voor alle stroom cellen.
   4. Enter "30 ug / mL ProA / G" als ligand voor dat de streefwaarde is ingesteld op "10000" reactie-eenheden (RU) voor alle stromingscellen.
   5. Check "Prime vóór run", en klik op "Next". Selecteer "Reagent Rack 2", definieert de locatie van de reagentia en pipet in afzonderlijke monsterbuizen dienovereenkomstig. Plaats het rek terug in het instrument en klik op "Start" en voer een experiment naam worden opgeslagen in de run te starten.
3. Analyt Binding en regeneratiekringlopen
   1. Klik op "File | Open / New Method", selecteer "20140812 hu anti-PCSK9 IgG binding aan hu PCSK9" en de methode te openen. Geef je mening over de parameters in de methode.
   2. In "teststappen", zorgen er 10 cycli waarbij "hu PCSK9" is de naam van "Monster" gekozen "Purpose". De identieke getal is ingesteld op '1'.
   3. In "Cycle types", stelt de contacttijd op "220" vanwege Capture 1 via stroompad "2", "110" vanwege Capture 2 via stroompad "3" en "55" vanwege Capture 3 over stroompad "4". De stroomsnelheid is "10" uL / ​​min voor het vangen cycli.
   4. Selecteer "Monster 1" Controleer "Monsteroplossing" als variabele. Stel de contacttijd met "600" en de dissociatie tijd "2700" voorbij stroompad "1, 2, 3, 4". De stroomsnelheid is ingesteld op "30" ul / min.
   5. Selecteer "Regeneratie 1", voer "Glycine-HCl pH 1,5" op het gebied oplossing en stel de contacttijd "20" voorbij stroompad "1, 2, 3, 4".
   6. In "Variable Settings" Voer 2-voudig titreren concentraties van "100 nM - 6,25 nM" voor Cycle 1-3, "50 nM - 3.12 nM" voor Cycle 4-8 en "5 nM - 0,323 nM" fof Cycle 9-10.
   7. In "Setup Run", kies de detectie stroomweg "2-1, 3-1, 4-1", klikt u op "Next", vink "Prime vóór run", en klik op "Next".
   8. Selecteer "monster en reagens rek 1" dienovereenkomstig bepalen de locatie van de reagentia en pipet in afzonderlijke monsterbuizen. Plaats het rek in het instrument en klik op "Start" en voer een experiment naam worden opgeslagen in de run te starten.
4. Data-analyse met behulp van BIAevaluation
   1. Klik op "Kinetics / Affinity | Surface gebonden", kies Fc "2-1", "3-1" of "4-1" apart en laat U alle van de weergegeven curven uit de verschillende analytconcentraties evenals de "nul" concentratie leeg.
   2. Klik op "Next" om de buffer leeg afgetrokken curves te verkrijgen. Klik vervolgens op "Kinetics", kies dan de "1: 1 Binding" model, en klik op "Fit" om de kinetische ingerichte Parame verkrijgenters.
   3. Voor de wereldwijde aanbrengen van meerdere mAb oppervlakken op "Multiple _max R" aan de onderkant en de bindcurves toevoegen van andere Fcs voor hetzelfde mAb aan de lijst.
   4. Klik op "Next" om alle van de buffer blanco afgetrokken bindcurves verkrijgen. Klik vervolgens op "Kinetics," kies "1: 1 Binding" model, en kies "fit lokale" voor elke R _max in de parameters om de wereldwijd voorzien van kinetische parameters te verkrijgen.

3. Kinetische metingen in het Proteon XPR36

1. Instrument en reagens Bereiding
   1. Equilibreren een GLM sensorchip en 2-L fles PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% Tween-20 en 3 mM EDTA) loopbuffer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   2. In de besturingssoftware, klikt u op "Eject" en voeg dan de GLM chip. Stel de chip temperatuur "25" ° C en de temperatuur autosampler "10" ° C.Klik op "glycerol Initialisatie" en volg de aanleiding instructies om de chip te initialiseren.
   3. Klik op "File | Open" a preconditionering protocol uit de lijst, worden de oplossingen in een 96-wells plaat. Klik vervolgens op "Run", selecteert u het protocol en klik op "Start".
   4. Ontdooien een 1 ml portie van 400 mM EDC en een 1 mL aliquot van 100 mM N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) bij kamertemperatuur.
   5. Bereid 2 ml proteïne A / G 60 ug / ml in 10 mM natriumacetaat (pH 4,5) en 500 pl van elk mAb monster bij 0,25 ug / ml, 0,125 pg / ml en 0,063 ug / ml in PBS-T EDTA loopbuffer. Ontdooi een bevroren flesje van menselijke PCSK9 op ijs.
2. Immobilisatie Analyt Binding en Regeneration
   1. Klik op "File | New | Nieuwe Protocol". In "Configuration", voer de experimentnaam Selecteer "GLM" chip select "Microplates" en voert "2,2" ml volume.
   2. kiezen"Protocols | Samples", definieert "EDC / sulfo-NHS" of "activator" in putjes H1-H6, "proteïne A / G" of "ligand" in G1-G6, "Ethanolamine" als "deactivator" in F1-F6 , "Glycine" als "regenerator" in het E1-E6, PBS-T-EDTA "of "Blanco" in D1-D6, "mAb X sample" of "ligand" in C1-C6 en "menselijke PCSK9" of" analyt in putjes H1-H6 in een tweede plaat met 96 putjes.
   3. Selecteer "stappen" dubbelklikken "immobilisatie" in het "Protocol Editor", de stappen omvat drie opeenvolgende horizontale injecties van EDC / sulfo-NHS, proteïne A / G en 1 M ethanolamine elk bij een stroomsnelheid van "30" pi / min en een contacttijd van "300" s.
   4. Klik "Regenereren", injecteren drie "18" -s pulsen van glycine (pH 1,5) bij "100" pl / min in zowel de horizontale als verticale richtingen, gevolgd door twee "60" -s pulsen PBS-T-EDTA "25" pl / minook in beide richtingen.
   5. Klik "Ligand" Injecteer mAb 1 mAb 2 in verticale richting, waarbij een stroomsnelheid van "25" ul / min en een contacttijd van "160" s.
   6. Klik "Analyt", injecteren vijf concentraties humaan PCSK9 (100 nM tot 6,25 nM in 2-voudige seriële verdunningen) en een blanco buffer op 6 horizontale kanalen tegelijk op "40" uL / ​​min voor "600" en associatie tijd gevolgd door "2700" s van dissociatie tijd.
   7. Klik "Regenereren", injecteren twee "18" -s pulsen van glycine (pH 1,5) bij "100" pl / min in zowel de horizontale als verticale richtingen.
   8. Herhaal de bovenstaande stappen na elke bindcyclus voor de resterende mAbs.
      LET OP: In aanvulling op de 100 nM - 6,25 nM menselijk PCSK9 concentratie series, 25 nM - 1,56 nM en 5 nM - 0,313 nM concentratie serie worden gebruikt.
   9. Bereid de monsters en reagentia in twee platen met 96 putjes volgens de reagenspositiesgedefinieerd in stap 3.2.2, klik op het tabblad "Run", selecteert u het protocol / experiment en klik op "Start".
3. Data-analyse met behulp van Proteon Manager
   1. Klik op "Panel Type" en selecteer "Analyt". Klik vervolgens op "Protocol Step" en selecteer alle binding bochten in de lijst.
   2. Klik op "Auto verwerking", en klik op "Process | Channel Reference | Interspot". Klik vervolgens op "Process | Double Reference | Row | A6".
   3. Klik op "Create Dataset" naar individuele datasets te sparen voor elke mAb bij alle drie vlakken voor kinetische analyse.
   4. Klik op "Analysis Dataset", markeert elk mAb dataset en klik op "Analyse | Kinetic". Kies "Langmuir" -model en "Gelijktijdig ka / kd" en klik op "Next".
   5. Markeer zowel de associatie en dissociatie fit bereik, kiest u "Local" R _max, en klik op "Next" om de pasvorm te voeren voor het verkrijgen vande gemonteerde kinetische parameters.
   6. Herhaal de bovenstaande stappen maar kies "gegroepeerde" _Rmax voor montage op de experimentele _Rmax bij berekening ligand oppervlakteactiviteit te verkrijgen.

4. Kinetische metingen in het Octet RED384

1. Reagens en monsterplaat Bereiding
   1. Bereid 50 ml 1x KB (Kinetic buffer bevattende PBS pH [7,4], 0,02% Tween-20, 0,1% albumine en 0,05% natriumazide) door verdunning van een 10x voorraadoplossing in PBS.
   2. Afzien de 1x KB in een 96-puts plaat bij 200 ul per putje. 48 hydraat anti-humaan capture (AHC) biosensor tips in deze afzonderlijke putjes gedurende ten minste 10 min.
   3. Bereid elk mAb monster bij 20 ug / ml, 10 ug / ml en 5 ug / ml in 1 x KB, alsook menselijke PCSK9 7 getitreerde concentraties van 100 nM tot 1,56 nM in 2-voudige seriële verdunningen.
   4. Laad het mAb monsters in een 384 putjes schuine bodem microplaat (afbeeldrred als het reagens Plate) en de humane PCSK9 oplossingen in een andere 384-well microplaat (aangeduid als de monsterplaat) 90 ul per putje.
   5. Load reeks 1x KB en glycine (pH 1,5) oplossing in putjes in de monsterplaat.
      LET OP: Deze 1x KB putten worden gebruikt voor de chip voorbehandeling basislijn stabilisatie, en te analyseren dissociatie. De glycine-oplossing wordt gebruikt voor regeneratie.
2. Experimentele werkwijze Setup
   1. In de data-acquisitie software, klikt u op "Experiment | New Experiment Wizard | New Kinetics Experiment | Basic Kinetics".
   2. In "Plaat Definition", als volgt te werk om het type monster en posities te bepalen.
      1. Selecteer "16" kanalen en "384-well" formaat.
      2. Definieer het monster en reagens locaties in de plaat weergave door de Shift-toets ingedrukt terwijl de linkermuisknop te klikken ingedrukt te houden bij de bron tot en met 16 putten tegelijk te laten oplichten.
      3. Klik met de rechtermuisknop op deputjes die het mAb monsters en selecteer "Load" naar de stap waar de mAbs worden geladen (of gevangen) op de AHC sensoren betekenen. Voer het mAb namen en concentraties in de tabel aan de rechterkant.
      4. Recht op de putjes die het humane PCSK9 en selecteer "monster" naar de stap waarbij het mAb ingevangen sensoren gedompeld en bindingsinteracties worden gemeten geven. Voer de overeenkomstige molaire concentraties in de tabel rechts.
      5. Definieer de putjes bevattende 1 x KB als "buffer" of "neutraliseren", en de putjes die glycine als "Regeneration".
   3. In "Assay Definition", volgt u de onderstaande stappen om de experimentele opstelling te definiëren:
      1. Klik 3 "Add" en selecteer "Baseline", "Regeneratie", "Evenwicht", "laden", "Vereniging", en "dissociatie" stappen om de lijst met tijden van "30" s,"0" , "18" en "200" en "500" s en "1800" s respectievelijk. Het schudden snelheid is "1000" rpm.
      2. Om de stappen om "Assay Steps List" toe te voegen, klikt u eerst op een stap, klik dan op de putten zich ofwel in het monster of het reagens plaat. De stappen zijn als volgt:
         1. Equilibrering-Regeneratie: de voorwaarde AHC sensors drie cycli van "15" -s kuilen in glycine (pH 1,5), afgewisseld met "15" -s dips in 1 x KB.
         2. Loading: vastleggen van de mAb monsters op de AHC sensoren "200" s.
         3. Baseline: vaststellen van de BLI signaal voor "60" s voor de vereniging stap.
         4. Association: Dompel de sensoren in putjes die verschillende concentraties humaan PCSK9 voor "500" -s associatie periode.
         5. Dissociatie: Dompel de-PCSK9 gebonden sensoren naar nieuwe bronnen van 1x KB voor een "1800" -s dissociatie periode.
         6. Regeneratie: Dompel de mAb-PCSK9 bound sensoren in putjes van glycine (pH 1,5) met twee "18" -s pulsen tussen elke bindcyclus.
   4. In "Review Experiments", schuift u door de stappen en zo nodig wijzigingen te maken door terug te gaan naar de vorige tabbladen.
   5. In "Run Experiments", voer een "60" s vertragingstijd en schud het monster plaat tijdens het wachten. Stel de plaattemperatuur op "25" ° C en druk "GO".
3. Data-analyse met behulp van ForteBio's Data Analyse Software
   1. Klik op "Data Selection | Geladen gegevens | Kinetics | PCSK9 antilichamen binden aan PCSK9 7.23.14"
   2. In "Processing", verwerken de gegevens als volgt:
      1. In Stap 1: klik op "Sensor Selection" sensoren in H1-H6 markeren, klik met de rechtermuisknop op hen en klik op "Wijzigen Sensor Type | Verwijzing Sensor."
      2. In stap 2, vink dan "aftrekken" en selecteer "Average Reference Sensors"; elke actieve sensor monster af te trekken van het gemiddelde van de 6 lege buffer sensoren.
      3. In stap 3, klik op "Align Y-as" en selecteer "Baseline" om alle bindcurves naar de basislijn voorafgaand aan vereniging uit te lijnen.
      4. In Stap 5 Controleer "Savitsky-Golay Filtering" naar de bindcurves glad door verhoging van de signaal-ruisverhouding en klik "Process data".
      5. In Stap 6, klikt u op "Verwerkt Results" om de verwerkte bindcurves bekijken.
      6. In Stap 7, herziening van de vier panelen op de juiste weergave van de bindcurves na elke processtap, en klik op "Opslaan verwerkte gegevens".
   3. In "Analysis", vink "associatie en dissociatie" en kies "1: 1" model.
   4. Markeer de binding curves voor "Global (full)" fit en groepeer ze door "kleur". Met _"Rmax gekoppeld" Uitvoeren van de groep fitting op de sensoren bekleed met dezelfde mAb concentratie de experimentele _Rmax bij berekening ligand oppervlakteactiviteit en _"Rmax ontkoppeld door sensor" verkrijgen globale fitting voeren op sensoren bekleed met meerdere mAb concentraties.
   5. Klik op "Fit Curves" om de kinetiek gemonteerd parameters te verkrijgen. Sparen de resultaten aan het einde van elke fitting analyse.

5. Kinetische metingen in het IBIS MX96

1. Instrument en reagens Bereiding
   1. Equilibreren een COOH-G chip bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   2. Bereid een 1-L fles systeem loopbuffer (PBS [pH 7,4], 0,01% Tween-20) en de immobilisatie buffer (10 mM natriumacetaat [pH 5,0], 0,01% Tween-20).
   3. Bereid een mAb van 20 ng / ml tot 0,16 ug / ml met 2-voudige seriële verdunningen in zowel het systeem loopbuffer en natriumacetaat (pH 5,0) buffer immobilisatie.
   4. Afzien van het mAb monsters in twee septemberArate platen met 96 putjes, waarbij elk mAb inneemt 8 verticale putten in de titratie concentraties 200 pi per putje.
   5. Dooi aliquots van 400 mM EDC en 100 mM sulfo-NHS bij kamertemperatuur.
   6. Bereid 300 pl proteïne A / G op 50 ug / ml in natriumacetaat (pH 5,0) buffer immobilisatie en pipetteer deze in een flesje.
   7. Bereid 200 pi van menselijke PCSK9 van 100 nM tot 0,39 nM met 2-voudige seriële verdunningen in het systeem loopbuffer. Pipet ze in afzonderlijke flesjes.
2. Multicyclische kinetiek amine-gekoppelde antilichaam arrays
   1. Meng de EDC / sulfo-NHS (400 mM / 100 mM) en aliquots bereid het mengsel in de top 48 putjes van een nieuwe plaat met 96 putjes met 200 ui per putje.
   2. Plaats de mAb bronplaat (verdund in natriumacetaat [pH 5,0]) op positie 2 en de EDC / sulfo-NHS reagens plaat op positie 1 in de printer.
   3. Installeer de sensorchip in de CFM. Open de "CFM 2.0" software, dan klikt u "Load Settings | 96 Amine Couple". De 10 x 8 matrix antilichaam wordt als volgt gemaakt:
      1. Levert de EDC / sulfo-NHS in de bovenste helft van het reagens plaat om de sensor met microkanalen 48 en cyclus ze over het sensoroppervlak voor "5" min.
      2. Lever de mAb monsters in de bovenste helft van de bronplaat de sensor en fietsen ze over de geactiveerde oppervlakken voor "10" minuten.
      3. Lever de immobilisatie buffer van 50-ml conische buis via antilichaam vlak van "5" min.
      4. Herhaal de bovenstaande procedure voor de resterende mAb monsters in de onderste helft van de bronplaat.
   4. Dok de gedrukte sensorchip in het instrument. In de besturingssoftware, klikt u op "File | Connect | Open Meting | bestaande meting" en selecteer "2014/08/15".
   5. In "Algemeen", selecteer "G - System Prime" onder "Full systeem script". Selecteer vervolgens "G - Quench" op de mAb oppervlakken deactiveren door het injecteren 150 pi 1 M ethanolamine.
   6. Klik op "Camera" op de mAb arrays visualiseren en het contrast aan te passen indien nodig. Plaats de rode vierkantjes op de mAb plekken omringen, en verplaats de groene vierkantjes op de interspots gelegen tussen de actieve mAb plekken voor verwijzingen.
   7. In "Analysis Cycle", selecteer "A - AP Standard Run" onder "IBIS Scripts". Set 1,0 min voor baseline, 10,0 min voor associatie en dissociatie 90 stappen 8 pl / s snelheid.
   8. In de "Cycli" Injecteer menselijke PCSK9 een concentratie tegelijk volgende vijf buffer injecties. Regeneratie van de mAb oppervlakken glycine pH 2,0 tussen elke bindcyclus.
3. Single-cycle kinetiek met Fc ingevangen antilichaam arrays
   1. Plaats een nieuwe sensor chip in de CFM. Herhaal stap 5.2.3 hierboven 5.2.5 door mAb monsters vervangen door proteïne A / G.
   2. Verwijder desensorchip de MX96 en plaats het terug in de CFM printer.
   3. Lever de mAbs in de bovenste helft van de plaat aan de proteïne A / G sensoroppervlak via microkanalen 48 en cyclus ze over het oppervlak met pendelleidingstuk gedurende 10 min.
   4. Herhaal de bovenstaande stappen voor de resterende mAb monsters in de onderste helft van de plaat.
   5. Dok de gedrukte sensorchip in de MX96 instrument. In de Data Acquisition Software, klikt u op "File | Connect | Open Meting | bestaande meting | Next" en selecteer "Proteïne A + G bindend kinetic7.30.14".
   6. Klik op "camera" om de mAb arrays visualiseren en het contrast aan te passen indien nodig. Plaats de rode vierkantjes op de mAb plekken omringen, en verplaats de groene vierkantjes op de interspots gelegen tussen de actieve mAb plekken voor verwijzingen.
   7. In "Analysis Cycle", selecteer "A - AP Standard Run" onder "IBIS Scripts". Stel "1,0 min" voor baseline, "10.0min" voor associatie en '10' stappen dissociatie op '8 pl / sec' snelheid.
   8. In de "Cycli" Injecteer menselijke PCSK9 een concentratie tegelijk volgende vijf buffer injecties. Geen regeneratie wordt uitgevoerd tussen elke analyt injectie.
4. Gegevensanalyse gebruiken sprint Scrubber
   1. In de Sprint X sofware, klikt u op "File | Open Triangle File", selecteert u alle monster injecties in de lijst en vink "Save Sprint X bestand", "Calibration" en "RLL vastberadenheid" voordat u op "Analyseren".
      OPMERKING: De RLL waarden hebben betrekking op de geïmmobiliseerde / gevangen mAb niveaus op de sensor oppervlak.
   2. Check "Verwijzen" en selecteer "Local" naar de aangrenzende verwijzing plekken te gebruiken. Controleer ook "Lijn" op de eerste injectie en klik op "Start Automation."
   3. In het tabblad Serial, selecteert u "Show heersers in de werkbalk," ze aanpasseneen klein gebied van de basislijn vóór de eerste monsterinjectie, en selecteer "nul".
   4. Genereer een .IBMX bestand voor analyse in de Scrubber door "Export to file IBMX" en vervolgens op "Start Automation."
   5. Lanceer Scrubber en de .IBMX bestand te laden. Enter "100n" als de "Stock conc" en "2" als de "Verdunningsfactor".
   6. Crop gegevens, verwijder alle basislijn voorafgaand aan de start van de injectie, en lijn de bindcurves aan het begin van de vereniging.
      OPMERKING: Voor de single-cycle kinetiek experiment, niet de bochten af ​​te stemmen.
   7. Ga naar het tabblad "Kinetics", stelt de heerser voor de injectie eindtijd, selecteert u "k _d" en fit, dan "fix k _d." Selecteer "k _een k _d" en monteer het weer.
   8. Drijven de _M kolom weer fit om de pasvorm te verfijnen.
      OPMERKING: Bij de montage van één cyclus bindcurves, Klikt u op "kiest" en schakel "Aftrekken", selecteer vervolgens "Afzonderlijk" en drijven de kolom "Begin Inj" om de vereniging profielen terug naar een theoretische basislijn oorsprong passen.
   9. Geef je mening over de kinetiek gemonteerd parameters in het tabblad Results.

Results

Figuur 1 het antilichaam matrix beeld van CFM en gespot mAb niveaus van beide immobilisatie werkwijzen en figuur 2 toont het overeenkomstige bindende sensorgrammen gegenereerd in de MX96 van multicyclische kinetische en de single-cycle kinetische volgende mAb arrays . De real-time binding en kinetisch ingerichte curven van verschillende met antilichaam beklede oppervlakken gevormd in de vier biosensor platforms zijn getoond in figuren 3-6. Figuur 7 toont de vergelijking van de uiteindelijke kinetische prijzen en equilibrium bindingsconstanten verkregen uit de globale analyse van deze bindingscurven. De afzonderlijke associatie _(ka), dissociatiesnelheid _(kd) en evenwicht _(KD) bindende constanten worden in tabel 1. Om de variabiliteit van datasets gegenereerd binnen hetzelfde instrument aan te tonen, Figuur 8 toont grafieken van _{ka, kd} en _KD met verschillende mAb oppervlaktedichtheden, en Figuur 9 vergelijkt verder de berekende bindingsactiviteiten van het mAb oppervlakken over de bio platforms.

Figuur 1. Multiplex Ligand geïncorporeerde Amine-gekoppelde (A) en Fc-ingevangen (B) antilichaam oppervlakken van CFM afdrukken in de IBIS MX96. Beelden van de gedrukte arrays worden weergegeven in de linker panelen, waar de grijze gebieden omsloten door rode vierkanten wijzen op de aanwezigheid van het antilichaam. De donkere interspots gelegen tussen actief antilichaam vlekken worden als referentie aftrekken. Elke kolom bevat een antilichaam afgedrukt titratie concentraties beneden en links van de afbeelding aangegeven. De hoeveelheden van de gedrukte antilichamen gekwantificeerd door het berekenen van de difference in bulk verschuivingen tussen de actieve en de referentie locaties worden getoond in de rechterpanelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Vergelijking van real-time Binding sensorgrammen van multi-cyclus (A) en gedurende één cyclus (B) Kinetische experimenten in IBIS MX96. De opeenvolgende injecties van humaan PCSK9 bij toenemende concentraties over de 10 x 8 antilichaam arrays zijn boven elke corresponderende sensorgram segment genoteerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Biacore T100. De interacties worden bestudeerd over hoge (bovenste panelen), middellange (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De bedekt gladde zwarte lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1: 1 interactiemodel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Proteon XPR36. De interacties worden geëvalueerd over hoge (bovenste panelen), medium- (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De bedekt gladde zwarte lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1: 1 interactiemodel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Octet RED384. De interacties worden bestudeerd over hoge (bovenste panelen), middellange (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De overlay rode lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1: 1 interactiemodel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6. Binding sensorgrammen van de amine-gekoppelde (A) en Fc-ingevangen (B) antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in IBIS MX96. De bindingsprofielen zijn georganiseerd als 10 x 8 panelen die de relateringstabel plaat figuur 1 te volgen. De zwarte lijnen de geregistreerde binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 en bedekt rode lijnen stellen de gemonteerde bochten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

guur 7" src = "/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Figuur 7. Vergelijking van de vereniging _ka (A), dissociatie _kd (B) en Equilibrium _KD (C) Binding Constanten Gegenereerd door vier Biosensor platforms. De kinetische parameters worden afgeleid uit de globale analyse van de bindingskrommes in figuren 3-6. De instrumenten worden als volgt vertegenwoordigd: Biacore T100 (blauw), Proteon XPR36 (groen), Octet RED384 (rood), IBIS MX96, amine gekoppeld (paars) en IBIS MX96, Fc-gevangen (oranje). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8. Vergelijking van de Consistentie van de Kinetic snelheidsconstanten over meerdere Antibody Surface dichtheden in de Biac ore T100 (A), Proteon XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, amine-gekoppelde (D) en IBIS MX96, Fc-ingevangen (E). De kinetische parameters _ka (bovenste subpanelen), _kd (middelste subpanelen), en _KD (bottom subpanelen) afgeleid uit groep analyse op individuele oppervlakte-antilichaam dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 9. Binding Activiteiten van het antilichaam oppervlakken en hun standaarddeviaties (foutbalken) in het Four Biosensor Platforms. De berekening vindt plaats via vergelijkingen in de onderzoeksartikelen ¹⁷ beschreven.large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

	ka	kd	K D
	(M-1 s-1)	(S-1)	(nM)
mAb 1	11,7 (7,8) x 10 5	4.89 (4.18) x 10 -5	0,052 (0,05)
mAb 2	1,53 (0,28) x 10 5	1.30 (1.54) x 10 -5	0,092 (0,12)
mAb 3	11,4 (8,3) x 10 5	27,6 (11,0) x 10 -5	0,333 (0,20)
mAb 4	3,61 (1,6) x 10 5	20,1 (12,3) x 10 -5	0,659 (0,54)
mAb 5	0,59 (0,21) x 10 5	3,46 (2,50) x 10 -5	0,663 (0,46)
mAb 6	1,19 (0,78) x 10 5	7,21 (3,83) x 10 -5	0,894 (0,64)
mAb 7	1,29 (0,53) x 10 5	16,4 (5,63) x 10 -5	1,57 (1,02)
mAb 8	4,02 (2,23) x 10 5	22,8 (10,7) x 10 -5	0,768 (0,68)
mAb 9	4.20 (2.13) x 10 5	6,67 (4,3) x 10 -5	0,197 (0,16)
mAb 10	1,20 (0,49) x 10 5	12.5 (7.64) x 10 -5	1.27 (0.80)

Tabel 1: Kinetic tarieven en Equilibrium Binding constanten van 10 mAbs Verkregen door Global Fitting bindingskrommes van Four Biosensor Instruments aan de 1: 1 Interaction Model.

Discussion

Onze head-to-head vergelijking studie toont aan dat elke biosensor platform heeft zijn eigen sterke en zwakke punten. Hoewel de bindingsprofielen van de antilichamen vergelijkbaar door visuele vergelijking (figuren 3-6), en de rangorde van de verkregen kinetische snelheidsconstanten zeer consistent instrumenten (figuur 7), onze resultaten tonen aan dat SPR gebaseerde instrumenten continue stroom vloeistofcomponenten) zijn beter in oplossing met hoge affiniteit interacties met trage dissociatie tarieven. Toenemend verschil in de dissociatiefase waargenomen in datasets (bijvoorbeeld mAb 2, 5 mAb, mAb en 9 Figuur 5) gegenereerd door de BLI fluidics-vrij instrument. Deze bevinding kan grotendeels toegeschreven monster verdamping tijd in de microtiterplaat en een belangrijkste beperking van het systeem. Deze inherente beperking, worden experimentele keer ook beperkt tot minder dan 12 h; de experimenten werden daarom geprogrammeerd met shorter keer (500 s associatie- en dissociatie 30 min) vergeleken met die van andere platformen (10 min associatie- en dissociatie 45 min). Echter, het verkorten van de experimentele tijd niet lijken om de impact van de verdamping op de kwaliteit van de gegevens / consistentie te beperken, als de snelheid constanten die door de BLI-gebaseerde instrument tonen minder lineariteit als gevolg van fluctuaties in een aantal van de off-rates (Figuur 8C ). Naast monster verdamping, kunnen afwijkingen in de invangreagentia die hebben bijgedragen tot de verschillen in de resultaten. Terwijl proteïne A / G werd in alle drie fluidics SPR gebaseerde platforms werden AHC sensoren voor non-fluidics BLI platform. Omdat proteïne A / G zal waarschijnlijk een zwakkere affiniteit voor de mAbs dan doet de AHC, een antilichaam gebaseerde biosensor oppervlak, de off-rates van de mAb-antigeencomplex van het proteïne A / G oppervlakken kan kunstmatig lijkt sneller dan hebben verkregen uit het AHC oppervlak. Deze mogelijkheid wordt ondersteund by de experimentele gegevens die aantonen dat de off-rate waarden gegenereerd door de BLI platform constant lager dan die verkregen uit andere instrumenten (figuur 7, rode lijn). Toch is de BLI platform heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere platformen. Zo is het zeer flexibel in sensor keuze en proefconfiguratie gevolg van de verschillende vooraf beklede sensoren voor onmiddellijk gebruik. In onze experimenten, het gebruik van de AHC sensoren langer nodig dat de ligand immobilisatie stappen, waardoor de voorbereidingstijd. Bovendien is de BLI platform vergt minder onderhoud vergeleken met de andere vloeistofcomponenten SPR platforms, die ingewikkeld slangen en waar switchconfiguraties voorzien. Dit kenmerk is een voordeel voor experimenten met ongezuiverde monsters die verstopping en vervuiling problemen kunnen veroorzaken.

Omdat de vraag voor een efficiënte, snelle en nauwkeurige identificatie van therapeutische kandidaten toeneemt, neemt de behoefte aan biosensor throughput stijgt eveneens. Van de vier biosensor platforms, het debiet van de biosensor geschikt 96-ligand matrix printen is het hoogst, gevolgd door de biosensor gekoppeld met een kriskras 36-ligand formaat en het BLI-gebaseerde biosensor met 16-kanaals gelijktijdige uitlezing, wat uiteindelijk stijgen het aantal interacties gemeten in een bindcyclus 96, 36 en 16, respectievelijk. Deze throughput mogelijkheden zijn significant hoger dan die van de traditionele SPR platform, dat wordt begrensd doordat slechts vier stroomcellen verbonden door een seriële stroom. Aangezien onze experimenten betrof een relatief kleine steekproef stel 10 mAbs geëvalueerd op verschillende oppervlaktedichtheden met lange dissociatie maal de instrumentele doorvoer speelde matige rol bij het bepalen van de efficiëntie van de experimenten. Er waren geen significante verschillen in de experimentele tijden van de drie high-throughput platformen, en in alle gevallen werden de experimenten in één dag voltooid. Aan de andere kant, de traditionele seriële stroom SPR experimenten vereist 3 dagen in beslag, ondanks de walk-away automatisering van data-acquisitie na de installatie. In andere studies die een groot aantal monsters (dat wil zeggen in de honderden of duizenden) omvatten, voor off-rate ranking / kinetische screening of epitoop binning doeleinden, het debiet wordt een kritische factor.

Hoewel de consumptie in IBIS MX96 is orden van grootte hoger dan die van de andere biosensoren en daarom een ​​optimale keuze voor deze doeleinden heeft enkele tekortkomingen. Met name de matrix drukken van de CFM toont groot oppervlak inconsistenties (figuur 1) en gereduceerde data reproduceerbaarheid (Figuur 8D en 8E). Voor nauwkeurige kinetische metingen de hoeveelheid ligand op de biosensor oppervlak een kritische parameter die moet worden geregeld zodanig dat de binding responsen niet worden verstoord door secundaire factoren zoalsmassaoverdracht of sterische hindering. Voor de Biacore T100 en Proteon XPR36 werden de optimale _RL niveaus bepaald op basis van de standaardberekening van ingestelde _Rmax waarden zoals beschreven in het onderzoek artikel ^17. Anderzijds, voor Octet RED384 en IBIS MX96 platforms, het mAb capture niveaus werden bereikt empirisch met behulp van een reeks 2-voudig serieel verdunde antilichamen met constante tijd. Het gebrek aan kennis of controle van de vangstap resulteerde in een hoge dichtheid oppervlak en hoge binding responssignalen (figuur 2) dat de nauwkeurigheid van de kinetische snelheidsconstanten gevaar zouden brengen. Bovendien is de scheiding van de printer in de SPR detector presenteert ook een uitdaging bij het uitvoeren van meerdere metingen bindcyclus met regeneraties. De enige manier om de multi-cycle kinetiek instelling uit te voeren is door directe koppeling van het amine mAb, in tegenstelling tot het mAb Fc te vangen door het geïmmobiliseerde proteïne A / Goppervlak in de andere drie biosensor platforms. Als resultaat werd een extra regeneratie verkennende experimenten nodig om de optimale condities te bepalen regeneratie. Het resultaat van deze opstelling is verbonden met een -90% lager waargenomen oppervlakteactiviteit vergeleken met de Fc invangwerkwijze (figuur 9), naast een experimentele langere tijd. Om de Fc capture methode uit te voeren, werd een alternatief single-cycle kinetische benadering. Deze benadering omvat de achtereenvolgende injectie van analyt toenemende concentraties zonder regeneratie tussen elke injectie (figuur 2). Dit zeer gunstig, maar minder algemeen toegepaste benadering niet alleen verkort de experimentele tijd en verminderde reagensverbruik, maar produceerde ook kinetische snelheidsconstanten vrijwel gelijkwaardig aan die van de andere biosensoren (figuur 7). Daarom deze enkele cyclus kinetiek benadering overwint de inherente beperking configuratie van het instrument en fungeertmogelijkheid tot het verkrijgen van hoge-resolutie kinetische snelheidsconstanten in een high-throughput manier.

Ondanks de doorvoer dat een belangrijke beperking in de Biacore T100, onze resultaten laten zien collectief dat het genereren van de meest consistente gegevens met de hoogste kwaliteit. Dit werd gevolgd door de Proteon XPR36 die ~ 10-voudig hogere doorvoer heeft. Hun vermogen om hoge kwaliteit te genereren wordt een voordeel bij het karakteriseren hoge affiniteit antilichaam-antigen interacties die technisch uitdagend zijn wanneer detectielimiet van het instrument bereikt. En de systematische beperkingen in instrumentatie van de Octet RED384 belemmeren de nauwkeurige meting van dissociatiesnelheidsconstanten (dat wil zeggen, achter bij de gevoeligheid voldoende verval van het signaal voor langzame off-rates te lossen), zowel de Biacore T100 en Proteon XPR36 kunnen gevoelig en betrouwbaar is detectie voor differentiatie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T100 System	GE Healthcare	28975001	Het T100-systeem is geüpgraded naar T200
CM5 Sensor Chip	GE Healthcare	BR100012
BIAevaluation	GE Healthcare		Versie 4.1
Biacore T100 Control Software	GE Healthcare		De T100-besturingssoftware is geüpgraded naar T200
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	Bevat: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10,5 mL 1,0 M ethanolamine-HCl pH 8,5
HBS-EP+ Buffer 10×	GE Healthcare	BR100669	Geconcentreerde stockoplossing
Plastic Vials, o.d. 7 mm	GE Healthcare	BR100212
Rubber Caps, type 3	GE Healthcare	BR100502
Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm	GE Healthcare	BR100214
ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System	Bio-Rad	1760100
ProteOn Manager Software	Bio-Rad	1760200	Versie 3.1.0.6
GLM Sensor Chip	Bio-Rad	1765012
Amine Coupling Kit	Bio-Rad	1762410	Bevat EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl
Regeneration and Conditioning Kit and Buffers	Bio-Rad	1762210	Bevat 1 glycine buffer (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0), en NaOH, SDS, HCl, fosforzuur, NaCl; 50 mL elke oplossing
2 L PBS/Tween/EDTA buffer	Bio-Rad	1762730	Bevat fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA
Octet RED384 System	FortéBio
Data Analysis Software	FortéBio		Versie 9.0.0.4
Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors	FortéBio	18-5060	Een lade met 96 biosensoren
384-Well Tilted-Bottom Plate	FortéBio	18-5080
Biosensor Dispenser	FortéBio	18-5016
Kinetics Buffer 10x	FortéBio	18-1092	10x concentratie. Bevat ProClin 300.
IBIS MX96 SPRi System	Wasatch Microfluidics
Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer	Wasatch Microfluidics		Versie 2.0
SensEye COOH-G chip	Wasatch Microfluidics		1-09-04-004
Data Analysis Software	Wasatch Microfluidics		Versie 6.19.3.17
SPRint Data Analysis Software	Wasatch Microfluidics		Versie 6.15.2.1
Scrubber 2	BioLogic Software		Versie 2
Pierce Recombinant Protein A/G	ThermoFisher Scientific	21186