Methodenartikel

Het vergelijken van de effecten van elektronische sigarettendamp en sigarettenrook in een roman

11.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55672

⸱

24 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jobst Vascular Research Laboratory, University of Michigan Medical School, 2Department of Engineering, Purdue University, 3Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, University of Michigan Health System

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om knaagdieren bloot te stellen aan elektronische sigarettendamp (E-damp) en sigarettenrook. Blootstellingskamers worden geconstrueerd door het aanpassen van verdovingskamers met een geautomatiseerd pompsysteem dat E-damp of sigarettenrook aan knaagdieren levert. Dit systeem kan gemakkelijk worden aangepast om veel experimentele eindpunten in te vullen.

Samenvatting

Elektronische sigaretten (E- sigaretten ) worden veel gebruikt en groeien in populariteit. Naar schatting worden meer dan 9 miljoen volwassenen regelmatig gebruikt. De mogelijke nadelige gezondheidseffecten van de blootstelling aan elektronische sigarettendamp (E-damp) zijn slecht gedefinieerd. Terwijl verscheidene dierenmodellen van blootstelling aan E- vapor zijn ontwikkeld, laten weinig modellen knaagdieren bloot aan klinisch relevante hoeveelheden nicotine en maken directe vergelijkingen met sigarettenrook binnen hetzelfde blootstellingssysteem. Hier presenteren wij een methode voor het opbouwen en bedienen van een E- dampkamer en sigarettenrookkamer. De kamers zijn geconstrueerd door anesthesiekamers uit te voeren met een computer gestuurd pompsysteem dat consistente hoeveelheden E levertIze: 14px; "> - damp- of sigarettenrook voor knaagdieren. De blootstelling aan nicotine wordt indirect gemeten door kwantitatieve cotinine niveaus van pre- en post-blootstelling te berekenen. Dit blootstellingssysteem kan worden aangepast om verschillende soorten E- sigaretten en tabaks sigaretten aan te pakken en kan Worden gebruikt om de effecten van E- damp en sigarettenrook in vivo te vergelijken.

Inleiding

Sinds de Amerikaanse markt in 2004 de elektronische sigaretten (E-sigaretten) hebben uitgebreid tot een miljard dollarindustrie, wordt geschat dat bijna 9 miljoen volwassenen ze regelmatig gebruiken 1 . In 2014 en 2015 hadden meer middelbare scholieren E-sigaretten gebruikt dan conventionele sigaretten 2 . Het toenemende aantal gebruikers van e-sigaretten heeft een onderzoekspoging geproduceerd om hun potentiële nadelige gezondheidseffecten te evalueren.

E-sigaretten genereren een damp (genaamd "E-damp") door het verwarmen van een viskeuze oplossing die typisch een mengsel van water, polyethyleenglycol of plantaardige glycerine, nicotine en smaakstoffen 3 , 4 bevat . Er is aangetoond dat E-damp meerdere schadelijke verbindingen bevat, waaronder Reactive Oxygen Species (ROS), nicotine, diverse aldehyden en polycyclische aromatische koolwaterstoffen 5 ,6. Vele van deze verbindingen worden gevormd tijdens het verdampingsproces van E-vloeistof voorafgaand aan inhalatie 7 . In het bijzonder zijn er meerdere van deze schadelijke verbindingen aanwezig in sigarettenrook, die zorgen maken dat het gebruik van E-sigaretten vergelijkbare nadelige gezondheidseffecten kan hebben. 7 .

Er is weinig consensus over de gezondheidseffecten van E-sigaretten. Om dit aan te pakken zijn verschillende dierenmodellen van blootstelling aan E-dampen ontwikkeld ( tabel 1 ). Deze modellen maken gebruik van een verscheidenheid aan methoden, zoals blootstelling van de hele lichaam E-damp en mechanische ventilatie. Terwijl de huidige modellen inzicht hebben gegeven in de gegevens, maken weinig bedrijven directe vergelijkingen met sigarettenrook binnen hetzelfde belichtingssysteem ( tabel 1 ). Bovendien, terwijl verschillende menselijke studies hebben aangetoond dat gebruikers van E-sigaretten en sigarettrokers serumcotinine niveaus hebben tussen 30-200 ng / mL, vallen veel modellen van blootstelling aan E-damp en sigarettenrook uitIde dit bereik 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .

Hierin presenteren we een methode voor het vergelijken van de effecten van sigarettenrook en blootstelling aan E-damp in vivo die het cotinine-gehalte van het serum oplevert vergelijkbaar met menselijke studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het volgende protocol is uitgevoerd onder begeleiding en goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Michigan (IACUC).

1. Elektronische sigaretten-dampkamermontering

OPMERKING: De volledige kamer moet tijdens gebruik in een afzuigkap worden geplaatst. De kamer hier was gehuisvest in een temperatuur gecontroleerde en gefilterde laboratoriumomgeving. Onderzoekers kunnen ervoor kiezen om dergelijke aspecten van het systeem te controleren om de consistentie van de luchtkwaliteit van de kamer te waarborgen. Als optie kan de monitoren met een metalen kooi voorkomen dat knaagdieren worden ingejaagd, terwijl de monitors de binnenkamermilieu kunnen proeven.

  1. Verkrijg een verdovingskamer met luchtdicht verwijderbaar deksel met een volume van 20 L.
  2. Met behulp van een jigzaag voorzien van een mes dat geschikt is voor het snijden van het materiaal, snijd een gat van 10,2 cm diameter in het deksel van de kamer ongeveer 7,6 cm van de achterrand van de kamerkamer.
  3. Steek de verstelbare opening in het gat en bevestig deze met een caulk lijm.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de lijmafdichting niet toegankelijk is voor de knaagdieren in de kamer, aangezien zij de lap kunnen kauwen. Om dit mogelijke probleem te verhinderen, past u de afdekking aan de buitenkant van de kamerwand toe om het ventiel te monteren.
  4. Snij siliconenbuis in twee segmenten van 15 cm en bevestig de uiteinden aan weerszijden van een T-connector.
    OPMERKING: Siliconenlang heeft het potentieel om te reageren met sommige componenten van e-damp of sigarettenrook. Zo kunnen onderzoekers overwegen gebruik te maken van niet-reactieve buizen.
  5. Draad beide siliconenbuizen door voorgemaakte gaten bij de voorkant van de kamerklep zodat de T-connector in de kamer zit. Zorg ervoor dat de buis aan het deksel is bevestigd met een kleefmiddel of een elektrische band.
  6. Sluit de vrije uiteinden van de siliconenbuis aan op de uitgangen van twee micro-luchtpompen. Pompen moeten aan het deksel van de kamer worden gemonteerd met dubbel-Zijde kleefband of caulk.
    OPMERKING: De lengte van de buis verbonden met het uitgangspunt van de pomp moet kort zijn om de hoeveelheid dampopname op het binnenoppervlak van de buis tijdens gebruik te beperken.
  7. Met een nieuwe siliconenbuis, bevestig het ene uiteinde aan de invoerzijde van een van de luchtpompen (Pomp A in Figuur 1 ) en snijd deze buis ongeveer 4 cm lang. Dit is waar de elektronische sigaret tijdens het gebruik van de kamer wordt ingebracht. Zorg ervoor dat de diameter van de buis zorgvuldig past bij het einde van de e-cig.
  8. Met een nieuwe siliconenbuis, bevestig het ene uiteinde aan de invoerzijde van de andere luchtpomp (Pomp B in Figuur 1 ). Deze pomp zal kamerlucht in de kamer introduceren. Als zodanig moet het uiteinde van de buis buiten de dampkap geplaatst worden. De lengte van deze buis is niet kritisch, maar moet zo kort mogelijk zijn om de luchtstroomweerstand te beperken.
  9. Bevestig in de kamer twee kleine haken met dubbelzijdig lijm om oxyg te houdenEn en koolmonoxide gasmonitoren.

figure-protocol-1
Figuur 1. Schematisch van de elektronische sigaretdampkamer.
De kamer is in de afzuigkap gehuisvest (niet afgebeeld). De luchtpomp van de kamer (Pomp B) introduceert de kamerlucht van buiten de dampkoker continu in de kamer tot 2 L / min. E-cig pomp (Pomp A) puffert 133 ml E-damp over 4 s, met een rustinterval van 30 s. E-damp en kamerluchtmix voordat u in de kamer wordt gepompt. Gasmonitoren meet continu koolstofmonoxide (CO) en zuurstof (O 2 ) concentraties in de kamer. E-damp is passief uitgeput door de ventilatie in de afzuigkap. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Sigaretrookkamermontage

OPMERKING: Vrijwel elk merk oF sigaret kan gebruikt worden bij dit systeem, maar gestandaardiseerde onderzoeks sigaretten zoals de University of Kentucky 1R6F Research Sigaret zijn kosteneffectief, betrouwbaar en het beste voor deze applicatie.

  1. Volg stappen 1.1 - 1.6, en stap 1.9.
  2. Met een nieuwe siliconenbuis, bevestig het ene uiteinde aan het sigarettenverlichtingsapparaat en de andere kant aan de ingangsszijde van de luchtpomp (Pomp A in Figuur 2 ). Het sigarettenverlichtingsapparaat dient tijdens gebruik in de dampkap en buiten de kamer te worden geplaatst.
    Opmerking: De constructie van het sigarettenverlichtingsapparaat vereist kennis van metalen fabricage en elektrotechniek. Terwijl een stap-voor-stap gids voor de bouw hier niet wordt gegeven, zie aanvullende materialen voor plannen.
  3. Met een nieuwe siliconenbuis, bevestig het ene uiteinde aan de andere luchtpomp (Pomp B in Figuur 2 ). Deze pomp zal kamerlucht in de kamer introduceren, dus het einde van de buis moet buiten de dampkap geplaatst worden. >
  4. Knip verscheidene 5 mm brede verticale gleufjes in de voorwand van de kamer en monteer een computerventilator aan de buitenkant van de kamer zodat deze deze opening bedekt. Zorg ervoor dat de voorzijde van de ventilator naar de kamer gericht is, zodat de ventilator door deze opening lucht in de kamer zal blazen.

figure-protocol-2
Figuur 2. Schema van sigarettenrookkamer.
De luchtpomp van de kamer (Pomp B) introduceert de kamerlucht van buiten de dampkoker continu in de kamer tot 2 L / min. Pomp A trekt de sigaret aan op 40 seconden met een snelheid van 2 l / min en 20 s later evacueert de computerventilator de kamer over 3 minuten. Rook- en kamerluchtmengsel voordat u in de kamer wordt gepompt. Gasmonitoren meet continu CO2-concentraties (CO) en zuurstof (O2) kamerconcentraties. Rook is uitgeput door de uitlaat in de afzuigkap.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

3. Microcontroller Assembly en Software

  1. Controleer het pompsysteem van de E-sigaretdampkamer en sigarettenrookkamer door afzonderlijke microcontrollers. Download de microcontroller software en upload de operating codes die in de S aanvullende Materialen worden geleverd . De elektronische sigarettendampcode loopt de kamerluchtpomp continu en activeert de E-sigaretpomp gedurende elke 4 s elke 30 s. De sigarettenrookcode loopt de luchtpomp continu uit, activeert de sigarettenpomp gedurende 40 seconden en activeert de computerventilator 20 s nadat de sigarettenpomp is gestopt. De ventilator wordt uitgeschakeld na 3 minuten lopen.
    Opmerking: de timing van de pompen en ventilator kan zo nodig worden aangepast. Referentie fabrikant instructies over het uploaden van relevante codes naar de microcontroller.
  2. Om te assemblerenLe de microcontroller, verbind zip-draden, diodes, resisters en condensatoren aan het broodbord zoals afgebeeld in Figuur 3 en bevestig alligatorclipkabels aan de bijbehorende luchtpompen (en computerventilator voor sigarettenrookkamer). Houd de microcontroller buiten de afzuigkap indien mogelijk.

figure-protocol-3
Figuur 3. Schematische microcontroller.
Schematisch van microcontroller en broodbord om timing van luchtpompen en ventilator te bedienen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Dieren

  1. Gebruik volwassen ratten van 450 tot 520 g.
  2. Groepsratten volgens blootstellingstype ( bijv . Elektronische sigaret, sigarettenrook, kamerlucht gepompt in kamer).
  3. Op dit moment prBelemmeren 500 μL bloed in EDTA-gecoate buizen van staartvene met behulp van een spuit om de cotinineconcentratie van de baseline serum te meten.
  4. Spoel de bloedmonsters af bij 20.000 xg gedurende 30 minuten bij 4 ˚C en verzamel serum. Zorg ervoor dat monsters tijdens dit proces op ijs worden gekoeld.
  5. Na aanleiding van het fabrikantprotocol, werd de analyse voor cotinine in de serummonsters verzameld. Monsters kunnen ook bij -80 ˚C opgeslagen worden voor later gebruik.

5. Het bedienen van de elektronische sigaretkamer

  1. Maak de binnenkant van de kamer schoon met 70% ethanol, dan met gedeïoniseerd water en laat de lucht drogen tot de kamer helemaal droog is (of ongeveer 30 minuten).
  2. Kalibreer de gasmonitoren en plaats de volledige monitor op de muur in de kamer.
  3. Plaats ratten in de kamer. Houd er rekening mee dat maximaal drie dieren tegelijk kunnen worden blootgesteld.
  4. Zorg ervoor dat de E-sigaret volledig is geladen met voldoende E-vloeistof en plaats de E-sigaretIn de invoerbuis. Het is cruciaal om ervoor te zorgen dat de E-sigaretbatterij en E-vloeistof niveaus voldoende zijn gedurende de periode van 90 minuten.
  5. Zet de luchtpompen aan en start de timer.
  6. Tijdens de blootstelling houden de gasmonitoren in acht om ervoor te zorgen dat de kamer> 20% O2 en 0 ppm CO bevat.
    Opmerking: Als de zuurstofniveaus vallen, kan de kamer niet goed geventileerd zijn of de zuurstofmonitor is mogelijk niet correct gekalibreerd.
  7. Zodra de belichtingstijd 90 minuten bedraagt, verwijder de E-sigaret en ga door met de gaspompen om de overblijvende damp te ontluchten. Bovendien kan de bovenkant van de kamer worden opgeheven om de ventilatie te versnellen.
  8. Zodra de damp is verwijderd, verwijder de ratten en reinig de kamer.
  9. Verzamel 500 μL bloed uit de staartader van elke rat ongeveer 1 uur na blootstelling aan het einde van het experimentele protocol.
  10. Volg stappen 4.4 - 4.5 om serum en analyse voor cotinine te isoleren.

6. Bediening van de Tabaksigaretkamer

  1. Volg stappen 5.1 - 5.3.
  2. Plaats de sigaret in sigarettenverlichtingsapparaat, met het uiteinde van de sigaret tegen de verwarmingselementen.
  3. Zet het sigarettenverlichtingsapparaat aan tot de sigaretstop begint te smeer (ongeveer 5 s).
  4. Zodra de sigaret brandt, zet u het pompsysteem aan, start de timer en observeer de sigaretbranding tot aan de voltooiing (ongeveer 40 s).
  5. Zodra de sigaret is verbrand, verwijder de gebruikte sigaret zorgvuldig uit het sigarettenverlichtingsapparaat met tang.
  6. Zorg ervoor dat CO niveaus niet hoger zijn dan 1000 ppm en O 2 niveaus niet onder 20% vallen. Tijdschema en duur van computer fans is van cruciaal belang om koolmonoxide accumulatie te voorkomen.
  7. Na 4 minuten zet het pompsysteem uit en ga terug naar stap 6.2 totdat de ratten gedurende 90 minuten aan tabakrook worden blootgesteld (of ongeveer 23 sigaretten).
    OPMERKING: Koolmonoxide niveaus 4 min volgende sigarettenburMoet minder dan 400 ppm dalen, anders kan koolmonoxide in de kamer ophopen.
  8. Wanneer de belichting is voltooid, ga dan verder met het pompsysteem om de resterende rook te ventileren. Wanneer koolmonoxide onder 100 ppm daal, worden ratten uit de kamer verwijderd. Dit duurt 5 tot 10 minuten.
  9. Verwijder ratten en maak de kamer schoon.
  10. Verzamel 500 μL bloed uit de staartader ongeveer 1 uur na blootstelling aan het einde van het experimentele protocol zoals bij de E-sigaretten.
  11. Volg stappen 4.4 - 4.5 om serum en analyse voor cotinine te isoleren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Koolmonoxide en zuurstofmonitoring

De zuurstofconcentraties daalden niet onder 20% tijdens blootstelling aan e-dampen en de CO-concentraties bleken onopspoorbaar tijdens de gehele blootstelling. Gasmonitors tijdens blootstelling aan sigarettenrook bleek dat zuurstofconcentratie boven 20% bleef. Koolmonoxide concentraties bedroegen niet meer dan 1000 ppm ( Figuur 4 ).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een methode voor het opbouwen van kamers die knaagdieren op E-damp en sigarettenrook op een gecontroleerde manier blootstellen ( Figuur 6 ). De constructie van de E-sigaretkamer is relatief eenvoudig en goedkoop in vergelijking met commerciële belichtingssystemen 14 , 15 , 16 . De onderdelen en gereedschappen die nodig zijn om de kamer te bouwen zijn direct verkrijgbaar bij commerciële lever...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek is mogelijk gemaakt door de Aortic Research Grant (University of Michigan) aan Dr. Eliason. De auteurs willen Nick Scott ook erkennen bij de Universiteit van Michigan Plant Operations Sign and Graphics Department om te helpen bij het ontwerpen en monteren van het sigarettenverlichtingsapparaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
blu PLUS Rechargeable Kitblu eCigsN/A
1R6F Reference CigarettesCenter for Tob Ref  Prod UKN/A
Lexan Anesthesia Chamber 20 LJorgensen LaboratoriesJOR265
Arduino UNOArduino2877
Diode Rectifier - 1 A; 50 VSpark FunCOM-08589
Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 packSpark FunCOM-11508
Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 VSpark FunCOM-00096
Solderless Plug-in BreadBoard BusBoard Prototype SystemsBB400
Alligator-Clip WiresBusBoard Prototype SystemsCA-M-20
ZipWireBusBoard Prototype SystemsZW-MM-10
Standard Fan 80 ST2Cooler MasterR4-S8R-20AK-GP
ARIC 4" adjustable ventBestlouverN/A
ToxiPro  Carbon Monoxide (CO) MonitorHoneywell Analytics54-00-10316
ToxiPro Oxygen (O2) MonitorHoneywell Analytics54-45-90-VD
ToxiPro IQ Express Docking StationHoneywell/Sperian Biosystems 54-46-9100
Command Wall Hook Small Wire 6-Pack3MN/A
Micro Water/Air PumpXiamen Conjoin ElectronicsCJWP40-A12A1
1/4" Silicon TubingNewAge2801470-100
T ConnectorBel-Art SciencewareF196060000
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTABecton, Dickinson and Company367841
Cotinine ELISA kitCalbiotechCO096D

Referenties

  1. Schoenborn, C. A., Gindi, R. M. Electronic Cigarette Use Among Adults: United States, 2014 Key findings. NCHS. , (2014).
  2. Singh, T. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011-2015. MMWR. 65 (14), 361-367 (2016).
  3. Flora, J. W. Characterization of potential impurities and degradation products in electronic cigarette formulations and aerosols. Regul. Toxicol. Pharmacol: RTP. 74, 1-11 (2016).
  4. Tierney, P. A., Karpinski, C. D., Brown, J. E., Luo, W., Pankow, J. F. Flavour chemicals in electronic cigarette fluids. Tob. Control. , (2015).
  5. Sleiman, M. Emissions from Electronic Cigarettes: Key Parameters Affecting the Release of Harmful Chemicals. Environ. Sci. Technol. 50 (17), 9644-9651 (2016).
  6. Hwang, J. H. Electronic cigarette inhalation alters innate immunity and airway cytokines while increasing the virulence of colonizing bacteria. Int J Mol Med (Berlin, Germany). 94 (6), 667-679 (2016).
  7. Cheng, T. Chemical evaluation of electronic cigarettes. Tob Control. 23, 11-18 (2014).
  8. Etter, J. -F. A longitudinal study of cotinine in long-term daily users of e-cigarettes. Drug Alcohol Depend. 160, 218-221 (2016).
  9. Etter, J. -F. Levels of saliva cotinine in electronic cigarette users. Addiction. 109 (5), 825-829 (2014).
  10. Marsot, A., Simon, N. Nicotine and Cotinine Levels With Electronic Cigarette: A Review. Int. J. Toxicol. 35 (2), 179-185 (2016).
  11. Flouris, A. D. Acute impact of active and passive electronic cigarette smoking on serum cotinine and lung function. Inhal. Toxicol. 25 (2), 91-101 (2013).
  12. Bot, M. Plasma cotinine levels in cigarette smokers: impact of mental health and other correlates. Eur Addict Res. 20 (4), 183-191 (2014).
  13. Zhu, S. -H. Four hundred and sixty brands of e-cigarettes and counting: implications for product regulation. Tob. Control. 23, Suppl 3. 3-9 (2014).
  14. CH TECHNOLOGIES. Single Cigarette Smoking Machine SCSM-STEP. , Available from: http://chtechusa.com/products_tag_smoke_single-cigarette-CSM-SCSM.php (2016).
  15. SCIREQ. inExpose. , Available from: http://www.scireq.com/inexpose (2016).
  16. TSE Systems. Cigarette Smoke Generators. , Available from: http://www.tse-systems.com/products/inhalation/aerosol-vapor-generation/cigarette-smoke.htm (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ziektemodellen bij knaagdierennicotineblootstellingserumcotininelongziektenhart en vaatziektensigarettenrookkamere vaporisatiekamer

Gerelateerde artikelen