Dit protocol beschrijft een methode om de nucleocytoplasmatische transportsnelheid binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen nauwkeurig te meten door de real-time verandering in de nucleaire invoer van een NLS-NES-GFP eiwit te kwantificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Nucleocytoplasmisch transport verwijst naar de import en export van grote moleculen uit de celkern. Onlangs hebben een aantal studies een verband getoond tussen amyotrofische laterale sclerose (ALS) en afwijkingen in de nucleocytoplasmatische route. ALS is een neurodegeneratieve ziekte die de motorneuronen beïnvloedt en resulteert in verlamming en uiteindelijk in de dood, binnen gemiddeld 2-5 jaar. De meeste gevallen van ALS zijn sporadisch zonder enige schijnbare genetische koppeling, maar 10% worden op een dominante manier geërfd. Onlangs werden hexanucleotide-herhalingsuitbreidingen (HREs) in het chromosoom 9 open leesframe 72 (C9orf72) gen geïdentificeerd als een genetische oorzaak van ALS en frontotemporale dementie (FTD). Het is belangrijk dat verschillende groepen onlangs hebben voorgesteld dat deze mutanten nucleocytoplasmisch transport beïnvloeden. Deze studies hebben meestal het uiteindelijke resultaat en de manifestaties veroorzaakt door HRE's op het nucleocytoplasmisch vervoer laten zien, maar ze tonen geen dysfunctie van nucleaire transport inechte tijd. Als gevolg hiervan kan alleen ernstige nucleocytoplasmische transporttekorten worden bepaald, hoofdzakelijk door hoge overexpressie of exogene eiwitinbreng.
Dit protocol beschrijft een nieuwe en zeer gevoelige test om de nucleocytoplasmatische transportdysfunctie in realtime te evalueren en te kwantificeren. De invoerhoeveelheid van een NLS-NES-GFP-eiwit (shuttle-GFP) kan in real-time worden gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie. Dit wordt uitgevoerd door gebruik te maken van een exportinhibitor, waardoor de shuttle GFP alleen de kern kan binnendringen. Om de test te valideren, werden de C9orf72 HRE vertaalde dipeptide herhalingen, poly (GR) en poly (PR), die eerder werden getoond om nucleocytoplasmisch transport te verstoren, gebruikt. Met behulp van de beschreven test werd een 50% daling van de nucleaire importrate waargenomen in vergelijking met de controle. Met behulp van dit systeem kunnen kleine veranderingen in nucleocytoplasmisch transport worden onderzocht en het vermogen van verschillende factoren om een nucleocytoplasmatische tr (zelfs gedeeltelijk) te reddenAnsport defect kan worden bepaald.
Inleiding
Het nucleaire porecomplex (NPC) controleert de invoer en uitvoer van grote moleculen in en uit de celkern. In tegenstelling tot kleine moleculen, die de nucleus zonder regulatie 1 kunnen binnengaan, wordt het transport van grotere moleculen sterk gecontroleerd door de NPC. Deze grote moleculen, zoals eiwitten en RNA, associëren met transportfactoren, waaronder importins en exportins, worden geïmporteerd en geëxporteerd vanuit de kern 2 . Om geïmporteerd te worden, moeten eiwitten een klein peptidemotief bevatten, in het algemeen een nucleair lokalisatiesignaal (NLS) genoemd, dat gebonden is door importins 2 . Deze sequenties van aminozuren fungeren als een label en zijn verschillend in samenstelling 3 , 4 . Proteïnen kunnen worden geëxporteerd van de kern naar het cytoplasma door hun associatie met exportinS, die een signaalsequentie binden, in het algemeen genaamd een nucleair uitvoer signaal (NES) 2 . Zowel importins als exportins zijn in staat om hun lading te transporteren door de regulering van het kleine Ras-gerelateerde nucleaire eiwit GTPase (Ran) 2 . Ran is gebleken te bestaan in verschillende conformationalstaten, afhankelijk van of het aan GTP of het BBP is gebonden. Wanneer gebonden aan GTP, kan Ran binden aan importins of exportins. Bij het binden aan RanGTP vrijmaken importins hun lading, terwijl exportins RanGTP moeten binden om een complex te vormen met hun exportlading. De dominante nucleotide bindende toestand van Ran hangt af van de plaats in de kern (RanGTP) of het cytoplasma (RanGDP).
Recentelijk hebben een aantal studies een verband getoond tussen verminderingen in de nucleocytoplasmatische route en zowel amyotrofische laterale sclerose (ALS) en frontotemporale dementie (FTD) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS is een progressieve en fatale neurodegeneratieve ziekte die zowel de bovenste als de onderste motorneuronen (MNs) 13 beïnvloedt, waardoor de verlamming en uiteindelijk in de dood binnen 2 tot 5 jaar gemiddeld zijn. De meeste gevallen van ALS zijn geclassificeerd als sporadisch (SALS), zonder enige schijnbare genetische koppeling, maar 10% is overheersend geërfd (familiale ALS; FALS). Onlangs werden hexanucleotide herhalingsuitbreidingen (HREs) in het chromosoom 9 open leesframe 72 (C9orf72) gen geïdentificeerd 14 , 15 als een genetische oorzaak van ALS en FTD. Deze mutanten staan voor 30-40% van de FALS-gevallen 16 , en verschillende studies hebben aangevoerdDat ze toxiciteit veroorzaken door nucleocytoplasmisch transport 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 te beïnvloeden.
Deze studies hebben meestal de laatste uitkomsten en manifestaties van HRE's op nucleocytoplasmisch transport getoond, maar ze tonen niet in real-time nucleocytoplasmatische verstoring. Als gevolg hiervan is alleen ernstige nucleocytoplasmische transporttekorten geëvalueerd 11 , 17 , 18 .
Dit protocol beschrijft een nieuw en veRij gevoelige test om de nucleocytoplasmatische transportdysfunctie in realtime te evalueren en te kwantificeren. De invoerhoeveelheid van een NLS-NES-GFP-eiwit (shuttle-GFP) kan in real-time worden gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie. Dit wordt gedaan met behulp van een exportinhibitor, zoals eerder beschreven 18 , waardoor de shuttle-GFP alleen in de kern komt. Met behulp van florescerende microscopie en een software die in staat is fluorescerende veranderingen in real-time te kwantificeren, is het mogelijk om geleidelijke veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de shuttle-GFP, die zich in de kern bevindt, te kwantificeren. Als gevolg hiervan kan een Michaelis-Menten-achtige verzadigingscurve van de fluorescentie-tot-tijd-as, die de hoeveelheid nucleaire shuttle-GFP op elk gewenst moment vertegenwoordigt, worden gemaakt. Door gebruik te maken van de initiële lineaire snelheid van de krommen, is het mogelijk om een helling te genereren, die de snelheid van toegang tot de kern voor fluorescentie verzadiging vertegenwoordigt.
Om de test te valideren, vertaalt hetD C9orf72 dipeptide herhalingen, poly (GR) en poly (PR), die eerder gerapporteerd zijn om nucleocytoplasmisch transport te verstoren, werden gebruikt 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Met behulp van deze test werd een 50% daling van de nucleaire invoerpercentage waargenomen in vergelijking met de controle. Met dit systeem kunnen kleine veranderingen in nucleocytoplasmisch transport worden onderzocht. Bovendien kan het vermogen van verschillende factoren om een nucleocytoplasmatisch transportdefect te redden, worden bepaald.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cell Line Preparation
- Ontdooi ongeveer 1.000.000 muisneuroblastom ruggenmergcellen (NSC-34 cellen) die in een vloeibare stikstofhouder werden opgeslagen. Gebruik een 37 ° C water incubator totdat de cellen volledig ontdooid zijn.
- Voeg fris, warm medium (DMEM medium met 10% foetaal runder serum (FBS), 1% L-glutamine en 1% pen-strep antibiotica toe).
- Centrifuge ontdooide cellen (SL16R) bij 500 xg gedurende 5 minuten, waarbij een celpelletje wordt gevormd. Gooi het medium weg en voeg 1 ml nieuw medium toe voor de celresuspensie.
- Plaats de geresuspendeerde cellen in een 15 ml fles en voeg een extra 5 ml medium toe. Incubeer de cellen 's nachts in een steriele incubator met 5% CO2 bij 37 ° C.
- Tegelijkertijd plaats 8 onbedekte deklagen (dekglas: 12 mm, 0,13-0,17 mm dik) in een 60 mm koekschotel en steriliseer met 70% ethanol en blootstelling aan 30 min UV-licht tot het droog is. Voeg medium toe aan elk gerecht en verwijder de resterende ethanol af.
- Voeg trypsinebuffer (2,5 g trypsine en 0,2 g EDTA in 1 L Hanks 'Balanced Salt Solution) toe aan de cellen nadat ze ongeveer 90% samenvloeiing (ongeveer 6 miljoen cellen per fles) hebben bereikt om aanhechtende cellen te laten dissociëren.
OPMERKING: NSC-34 cellen zijn gevoelig en vereisen slechts 15 s van trypsine buffer incubatie en 1 extra min incubatie vrij van trypsine voor dissociatie met behulp van het medium. - Plaat de cellen op de 60 mm kweekschotels die de dekglazen bevatten met 3 ml medium, ongeveer 350.000 per schotel. Laat ze 24 uur in de incubator liggen om de bevestiging van de cel op de deklips toe te laten.
2. Cell Transfectie
OPMERKING: Na ongeveer 24 uur bereiken de NSC-34 cellen 40% samenloop (ongeveer 800.000 cellen) en zijn ze klaar voor transfectie.
- Bereid zuiver DMEM medium (300 μL DMEM medium voor elke 60 mm kweekschotel) in een steriele microcentrifugebuises.
- Voeg 2 μg elk plasmide toe dat nodig is voor transfectie aan elke DMEM-bevattende microcentrifugebuis.
OPMERKING: Het shuttle-GFP plasmide is verplicht bij alle celtransfecties. - Voeg transfectie-reagens toe aan alle microcentrifugebuizen die hun vereiste plasmiden bevatten. Voeg hier 4 μl van het commerciële transfectie-reagens toe voor elk 2 μg DNA.
- Vortex de microcentrifuge buizen die DMEM, plasmiden, en het transfectie reagens bevatten en incuberen hen bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.
- Voeg elke microcentrifugebuis toe aan een kweekschotel en roer het gerecht zachtjes om een homogene oplossing te vormen. Plaats de schotel 48 uur in de incubator.
OPMERKING: Aangezien shuttle-GFP in alle cellen moet worden uitgedrukt, kan de transport-GFP-transfectie-efficiëntie gedeeltelijk worden onderzocht en vooraf getest worden met behulp van fluorescerende microscopie na overnachtransfectie. Een volledig onderzoek van niet-fluorescerende uitgedrukte eiwitten kan worden uitgevoerd met behulp van een immunoblot analyseis.
3. Microscopie
- Bevestig de dekglazen die getransfecteerde NSC-34-cellen bevatten aan een dekselhouder en zachtjes wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de losstaande dode cellen te verwijderen.
- Identificeer een geschikte celpatch met een groen fluorescerend filter met een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: een geschikte celpatch wordt gedefinieerd als een microscoopveld dat een groot aantal cellen toont (20-30 cellen in een veld) en waarin de kernen duidelijk in de cellen zijn gedefinieerd. Celkernen binnen de celpatch worden eerst door het oog geïdentificeerd en worden door de beeldsoftware handmatig gemarkeerd. - Voeg 200 μl van een Leptomycin B (LMB) buffer van exportin-1 met 10 ng / mL LMB in PBS aan de deklips door de buffer op de deklips onder de microscoop te drukken.
OPMERKING: Dit punt in de tijd is ingesteld als interval nul. - Kwantificeer de fluorescerende intensiteit van de gemarkeerde kernen in 3 s intervallen voor ongeveer 400-500 s.
- Test voor elke transfectiegroep in elk afzonderlijk experiment tussen 3 en 5 omslaglijsten.
4. Analyse
OPMERKING: Aangezien verschillende cellen verschillende niveaus van florescerende shuttle-GFP uitdrukken, is het belangrijk om de nucleaire fluorescerende intensiteit van elke cel te normaliseren naar zijn eigen eerste fluorescerende intensiteit.
- Normaliseer de fluorescerende intensiteit van de gemarkeerde kernen door het 3-s fluorescentie interval van elke kern te verdelen met het gemiddelde van de initiële zes intervallen van die kern.
- Na de normalisatie van elke kern produceert u een fluorescerende intensiteitscurve die de verandering in nucleaire fluorescentie vertegenwoordigt als een functie van de tijd voor elke celpatch. Om dit te doen, bereken het gemiddelde van alle cellen in elke cel-patch (bestaande uit ongeveer 20-30 cellen in elke patch).
OPMERKING: De kern fluorescerende intensiteitskurve lijkt op een Michaelis-Menten verzadigingscurve, die beter wordt waargenomen binnen verhoogde tiIk periodes. Dit komt door een vermindering van de cytosolische hoeveelheden shuttle-GFP met de tijd vanwege het nucleaire transport. Deze afname verlaagt de kans op een shuttle-GFP statistisch verlaagd om in de kern te transporteren, waardoor de verzadiging in nucleaire fluorescentie bereikt wordt. De helling afgeleid van de lineaire initiële snelheid van de curve geeft de V max ingangsnelheid in de kern. - Analyseer de V max hellingen van elke cel patch, afgeleid van drie tot vijf onafhankelijke experimenten, met behulp van de grafische software om één helling te produceren die elke experimentele groep vertegenwoordigt. Voer kwantificering uit met behulp van one-way ANOVA statistische analyse.
5. Proteïne Expressie Validatie
- Plaats 60 mm kweekschotels die de resterende cellen bevatten (niet gebruikt in het bovenstaande experiment) van elke experimentele groep op ijs.
- Verwijder het medium en doe de cellen tweemaal met PBS om het resterende medium te verdunnen en te wassen.
- Behandel de cellen met 200-400ΜL lysisbuffer bevattende PBS, 0,5% Triton, en protease-inhibitor cocktail tablet (PI). Schrapen met een celschraper.
- Verzamel de cellen in lysisbuffer in een microcentrifugebuis en homogeniseer met 1 homogenizer bij 4000 rpm gedurende 1 min onder ijs.
- Centrifugeer de gehomogeniseerde cellen bij 2500 xg gedurende 10 minuten. Verzamel de supernatant, kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test, en bewaar tot gebruik bij -20 ° C.
- Verzamel tussen 30 en 70 μg totaal eiwit (afhankelijk van het eiwit) en laad het in een SDS-PAGE gel om te testen voor eiwit expressie met behulp van een immunoblot assay.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van de hier beschreven procedure werden motorneurachtige NSC-34 cellen getransfecteerd met een NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) eiwit. Dit eiwit, dat een NLS- en NES-signaalsequentie heeft ( Figuur 1 ), kan pendelen tussen de kern en het cytoplasma. Generieke GFP kan de nucleus binnengaan of verlaten bij afwezigheid van een lokalisatie signaalmerk alleen door diffusie en wordt daarom gelijkmatig verdeeld tussen de kern en het cytoplasma ( Figuur 2A )...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol toont een zeer gevoelige en kwantitatieve nieuwe analyse om de kleine veranderingen in nucleocytoplasmisch vervoer te evalueren. Met behulp van dit systeem is het mogelijk om nucleocytoplasmatisch transport en de dysfunctie ervan in real-time te observeren en te meten, niet alleen grote defecten die leiden tot dramatische veranderingen in eiwitverdeling. Deze analyse heeft niet alleen een gevoeligheids voordeel, maar vereist ook weinig voorbereiding, is goedkoop, en is een zeer makkelijke en lage-engagement...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij bedanken alle leden van het AI laboratorium voor hun nuttige opmerkingen en suggesties. Wij danken prof. Mark Hipp (Max Planck Instituut voor Biochemie) om ons te voorzien van de shuttle-GFP vector. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Israëlische Wetenschapsstichting (ISF # 124/14), de Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) en het National Institute for Psychobiology in Israël NIPI # b133-14 / 15).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A | |
| DMEM 4.5 g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 | |
| Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick | Bar Naor LTD | ||
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 | |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | ||
| Imaging Workbench 2 | Axon Instruments | ||
| Leptomycin B | Sigma | L2913 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE | |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
Referenties
- Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877(2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
