Method Article

Een methode om het effect van milieueisen op paring gedrag in te testen Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55690

⸱

July 17th, 2017

 , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We analyseren een analyse om de milieu- en genetische signalen te analyseren die invloed hebben op paringsgedrag in de vruchtvlieg Drosophila melanogaster .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De seksuele aandrijving van een individu wordt beïnvloed door genotype, ervaring en milieuomstandigheden. Hoe deze factoren elkaar interpreteren om seksueel gedrag te moduleren, blijven slecht begrepen. In Drosophila melanogaster beïnvloeden milieuechnieken, zoals beschikbaarheid van voedsel, paring, die een tracteerbaar systeem biedt om de mechanismen te onderzoeken die seksueel gedrag moduleren. In D. melanogaster worden milieuechnieken vaak genoteerd via de chemosensorische damp- en olfactorische systemen. Hier presenteren we een methode om het effect van milieuchemische signalen op paring gedrag te testen. De test bestaat uit een kleine paring arena met voedingsmedium en een parenpar. De paringsfrequentie van elk koppel wordt 24 uur per dag gecontroleerd. Hier presenteren we de toepasbaarheid van deze test om milieuverbindingen uit een externe bron te testen via een persluchtsysteem, evenals manipulatie van de milieukomponenten direct in de parkeerplaats. De uHet zien van een luchtdruksysteem met drukwerk is bijzonder nuttig om het effect van zeer vluchtige verbindingen te testen, terwijl het direct manipuleren van componenten in de paringsarena van waarde kan zijn om de aanwezigheid van een verbinding te bepalen. Deze analyse kan worden aangepast om vragen te beantwoorden over de invloed van genetische en milieueisen op paringsgedrag en fecunditeit, evenals ander mannelijk en vrouwelijk voortplantingsgedrag.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reproductieve gedragingen hebben meestal hoge energiekosten, vooral voor vrouwen, die grotere gameten produceren dan mannen en moeten zorgvuldig de voorwaarden kiezen om hun ontwikkelende nakomelingen te verhogen. Vanwege de energiekosten is het niet verwonderlijk dat reproductie verbonden is met voedingsomstandigheden. Dit geldt bij de meeste, zo niet alle dieren, waaronder zoogdieren, waarvan de puberteit kan worden vertraagd door ondervoeding, en wiens seksuele aandrijving negatief kan worden beïnvloed door voedselbeperking 1 .

De reproductie van het genetisch model organisme Drosophila melanogaster wordt ook beïnvloed door voedingsomstandigheden. Mannelijk hof op hoger niveau in aanwezigheid van voedsel vluchtige stoffen 2 , en vrouwtjes zijn meer seksueel ontvankelijk in aanwezigheid van gist, een belangrijke voedingsstof voor eierproductie en nakomelingen 3 , 4 , 5 . DezeEvolutionaire geconserveerde voortplantingsrespons op voedsel biedt de mogelijkheid mechanismen te bestuderen die de beschikbaarheid van voedsel voor het milieu verbinden met seksuele voortplanting in een genetisch tracteerbaar en tijd-efficiënt organisme. Inderdaad, werk in D. melanogaster heeft de insulineweg betrokken als een belangrijke regelaar van de verband tussen voedsel en paringsgedrag 6 . Het heeft ook aangetoond dat de daad van paring zelf de voedselvoorkeur van vrouwen verandert, evenals de bijbehorende chemosensorische neuronen 7 , 8 , 9 .

Het is duidelijk dat voedselaanwijzingen het voortplantingsgedrag beïnvloeden in D. melanogaster . Deze effecten lijken vooral te beïnvloeden vrouwen, met name degenen die al 5 hebben gemoeid. Om deze acute effecten van milieuomstandigheden te testen, kan de analyse die klassiek gebruikt wordt voor vrouwelijk paringsgedrag echterNiet erg geschikt als gevolg van de lange onderbrekingen tussen paringsafspraken. In de klassieke herhalende test, maagd een maagdvrouw eerst met een mannetje, en wordt onmiddellijk geïsoleerd en gepresenteerd met een nieuw mannetje 24 tot 48 uur later. Deze klassieke test is met groot succes gebruikt om componenten van het mannelijke ejaculaat te identificeren die het vrouwelijke gedrag en de vrouwelijke respons 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 veranderen . De doorlopende paringstest die hier wordt aangetoond, is dus een aanvulling op klassieke paringsbepalingen die kunnen worden gebruikt om het acute effect van milieuomstandigheden op het voortplantingsgedrag te bestuderen.

Met behulp van de continue analyse voor paringsgedrag die hier wordt uitgelegd, hebben we eerder aangetoond dat een paar vliegen die blootgesteld zijn aan gist, sEeuwige tijden over een 24 uur observatieperiode 5 , 19 , 20 , 21 , terwijl vliegen die niet aan voedsel blootgesteld worden, zal slechts een keer 5 herstellen. Deze bevinding kan puzzelend zijn in het licht van een groot deel van de D. melanogaster literatuur die aangeeft dat vrouwen niet meerdere dagen na een eerste paring remitten (in referenties 10 , 11 onderzocht). Deze discrepantie kan echter gemakkelijk worden verklaard door testomstandigheden, waarbij een vrouw voor een tot meerdere dagen wordt geïsoleerde voordat er een nieuwe paringsgevoel wordt aangeboden. Als het paar niet in deze uurlange observatietijd voldoet, wordt het vrouwtje niet beschouwd als ontvankelijk. Bovendien moet de hoge paringsfrequentie niet verrassend zijn, aangezien de gegevens van wild gevangen vliegen aantonen dat vrouwtjes sperma bevatten van 4 tot 6 mannen in hun opslagorganen; Dus inDiceren dat vrouwtjes natuurlijk meerdere malen 22 , 23 remmen.

Hier demonstreren wij het gebruik van deze continue paring test om te ontrafelen hoe vliegen verzamelen en combineren van informatie over milieuomstandigheden om de paringsfrequentie te moduleren. Deze test maakt het mogelijk om een ​​relatief groot aantal parende paren te testen voor genetische studies en om de invloed van vluchtige en niet-vluchtige milieubeelden te testen. De test loopt typisch 24 uur, maar kan worden uitgebreid tot 48 uur, waardoor het testen van cyclische milieubeelden zoals de lichtdonkere (LD) cyclus mogelijk is. We tonen deze analyse aan door de invloed van vluchtige signalen uit een gistcultuur in een drukluchtsysteem te testen in combinatie met de beschikbaarheid van niet-vluchtige gistvoedingstof in het voedingssubstraat.

Het perslucht systeem pompt voortdurend vluchtige signalen in een parkeerplaats die bevatEen voedingssubstraat en een testpaar (waarvan het paringsgedrag wordt gecontroleerd). Om verder te bepalen welke specifieke eigenschappen gist beïnvloedt, testen we een belangrijke vluchtige verbinding van gist, namelijk azijnzuur 24 , in combinatie met een aminozuurgehalte dat overeenkomt met die van gist in het voedingssubstraat, in de vorm van pepton (amino Zuren afgeleid van enzymatische vertering van dierlijke eiwitten). Samen tonen deze experimenten aan hoe het effect van milieu-signalen op het paringsgedrag van D. melanogaster met deze test kan worden getest.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Milieu gecontroleerde paringsbox

  1. Om een ​​gecontroleerd en makkelijk te reinigen testgebied te verzekeren, moet u een keukenkast van roestvrij staal van 120 cm x 64 cm x 85 cm installeren zoals geïllustreerd in figuur 1A.
    1. Boor een gat aan de achterzijde van de kast net onder het plafond en vier sets van vier gaten in de zijkanten, elk met een diameter van 2 cm. Boor de eerste twee sets van vier gaten aan weerszijden van de doos op een hoogte van 7 cm van de bodem van de doos en met 12,5 cm tussen de gaten. Boor de andere twee sets aan elke kant van de doos op een hoogte van 35 cm van de bodem.
      OPMERKING: De vier sets van vier gaten worden gebruikt voor camera stroomkabels en luchtpompslangen om de kast in te voeren en te verlaten. Het achterhoofd wordt gebruikt voor de stroomkabels van een lichtbord.
    2. Bouw een lichtbord met 18 rijen van 40 afwisselende witte en rode lichtgevende diodes (LED) met 2,5 cm ruimte tussen elk licht. Monteer de witte en rode LED's in een circuiT met voeding. Verbind elke LED in serie met een weerstand van 560 Ω, 0.25W en 5% tolerantie.
      OPMERKING: De emissiegolflengten van het rode licht spannen van 590-661 nm met een scherpe piek bij 627 nm. De resulterende lichtintensiteit in het experimentele gebied is ongeveer 900 lux met beide lichten aan en 90 lux met alleen de rode lichten aan; Dit werd gemeten met behulp van een smartphone light meter app.
    3. Bevestig het lichtbord aan de bovenkant van het roestvrijstalen kast en steek de stroomkabels door het gat aan de achterzijde.
    4. Sluit de adapter van de witte LED's aan op een stroomregelaar, om de witte LED in de donkere fase van het experiment uit te schakelen. Sluit de adapter van het rode licht aan, welke vliegen blind zijn voor 25 , op een regelmatige voeding om deze gedurende de gehele duur van het experiment aan te houden.
    5. Bevestig een 110 cm en twee 54 cm lange metalen haakjes, elk met een breedte van 0,5 cm, aan de binnenkant van de doos op een hoogte van 50Cm van de bodem van de doos. Plaats een matglasdiffusieplaat (afmetingen van 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) op deze haakjes.
    6. Voeg drie lagen filterpapier (120 cm x 50 cm) tussen het lichtbord en de glasplaat toe om het licht te diffuderen en de glans op het oppervlak van de parkeerplaatsen te beperken (beschreven in sectie 4). Plak twee filterpapierbladen op hun lange rand op 120 cm lange houten staven met magneten (aan de zijkant) om ze vast te houden aan de binnenkant van de metalen kast; Voer deze actie 3 keer uit.
    7. Bevestig vier ventilators aan de zijkanten van de doos om een ​​luchtstroom te creëren die de paringskast continu doorlaat. Bevestig de eerste set van 8 cm ventilatoren tussen het lichtbord en de glasplaat, met de inlaat van de lucht aan de linkerkant en de uitlaat aan de rechterkant van de doos, om de opbouw van warmte die door het lichtbord wordt gegenereerd te minimaliseren.
    8. Bevestig de tweede set van 12 cm fans 25 cm boven de bodem van de kast om een ​​uitwaartse luchtstroom te creëren die de iNside van de kast en koelt het naar een stal 26 ° C. Bevestig de ventilatoren aan de uitlaatzijde aan een zuigslang en leid de luchtstroom uit de kamer om te voorkomen dat de lucht in de kast opnieuw wordt gebruikt.
  2. Stel twee stands (ongeveer 48 cm lang) op met twee klemmen, een op 28 cm en een op 30 cm van de basis van de stand. Fixeer een webcam op elk van de klemmen. Sluit de 4 camera's aan op een computer die de monitoring software uitvoert.
  3. Plaats A4-lakens onder elke webcam. Gebruik onbedrukte witte lakens of lakens met voorgummerde ruiten van 7 bij 5 vierkanten met 4 cm assen om tegemoet te komen aan paringsarena's (beschreven in sectie 4).
    OPMERKING: een HD-webcam camera met 78 ° groothoekweergave en een resolutie van 5 miljoen pixels kan een gebied van 21 cm x 30 cm bedekken die overeenkomt met een A4-vel en een monitor tussen 20 en 35 parkeerplaatsen.

2. Flying en Collection

  1. Plaats 20 mannelijke en 20 vrouwelijke wild-type Canton-SVliegt in flesopvangflessen die 45 ml rijk vliegvoedingsmedium bevatten (zie rubriek 3) gedurende drie tot vier dagen. Breng dezelfde volwassenen drie keer door eerst ze te tikken en vervolgens in verse flessen.
    1. Plaats de flessen in een broeikas bij 25 ° C en 12 uur: 12 uur lichtdonkelcyclus met lampen om 09:00 (Zeitgeber tijd (ZT) 0). Een nieuwe generatie zal ongeveer 10 dagen later verschijnen.
  2. Verdoof de resulterende, nieuwe verduisterde vliegen op kooldioxide pads voor niet meer dan 5 minuten en haal ze in flesvoedselflessen op met een verfborstel.
    1. Verzamel maagden (nieuwe eclosed) vrouwelijke en maagdelijke mannen uit de wild-type Canton-S- voorraadflessen in 2,5 cm x 9,5 cm vlieghoogteflessen met 6,5 ml rijkvliegvoedselmedium.
  3. Leeftijd die vliegen in dezelfde geslachtsgroepen van 20 vliegt in 5 tot 8 dagen bij 25 ° C en 12 uur: 12 uur lichtdonk cyclus en licht om 09:00 (ZT 0).
  4. transfDe vliegen naar verse vliegende opvangflessen op de dag voor het experiment.

3. Voedselmedium Voorbereiding

  1. Bereid 1 liter rijk vliegmedium als volgt uit.
    1. Giet 1 liter kraanwater in een 2 liter glazen beker met een magnetische roerbalk en plaats de beker op een magnetische kookplaat. Houd het roeren af ​​en draai de verwarming tot 300 ° C tot de kooktemperatuur bereikt is.
      OPMERKING: Tijdens de lange kooktijd in de volgende stappen verdampt een deel water, maar samen met de toegevoegde ingrediënten resulteert dit protocol in 1 liter rijk vliegmedium bij kamertemperatuur van ongeveer 22 ° C.
    2. Roer de roer op tot 500 ronden per minuut (rpm) en voeg de volgende ingrediënten toe aan het kokende water: 10 g agar, 30 g glucose, 15 g sucrose, 15 g maïsmeel, 10 g tarwekiem, 10 g sojamel, 30 g Melasse, 35 g actieve droge gist. Wacht tot de gist krachtig schuimt en draai de temperatuur van de hete plaat afVeroudering tot 120 ° C.
    3. Na 10 min. Draai de kookplaat tot 30 ° C en laat het mengsel roeren totdat het afgekoeld is tot 48 ° C. Monitor temperatuur door een thermometer direct in het voedsel in te voegen.
    4. 2 g p-hydroxybenzoëzuurmethylester (tegosept, 100%) opgelost in 10 ml 96% ethanol. Voeg dit en 5 ml 1 M propionzuur toe aan het mengsel. Roer gedurende 3 minuten.
    5. Giet het vliegvoedingsmedium in de arena's (beschreven in sectie 4) om een ​​0,3 cm dikke laag aan de onderkant van de arena te maken.
      1. Gebruik een 200 ml glazen beker voor het gieten. Wanneer exacte hoeveelheden belangrijk zijn, gebruik een 10 ml serologische pipet.
  2. Bereid vliegmedium minus gist precies zoals beschreven in stap 3.1.1 tot en met 3.1.5, maar laat de gist in stap 3.1.2.
  3. Bereid medium met agar met of zonder pepton door 10 gram agar en 35 g pepton in 1 liter kokend water te mengen en stap 3.1.4 tot 3.1.5 uit te voeren.

4. MatinG Arena Voorbereiding

  1. Pierceer een gat ongeveer 0,3 cm in diameter aan de bovenkant van een 3,5 cm x 1,0 cm kunststof Petri-schotel met een verwarmde voorbereidingsnaald (verwarmd tot roodheid in een Bunsen-brander). Alternatief, gebruik een soldeerbout.
  2. Bij het bereiden van voedingsmedium met geurige verbindingen, eerste pipet 30 μL (1% van het uiteindelijke voedingsmedium, bijv. 100% azijnzuurzuurglazen) van de gewenste verbinding in de schotel voor de helft van de experimentele afwas. Laat de andere helft van de afwas legen ter vergelijking.
    OPMERKING: Met de hier beschreven beschrijving kan maximaal 140 arena's tegelijk worden getest.
  3. Giet met behulp van een 10 ml serologische pipet, 3 ml voedselmedium aan de onderkant van de schotel bovenop de gewenste verbinding. Bedek het met een kaasdoek om vervuiling te voorkomen en laat het medium ongeveer 1 uur bij kamertemperatuur stollen.
  4. Plaats een deksel op de afwas en plak ze aan beide kanten aan elkaar. Maak kleine paraffine filmproppen voor de gaten vanDe afwas door rollende stukjes paraffine film in 0,2 cm dikke rollen en snijd ze vervolgens in segmenten van 0,5 cm.

5. Gistcultuur voor geur

  1. Groei droge actieve gist op gistextractpeptondextrose (YPD) agar in een petroschotel van 14,0 cm x 2,06 cm. Draag handschoenen om contaminatie in deze stap te voorkomen.
    1. Bereid YPD agarplaten door 10 g gist extract, 20 g pepton, 22 g glucose (0 (+) - glucose monohydraat) en 15 g agar (zuiver) toe te voegen aan 1 liter kokend ultrauw water. Laag de bodem van de Petri-schotel wanneer alles is opgelost en in de koelkast bij 4 ° C, voor maximaal 2 maanden, opslaan.
    2. Sprinkel een paar korrels gedroogde gist op een YPD-mediumplaat, laat ze oplossen. Doe vervolgens de middelste plaat met een steriele lus. Bewaar de plaat in een 30 ° C incubator 's nachts. Bewaar daarna de cultuur in de koelkast voor maximaal 1 week.
  2. Bereid YPD vloeibaar medium iN 1 liter flesjes door 10 g gist extract, 20 g pepton, 22 g glucose (0 (+) - glucose monohydraat) en een roerbalk toe te voegen aan 1 liter ultraperout water.
    1. Autoclaaf gedurende 25 minuten bij 120 ° C en 1 bar druk. Bewaar daarna de flessen bij 4 ° C gedurende maximaal 2 maanden tot gebruik.
  3. Plaats open flesjes (4,5 cm) met een 0,35 cm dik siliconen septum.
    1. Knip twee kleine gaten in het septum om de barbedschroefkoppelingen goed te passen. Bevestig de kleine buis van polyvinylchloride (PVC) (diameters: buitenkant 0,8 cm en binnenkant 0,5 cm) aan beide uitlaten die de fles verlaten en op slechts een van de inlaten die de fles binnendringen. Zie afbeelding 1B voor illustratie.
    2. Wikkel de gemonteerde kappen en buizen in aluminiumfolie en autoclaaf gedurende 25 minuten bij 120 ° C en 1 bar druk.
  4. Draag handschoenen ter bescherming tegen verontreiniging in deze stap. Dip een steriele 100 μL pipettip in een van de gistkolonies van de YPD-agarplaat (dVerkleind in 5.1) en laat het in de geautoclaveerde YPD vloeibare medium fles.
    1. Cap deze gist-geïnoculeerde YPD vloeibare medium fles evenals een YPD medium controle fles (niet toegevoegd) met autoclave caps die gemonteerd zijn met in- en uitlaat (beschreven in stap 5.3). Zet beide flessen op afzonderlijke magnetische platen en roer bij 100 rpm bij kamertemperatuur gedurende 24 uur voor het begin van het experiment om de gistkweek te laten groeien.
    2. Verbind de inlappen van beide flessen om de aquariumpompen te scheiden om de gistcultuur te voorzien van lucht. Zorg ervoor dat u de uitlaat van de experimentele gistfles aansluit op een buis dat de gist ruikt uit de experimentele kamer om interferentie met het experiment te voorkomen.

6. Luchtpomp instellen

  1. Bevestig de grote PVC-buis (diameters: buitenkant 1,2 cm en binnenkant 0,9 cm) naar een persluchttoevoer en leid het door twee 1 L glas Erlenmeyer-flessen gevuld met geactiveerde houtskool aan de 800 mlLijn om de lucht te zuiveren. Gebruik ofwel lucht onder druk die gewoonlijk in laboratoria wordt geleverd als luchttoevoer, of koppel de buizen aan op een luchtpomp (hier werd de lucht gebruikt).
    OPMERKING: Slangmateriaal dient te worden geselecteerd op basis van de chemische eigenschappen van de vluchtige en getest om te voorkomen dat de vluchtige zich vasthoudt aan de voering van de buis (bijvoorbeeld polytetrafluoroethyleen, nylon of roestvrij staal).
  2. Maak twee luchtsplitsers uit 15 ml buizen en drie 1.000 μL pipettips elk.
    1. Maak drie gaten met een diameter van 1 cm. Eerst twee gaten verbranden, met een verwarmde voorbereidingsnaald (verwarmd rood in een Bunsenbrander), grenzend aan elkaar net onder het deksel van de 15 ml buis. Maak vervolgens het derde gat door de bodem van de buis te verwijderen.
    2. Plak de 1.000 μL pipetpunten in de gaten met het smalle uiteinde naar buiten gericht. Knip het uiteinde van de pipetstippen om een ​​grotere luchtstroom toe te staan.
  3. Sluit de grote PVC-buis aan op de uitlaat van de cKolen-gevulde Erlenmeyer-fles aan de pipetpunt onderaan de 15 ml buis. Voeg kleine PVC-buizen aan de twee horizontale pipetpunten toe en leid ze naar een controle en een experimentele fles.
  4. Om de verontreiniging van het YPD-medium tegen micro-organismen te voorkomen, bevestig de kleine buis aan een steriel injectiespuitfilter (0,45 μm poriegrootte) met een kunststof duw op de schroefdraadverbinding naar het filter en een schroef op een plastic schroefverbinding die het filter verlaat. Bevestig vervolgens de buis aan de inlaat van de YPD cultuurfles (zie figuur 1B ).
  5. Om te voorkomen dat luchtgist vanaf de kolffles naar de experimentele arena reist, bevestigt u een glazen buis (6,5 cm lang, buitendiameter = 0,5 cm en binnenste diameter = 0,3 cm) aan de uitlaat van elke YPD-cultuurfles met kleine buizen. Bevestig de PVC-buis aan de andere kant van de glazen buis en leid dit naar de onderste gaten (aan beide zijden geboord) van het proefdoos.
    1. Vul de buis met glasvezel en autoklaaf het voor gebruik.
  6. Voeg een andere 15 ml buisplitter (beschreven in punt 6.2) toe aan de kleine PVC-buis aan weerszijden van de proefkist om twee buizen in de doos op beide experimentele zijden te krijgen (dichtstbijzijnde uitlaat van de ventilatorluchtstroom rechts) En de bedieningszijde (dicht bij de inlaat van de ventilatorluchtstroom, links).
  7. Bereid 8x 25 ml serologische pipetten elk met 10 uitgangen om 80 paren paren tegelijkertijd te testen, dwz 40 voor elke luchtconditie.
    1. Breng 10 gaten met een diameter van 0,8 cm, 2 cm uit elkaar in de pipet.
    2. Knip het buitenste gedeelte van een 1 ml spuit in een kleine (2,5 cm) en een grote (5 cm) uitlaat.
    3. Plak deze afzettingen in de gaten met hete lijm.
    4. Wikkel een klein stukje plastic paraffinefilm rond het uiteinde van de afzettingen en bevestig een pipetpunt van 1000 μL. Diameter van de puntopening is 0,1 cm. Gebruik schone tips voor elk experiment.
  8. Bevestig twee serologische pipetten met behulp van een T-splitter met een buitendiameter ≥0,5 cm en korte stukken kleine PVC-buizen aan beide kanten aan beide kanten. Tape de pipetten plat op het wit papierblad (onder de camera's in de stalen doos).
  9. Met behulp van een luchtstroommonitor stelt u de luchtstroom in zodat de luchtsnelheid bij de uitgang van de 1000 μL pipetpunt 0,5 m / s bedraagt. Dit komt overeen met een luchtstroom van 0,0017 L / s per punt.

7. Toezicht op paringsgedrag

  1. Gebruik een mondpipet (zoals beschreven in referentie 26 ) om 15:00 uur (ZT 6) een experimentele vrouw in een kleine Petri-schotel (beschreven in sectie 4) te plaatsen en haar 1 uur te acclimatiseren naar de parkeerplaats.
  2. Stel de experimentele doos (beschreven in sectie 1) als volgt op:
    1. Zet de lichten aan, dwz witte LED's op een 12 uur: 12 uur lichtdonkere cyclus aangesloten op een timer die deLicht om 09:00 (ZT0) en continue rode LED-LED's om toezicht te houden op de vliegen tijdens de donkere fase van het experiment. Zet de ventilatoren aan om de verwarming van de kast door de lichtbron te beperken en om te voorkomen dat overmatig geur buiten het testgebied wordt uitgezet.
    2. Sluit webcam camera's aan op een computer en start ze met de monitoring software voor beeldbewaking.
    3. Voor elke camera zet u de focus, helderheid en zoom in op de monitoring software.
      1. Klik met de rechtermuisknop op het camera scherm, open "camera eigenschappen" en unclick "automatische focus." Pas de "focus" aan om het raster of eventuele geschreven woorden op het papierblad te verduidelijken. Verander indien nodig de "helderheid" en "zoom".
    4. Stel het programma van de bewakingssoftware in om elke 2 minuten een foto te maken. Klik met de rechtermuisknop op elk camera scherm en kies 'bewerken camera' en dan de optie 'Acties'. Klik om de acties te starten "Bij gewone intErvals "en verander de tijd naar" 2 minuten. "Kies" Take Photo "voor selecte acties om te doen en eindelijk op" ok "te klikken.
    5. Klik met de rechtermuisknop op elk camera scherm en selecteer 'start monitoring'.
  3. Vervolgens na 1 uur (bij ZT 7) een wildtype-mannetje naar de Petri-schotel met behulp van de mondpipet, plaats de schotel op de A4-papierplaten onder de webcamcamera's en klik op 'Monitor monitoring' gedurende 24 uur. Voor het luchtpompexperiment plaatst u de schotel op zodanige wijze dat er een pipetuitgang is aangesloten op het ingangsgat van de parkeerplaats.
  4. Om het paringsgedrag van het echtpaar te analyseren, doe het volgende.
    1. Selecteer en open alle foto's in een beeldweergave-software en blad ze door in chronologische volgorde.
    2. Schrijf de datum, het experimentnummer, het schotelnummer en de starttijd in een spreadsheet in dezelfde rij in. Neem de starttijd van elke arena vanaf het moment dat het onder de webca staatM camera. Noteer de tijdstempel van de foto's.
    3. Markeer de starttijd van elke copulatie in dezelfde rij in de spreadsheet. Tel een paring als incident wanneer het mannetje het vrouwtje heeft gemonteerd en het paar blijft matig stationair en in dezelfde houding voor tenminste vijf opeenvolgende frames (10 min).
      OPMERKING: Dit criterium is gebaseerd op de gemelde lengte van de copulatie, variërend van 12 tot 27 minuten in D. melanogaster , en de waarneming dat copulaties van 10 min en meer vruchtbaar zijn 27 , 28 .
    4. Tel het aantal copulaties voor elke rij in de spreadsheet om de koppelingsfrequentie te bepalen. Als alternatief trekt u de starttijd van het experiment af vanaf de tijd van de eerste paring voor elke rij als maatregel van paring latency, of aftrek de tijd van de eerste paring vanaf de tijd van de tweede paring als maatregel om latentie te remmen.
      1. Om de rematietijd te berekenen, zorg ervoor datDefinieer de data van de eerste en tweede paring als opeenvolgende dagen in de spreadsheet software.
    5. Analyseer de gegevens met gemengde effectenmodellen, waarbij de normale verdeling van de gegevens wordt verondersteld en de datum van het experiment als een willekeurige factor wordt opgenomen, met behulp van een statistische software (zie de tabel van materialen) om de statistische betekenis van het onafhankelijke variabelen-voedselmedium te bepalen, Lucht type en interactie-zoals eerder beschreven 5 .
    6. Selecteer het beste uitlegmodel door de terugwaartse eliminatie van niet-significante onafhankelijke variabelen uit te voeren met behulp van log-waarschijnlijkheidsverhoudingstesten en de bijbehorende Akaike-informatie. Nadat u het model hebt uitgevoerd, inspecteert u de gegevensresiduen visueel om de normaliteit te bevestigen. Bevestig de homogeniteit van afwijkingen met behulp van de test van Levene. In geval van ongelijkmatige homogeniteit, transformeren de vierkante wortel de gegevens.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van deze continue analyse, paringsgedrag en paringsfrequentie in specifiek, kan worden bepaald onder experimentele omgevingsomstandigheden. Om de omgevingsomstandigheden te beheersen, hebben we een roestvrijstalen keukenkast in een testgebied omgezet, met zijn eigen lichtbron en diffusie, die een hoge overvloed van licht en een minimale hoeveelheid schittering van de bovenkant van de parkeerplaatsen garandeert ( Figuur 1A ) . Het binnenste testgebied is volled...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een test om het 24-uurse gedragsgedrag te testen, terwijl de milieu-signalen voortdurend worden gecontroleerd dat een parenpar wordt verondersteld om te gebruiken om de paringsfrequentie te bepalen. Het is mogelijk om de paringsfrequentie te verhogen in reactie op gistlucht die via een persluchtsysteem wordt geleverd wanneer het medium ook gist bevat ( Figuur 2B ). Bovendien kan een soortgelijk antwoord in paringsfrequentie worden waargenomen met een vereenvoudigd voedingsmedium ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende belangen om bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het Bloomington Drosophila Stock Center voor de vliegvoorraden; C. Gahr, JT Alkema en S. van Hasselt voor hun vroege poging tot het ontwikkelen van de luchtdrukonderzoek; Jasper Bosman voor advies over het cultiveren van gist; En Rezza Azanchi en Joel Levine voor het oorspronkelijk ontwikkelen van de time-lapse monitoring van Drosophila paring gedrag. JA Gorter werd gesteund door een subsidie ​​van de Neuroscience Research School BCN / NWO. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) (referentie: 821.02.020) aan JC Billeter.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

```html

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cabinet
Stainless steel kitchen cabinetHorecaworld7412.0105
White LEDsLucky Lightll-583wc2c-001Koude wit, 20 mAmp en 2 V
Red LEDsLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daGolflengte tussen 625 nm, 20 mAmp en 6 V
ResistorRoyal OhmCFR0W4J0561A50560 ohm, 0,25 W, 250 V en 5% tolerantie
Smartphone light meter appPatrick GiudicelliLight/Lux Meter GRATIS, versie 1.1.1
Power timerAlectoTS-121
Metal bracketsScherpe hoek 5 bij 5 mm,  2 x 5450 en 1 x 1100 mm lang
Frosted glass plate1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheetsLEE filters220Wit mat
Small fanNanoxia Deep silence426028529282880 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fanNanoxia Deep silence4260285292910120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam cameraLogitech950270B910 HD WEBCAM OEM, Hoek: 78-graad, resolutie: 5-miljoen-pixel  
Camera softwareDeskShareSecurity monitor pro
NameCompanyCatalog NumberComments
Fly rearing
Fly rearing bottlesFlystuff32-1306oz Drosophila stock bottle
FlypadFlystuff59-114
Wild-type fliesCanton-S
Fly rearing vialsDominique Dutscher789008Drosophila tubes narrow 25x95 mm
IncubatorSanyoMIR-154
Magnetic hot plateHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Ingredients B.V.010001.26.0
GlucoseGezond&wel1019155Dextrose/Druivensuiker
SucroseVan GilseGranulated sugar
CornmealFlystuff62-100
Wheat germGezond&wel1017683
Soy flourFlystuff62-115
MolassesFlystuff62-117
Active dry yeastRed Star
TegoseptFlystuff20-258100%
Peptone (bacto)BD211677
Acetic AcidMerck1000631000Glacial, 100%
Small petridishGreiner bio-one62710235 x 10 mm met ventilatieopeningen
Paraffin filmBemis NAParafilm
NameCompanyCatalog NumberComments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridishGosselinBP140-01140 x 20,6 mm
Ultrapure waterMillipore corporationMiliQ
Yeast extractBD212750
Agar (pure)BD214530bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate) Merck18270000004
Open capsSchott29 240 28 GL45
Silicone septumVWR548-0662
Barbed bulkhead fittingsNalgene6149-0002
Large PVC tubingdiameter: buiten 1,2 cm en binnen 0,9 cm
Small PVC tubingdiameters: buiten 0,8 cm en binnen 0,5 cm
15 ml tubeFalcon
Aquarium pumpSera precisionSera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W en druk >100 mbar
Activated charcoalSuperfishA8040400Norit geactiveerde kool
Disposable filter unitWhatman10462100
Serological pipettesVWR612-1600
SyringeBD Plastipak300013
Hot gluePattex
Syringe filterWhatmanFP 30/pore size 0,45 mm CA-S
NameCompanyCatalog NumberComments
Analysis
Statistics softwareRlme4 package
```

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575(2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Mating BehaviorEnvironmental CuesReproductive BehaviorsBehavioral AssayFood Medium PreparationChemosensory SystemsMating FrequencyPressurized Air SystemVolatile CompoundsFemale Receptivity

Related Articles