Methodenartikel

Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding

DOI:

10.3791/55697

⸱

13 juni 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze procedure beschrijft hoe snel neurieten georganiseerd in microfluïdische kamers kunnen initiëren, verlengen en verbinden met behulp van poly-D-lysine beklede kralen die zijn bevestigd aan micropipetten die leiden tot neuriet verlenging.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brain en ruggenmerg letsel kan leiden tot blijvende invaliditeit en dood, omdat het nog steeds niet mogelijk is om neuronen te regenereren over lange afstanden en ze nauwkeurig opnieuw te verbinden met een geschikt doelwit. Hier wordt een procedure beschreven om snel te initiëren, verlengen en nauwkeurig nieuwe functionele neuronale circuits over lange afstanden aan te sluiten. De toegevoerde uitbreidingssnelheden bereiken meer dan 1,2 mm / u, 30-60 keer sneller dan de in vivo- snelheden van de snelst groeiende axonen van het perifere zenuwstelsel (0,02 tot 0,04 mm / u) 28 en 10 keer sneller dan eerder gemeld voor hetzelfde Neuronale type in een vroeger stadium van ontwikkeling 4 . Ten eerste worden geïsoleerde populaties van rathippocampale neuronen gedurende 2-3 weken in microfluïdische inrichtingen geteeld om de cellen nauwkeurig te positioneren, waardoor gemakkelijke micromanipulatie en experimentele reproduceerbaarheid mogelijk zijn. Vervolgens worden kralen bedekt met poly-D-lysine (PDL) op neurieten geplaatst om lijmconstructie te vormenDaden en pipette micromanipulatie wordt gebruikt om het resulterende kraal-neurietcomplex te verplaatsen. Naarmate de kraal wordt verplaatst, trekt het een nieuwe neuriet uit die over honderden micrometers kan worden verlengd en functioneel in een doelcel in minder dan 1 uur verbonden is. Dit proces maakt experimentele reproduceerbaarheid en gemak van manipulatie mogelijk, terwijl langzamere chemische strategieën worden omzeild om neurietgroei te stimuleren. Voorlopige metingen die hier worden gepresenteerd, tonen een neuronale groeitempo ver boven fysiologische Door deze innovaties te combineren staat de precieze vestiging van neuronale netwerken in cultuur met een ongekende mate van controle mogelijk. Het is een nieuwe methode die de deur opent voor een overvloed aan informatie en inzichten in signaaloverdracht en communicatie binnen het neuronale netwerk, alsook een speeltuin om de grenzen van neuronale groei te verkennen. De mogelijke toepassingen en experimenten zijn wijdverspreid met directe implicaties voor therapieën die gericht zijn op het opnieuw aansluiten van neuronaL circuits na trauma of in neurodegeneratieve ziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schade aan het volwassen centrale zenuwstelsel (CNS) kan leiden tot blijvende handicap door meerdere mechanismen die axonale hergroei beperken 1 . Na aanleiding van het letsel vormen veel CNS-axons geen nieuwe groeikegel en worden er geen effectieve regeneratieve respons opgebouwd 2 . Bovendien, schade en littekenweefsel rondom CNS laesies belemmeren axonale groei 1 , 2 , 3 significant. Huidige therapieën ter bevordering van CNS-regeneratie na verwonding hebben gericht op het vergroten van het intrinsieke groeipotentieel van de gewonde neuron en op het maskeren van de remmers van de axonale verlenging geassocieerd met myeline puin en de glialarc 1 , 3 . Desondanks blijft de mogelijkheid om lange axonen te verteren naar verre doelen en om passende functionele synaptes te vormen, sterk beperkt 4 , 5 , 6 , 7 .

In het huidige werk worden microbeads, pipette micromanipulation en microfluidische apparaten gebruikt om snel nieuwe initiatieven te verlengen, verlengen en nauwkeurig nieuwe, functionele neuronale circuits over lange afstanden aan te sluiten. Vorige werk heeft aangetoond dat poly-D-lysine-beklede kralen (PDL-kralen) membraanhechting veroorzaken, gevolgd door de clustering van synaptische vesikelcomplexen en de vorming van functionele presynaptische boutons 8 . Het werd ook gebleken dat wanneer de PDL-kraal mechanisch weggetrokken wordt na de presynaptische differentiatie, de synaptische eiwitcluster volgt op de kraal, waarbij een nieuwe neuriet wordt geïnitieerd 9 . De volgende procedure exploiteert dit feit samen met het vermogen om embryonale hippocampale neuronen van ratten te culturen in georganiseerde gebieden op een deklaag met gebruikmaking van polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische inrichtingen om een ​​neuronalecircuit.

Deze PDMS microfluidische apparaten zijn niet-giftig, optisch transparant en bestaan ​​uit twee kamers verbonden door een systeem van microkanalen. Eenmaal op een deklaag gemonteerd, dient elk apparaat als een vorm om neuronale groei te leiden en gezonde neuronale culturen op nauwkeurige patronen langer dan 4 weken in vitro te handhaven .

Hier wordt een kader voorgesteld om de grenzen van uitbreiding en functionaliteit van de nieuwe neuriet te onderzoeken. Nieuwe, functionele neurieten worden gecreëerd en gepositioneerd voor controllable (re) wire neuronale netwerken. De toegevoerde uitbreidingssnelheden zijn sneller dan 20 μm / min over afstanden van millimeters en functionele verbindingen worden vastgesteld. Deze resultaten tonen onverwacht dat de intrinsieke capaciteit van deze neurieten voor verlenging veel sneller is dan eerder gedacht. Deze voorgestelde mechanische aanpak omzeilt langzame chemische strategieën en zorgt voor een gecontroleerde verbinding met een specifiek doel. thIs techniek opent nieuwe mogelijkheden voor de in vitro studie van nieuwe therapieën om neuronale connectiviteit na herstel te herstellen. Het maakt ook het manipuleren en herbinnen van neuronale netwerken in staat om fundamentele aspecten van neuronale signaalverwerking en neuronale functie in vitro te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hieronder beschreven procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van McGill University en conform de richtlijnen van de Canadese Raad van Dierensorg.

1. Normalisatie van neuronale culturen met behulp van microfluïdische apparaten: Apparaatmontage

  1. Selecteer een geschikt microfluïdisch apparaat voor het gewenste experiment. Om neuronen in dezelfde populatie te verbinden, gebruik de Neuro Devices ( Figuur 1 ) en verbind neuronen in verschillende populaties met behulp van de Co-Culture Devices ( Figuur 6 ).
  2. Reinig en berei het gewenste aantal steriele deklagen of glazen bodemschotels op. Voor de beste resultaten op plastic oppervlakken gebruik 35 mm afwas, op glazen gebruik 25 mm dekglazen, of 35 mm glazen bodemschotels. Selecteer de glasdikte op basis van het beeldsysteem, bijvoorbeeld 0,15 mm.
  3. Bedek de afwas of deklijsten met 0,5-1 ml 100 μg / ml PDL gedurende 2 uur of overnacht bij kamertemperatuurAard.
    Opmerking: Protocol kan hier worden onderbroken en indien gewenst hervat de volgende dag. Bovendien kunnen de schalen worden bekleed met boraatbuffer verdunde PDL, Poly-L-Lysine (PLL), laminine of enig ander celadhesiemolecuul.
  4. Was de afwas tweemaal met water (gebruik geen fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), aangezien zoutkristallen de kanalen kunnen blokkeren), verwijder alle vloeistof en laat het drogen in een steriele omgeving, zoals een biosafetykastje gedurende 5-10 minuten of tot Het oppervlak is helemaal droog.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de deklagen absoluut droog zijn, aangezien elke overblijvende vloeistof de microfluïdische systemen in acht zal nemen.
  5. Plaats microfluïdische apparaten met patronen onder UV-licht in een steriele omgeving (biosafety-kast) gedurende 10 minuten. Zorg ervoor dat u steriele procedures volgen bij het werken in de biosafety-kast 10 .
  6. Gebruik een pincet met een microfluïdisch apparaat met patroon naar beneden gericht in contact met de schone doekjesip / schotel. Gebruik de pincet om het apparaat zacht te drukken zodat het aan het glas vasthoudt.
    Opmerking: De doorzichtigheid van het vastgelegde gebied zal zichtbaar zijn wanneer u naar het licht kijkt. Zorg ervoor dat alle hoeken contact opnemen met het glas. Doe dit aan alle microfluidische apparaten. Zie figuur 1a .
  7. Om het enkele populatie apparaat met medium te vullen, wijs de pipet naar de kanalen en voeg 50 μL compleet celmedium toe dat met serumvrije B-27 (volumeverhouding 1:50) en 500 μg / ml penicilline / streptomycine / glutamine (collectief Genaamd NBM) naar de rechter bovenste put, en voeg nog eens 50 μL toe aan de bril die diagonaal daar ligt. Doe dit voor alle apparaten, zorg ervoor dat het medium tussen de putjes stroomt. Voeg daarna 50 μL medium toe aan de overige 2 putjes. Zie figuur 2a .
    1. Om het meervoudige populatie apparaat met medium te vullen, wijs de pipet naar de kanalen en voeg 30 μL toeVan de volledige NBM naar de rechter putten, zie figuur 6a . Doe dit voor alle apparaten, zorg ervoor dat het medium tussen de putjes stroomt. Voeg vervolgens 50 μl medium toe aan de overige 4 putjes.
  8. Plaats de apparaten in een grotere plaat met een open schotel met geautoclaaf water (natte kamer) en plaats gedurende 1-2 uur in de incubator (37 ° C, 5% CO 2 en 95% vochtigheid) tijdens het bereiden van de celcultuur. Zie figuur 2b .

2. Plating Neuronen in Microfluidische Systemen

  1. Volgend het protocol beschreven in Ref. 8 , ontleende hippocampale of corticale neuronen van Sprague Dawley rat embryo's (ofwel geslacht) verkrijgen.
  2. Resuspende embryonale neuronen in NBM bij een concentratie van 1-2 miljoen neuronen / ml. Controleer de celconcentraties in de microscoop met behulp van een hemocytometer en de volgende referentie 8 . Pas de celconcentratie overeenG naar de gewenste celdichtheid. Om de kansen te vergroten om enkele hippocampale axonen per kanaal te verkrijgen, plaatst u 10.000 neuronen per apparaat. Om meerdere axonen in hetzelfde kanaal te hebben, plaat 60.000 neuronen per apparaat.
    Opmerking: Deze cijfers variëren afhankelijk van het gebruikte neuronale type.
  3. Verwijder het medium uit de microfluïdische toestellen zonder de putjes leeg te maken. Laat ongeveer 5 μL in elk.
  4. Om cellen in het enkele bevolkingsapparaat te platen, voeg 50 μL NBM aan de rechteronderkant toe. Op dit moment stroomt het medium op zich om de andere onderste put te vullen. Voeg 20 μL van de concentraatceloplossing toe in de rechter bovenkant van de microfluïdische inrichting, zoals aangegeven in figuur 1b .
    1. Om cellen in het meervoudige populatie-apparaat te platen, voeg 20 μL van de concentraatceloplossing toe in elk van de juiste putten in figuur 6a .
  5. Controleer in de microscoop als cellenBevinden zich in de kamers en plaats de apparaten in de incubator gedurende 15-30 minuten om celbevestiging aan het substraat te bevorderen.
  6. Controleer in de microscoop als er genoeg cellen in de kamers zijn. Als meer nodig zijn, herhaal stap 2.4 en 2.5.
  7. Voeg 50 μL NBM toe aan de 2 topputten van het enkele populatie-apparaat en 20 μL NBM in dezelfde put als de cellen werden geïnjecteerd in het meervoudige populatie-apparaat. De media steken licht uit om een ​​positieve meniscus te vormen waardoor de putjes een muffin top aspect geven. Nogmaals, zie figuur 2a .
  8. Bewaar de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.

3. Onderhoud van de neuronale culturen

  1. Verwijder NBM (ongeveer 30 μL met een pipet) van de cellen en pas de nieuwe voorverwarmde NBM toe op de dag na de introductie van de apparaten (dat is 1 d na stap 2).
  2. Controleer elke 2 dagen als er voldoende medium is in elk kanaal. Als de muffin tOp is laag, voeg gewoon meer medium toe aan de bovenste putjes.
  3. Cultuurcellen voor ten minste 7 d voor verwijdering van de microfluïdische inrichtingen. De cellen kunnen gedurende meerdere weken in deze apparaten overleven. Verwijder de apparaten 1-2 dagen voordat experimenten op monsters worden uitgevoerd.

4. Verwijdering van microfluïdische apparaten

  1. 1 - 2 d voor het verwijderen van microfluïdische apparaten, voeg 2 ml NBM bij 37 ° C bij elke monsterschotel toe, overstroom de kamers en houd de apparaten in de incubator.
  2. Gebruik steriele tweezers en een tip om de microfluidische apparaten uit de deklips te verwijderen, waardoor een patroonconfiguratie van neuronen wordt verlaten. Gebruik de tip om de deksel op zijn plaats te houden en de pincet om de rand van het apparaat in de onderste linkerhoek van de put te klampen. Scherp torsie aanbrengen, verhoging van het apparaat met de pincet zodat het de dekglijbaan afschilt. Zie figuur 2c - 2d .
  3. Elke 2-3 dagen vervang haAls de NBM tot het monster wordt gebruikt voor experimenten.
  4. Voordat u de rewiring experimenten op het monster uitvoert, controleer dan dat neurieten in de kanalen van het enkele bevolkingsapparaat en de neuronale populaties in het meervoudige populatie-apparaat worden geïsoleerd door de gaten tussen hen in de microscoop te onderzoeken om ervoor te zorgen dat er geen filamenten die neuronale populaties koppelen.

5. Voorbereiding van PDL-gecoate kralen

  1. Voeg 2 x 50 μL druppels van 4, 10 of 20 μm polystyreen kralen toe, verdund in water (1: 500) tot 1 ml PDL (100 μg / ml). Laat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Protocol kan hier worden onderbroken en hervat de volgende dag.
  2. Centrifugeer de oplossing bij 8.820 xg gedurende 1 minuut. Verwijder de supernatant zorgvuldig zonder de kralen die op de bodem van de container zijn opgeslagen te storen.
  3. Was de kralen tweemaal met 1 ml steriele 10 mM HEPES pH 8,4 oplossing.
  4. Resuspendeer de PDL-gecoate kralen in 200 ml 10 mM HEPES pH 8,4oplossing.

6. Micropipetten voorbereiden

  1. Bereid pipetten uit glazen capillaire buizen (1 mm binnendiameter, 1,5 mm buitendiameter) met behulp van een horizontale elektrode trekker. Pas de instellingen aan zodat de buitenste punt van de getrokken micropipette ~ 2-5 μm is. Zorg ervoor dat de glazen buizen schoon zijn alvorens te trekken.
  2. Bevestig pipetten aan glazen glijbanen voor opslag en zorg ervoor dat de punt niet aan het oppervlak van de glijbaan komt, aangezien het uiteinde breekbaar is. Bewaar bij kamertemperatuur in een overdekte container om van stof te beschermen. Gebruik de pipetten dezelfde dag als ze getrokken worden.

7. PDL-kraal Adhesion to Neurons

  1. Voeg 40-60 μL PDL-beklede kralen toe die bereid zijn in stap 5 tot een celkweek die in stap 4 is bereid. Breng de pipettip over de neuronen, die flauw zichtbaar zijn op de deklaag, en voeg de kralen toe (zie figuur 3 ).
  2. Keer het monster gedurende 1 uur terug naar de incubator om de vorming van sy te bevorderenNaptische contacten 8 , 9 .
  3. Na de incubatie, verwijder eventuele niet-gehechte kralen door de cultuur voorzichtig te wassen met vooraf verwarmde NBM.

8. Voorbereiding van de fysiologische zoutoplossing (voor ruimtemperatuur experimenten)

  1. Bereid fysiologische zoutoplossing op door de ingrediënten die in de verwijzingen 7 , 8 zijn samengevoegd te combineren. Dit is om de celomgeving buiten de incubator te regelen.
  2. Verifieer osmolariteit en pH niveaus zoals aangegeven in referenties 7 , 8 .
  3. Continu oplossen met O 2 om de pH-schommelingen te minimaliseren, terwijl u experimenten uitvoert.
  4. Verhit tot kamertemperatuur.
  5. Stel het perfusiesysteem in door één uiteinde van een plastic buis (optionele afmetingen) in O2-geïnfundeerde fysiologische oplossing te plaatsen en de andere e te bevestigen.En een naald in de monsterhouder geplaatst. Plaats de buis en de oplossing hoger dan het monster (zie afbeelding 4 ).
    1. Koppel de buis van de naald los en sluit deze aan op een spuit. Gebruik de spuit om druk uit te oefenen en vloeibaar te maken, de buis te vullen. Zegel met een rolklem en sluit de naald weer aan.

9. Bead Micromanipulation

  1. Installeer het monster in een experimentele opstelling, zodat bovenstaande cellen via twee micropipetten in micromanipulatoren kunnen worden geopend en optisch onderaan worden geopend, bijvoorbeeld met de 40x-fase-doelstelling (numerieke diafragma van 0,6) van een omgekeerde optische microscoop. Monteer in deze configuratie een CCD-camera voor beeldopname op de zijpoort van de microscoop. Verbind elke pipet met 1 ml spuiten via plastic buis. In deze stap vervangt NBM met fysiologische zoutoplossing (1-2 ml) (zie figuur 4 ).
  2. Tijdens experiMiddelen, continue perfusiecellen met de fysiologische zoutoplossing bereid in stap 8 met een snelheid van 0,5-1 ml / min.
  3. Selecteer een PDL-kraal die niet in een oogpunt van een neuron is verbonden. Zet de kraal uit met een micropipetpunt door op de kraal te richten tot op de micropipette. Breng de tip zo dicht mogelijk bij de kraal door het door de microscoop te controleren.
  4. Breng negatieve druk aan met de 1 ml spuit die op de pipet is aangesloten om de kraal op te halen. Onderhoud negatieve druk gedurende het experiment.

10. Neurieten trekken

  1. Selecteer een PDL-kraal bevestigd aan een neuron in het gezichtsveld en bevestig het aan de tweede micropipette met behulp van zuigkracht zoals beschreven in stappen 9.3-9.4.
  2. Trek het PDL-kraal-neuroncomplex langzaam (~ 0,5 μm / min) door ofwel de micromanipulator of de monsterstadium met 1 μm te verplaatsen en pauze gedurende 5 minuten om neurietinitiatie mogelijk te maken.
  3. Herhaal stap 10.2 tweemaal.
    Opmerking: de eerste 3 &# 181; m moet erg langzaam getrokken worden om experimenteel succes te waarborgen, dat meer dan 95% van de tijd voordoet.
  4. Trek het PDL-kraal-neuroncomplex langzaam (~ 0,5 μm / min) door ofwel de micromanipulator of de monstertrap met 2 μm te verplaatsen en pauze gedurende 5 minuten om de verlenging van de neuriet toe te staan.
  5. Na een succesvolle initiatie en neurietuitbreiding voor de eerste 5 μm trekt u de neuriet bij 20 μm / min over de afstanden van millimeters.
    Opmerking: Het trekken kan continu of in stappen en tegen verschillende tarieven worden uitgevoerd. Zie figuur 5b -5c .

11. Neuronen aansluiten

  1. Selecteer een regio dat rijk is aan neurieten en verlaag het PDL-kraal-neuriet complex zodat het fysiek contact maakt. Gebruik andere kralen om de tiphoogte boven de deklaag te meten. Zie figuur 5d .
  2. Laat het PDL-kraal-neurietcomplex in contact komen met de doel-neuriet terwijl u de tweede micropi manipuleertPette. Verlaag de tweede pipet met de tweede PDL-kraal bovenop de nieuw gevormde neuriet ongeveer 20 μm van de eerste kraal. Gebruik de tweede PDL-kraal om het nieuwe neurietfilament naar de doelcel te duwen.
  3. Houd beide kralen op zijn plaats gedurende minstens 1 uur. Controleer de afwezigheid van focale zwelling, een verdikking van de neurieten die de kraal contacteren, met de microscoop 16 .
  4. Gebruik gedurende deze periode perfusie om het medium van het monster langzaam te veranderen van fysiologische zoutoplossing naar voorverwarmd, CO 2 -qualibrated NBM.
  5. Laat de kraal los van de tweede pipet door zuigkracht los te maken. Als de nieuwe neuriet vast blijft, laat u ook de eerste kraal los. Zie figuur 5e .
  6. Verwijder zoutoplossing voorzichtig en vervang met NBM (~ 2 ml).
  7. Plaats het monster voorzichtig terug in de incubator om de neuronale verbinding voor toekomstige experimenten te versterken. Deze verbinding is stabiel voor> 24 uur 7 .

12. Verificatie van de functionaliteit van de nieuwe verbinding via de opnamepakketten met volledige celpaarden

  1. Volg de referenties 7 , 18 , 19 . Een elektrofysiologie opbouwen.
  2. Volg de referenties 7 . Voorbereiding van de pre- en postsynaptische elektroden.
  3. Verzamel patchclamp data, opnieuw volgend op referenties 18 , 19 .
  4. Vergelijk de resultaten met natuurlijk voorkomende signalen 7 om het verbindings type te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hippocampale neuronen van embryonale ratten worden gekweekt in microfluïdische inrichtingen om precieze positionering van cellen, PDL-kralen en micromanipulatoren mogelijk te maken. De eerste stap is om het microfluïdische apparaat op een glazen deksel of op de schaal te monteren. Het is van essentieel belang dat het microfluïdische apparaat goed vastzit aan het substraat om te voorkomen dat cellen de kamers verlaat en onder de delen van het apparaat gaan dat verzegeld moet worden (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van standaard micromanipulatie en innovatieve microfluïdische apparaten werd een nieuwe techniek ontwikkeld om snel nieuwe initiatieven te verlengen, verlengen en precies aansluiten op nieuwe, functionele neuronale circuits over grote afstanden. Pipette micromanipulation is een algemeen instrument in de meeste neurowetenschappen labs 4 , 13 . De echte uitdaging om reproduceerbare en betrouwbare resultaten te behalen, was de standaardisatie van gezonde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur Margaret H Magdesian is de CEO van Ananda Devices die instrumenten produceert die in dit artikel worden gebruikt.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Yoichi Miyahara bedanken voor veel nuttige discussies en inzichten. MA en PG erkennen financiering van NSERC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Co-culture devicesAnanda DevicesCommercieel verkrijgbaar bij http://www.anandadevices.com
Neuro devicesAnanda DevicesCommercieel verkrijgbaar bij http://www.anandadevices.com
No. 1 Glass Coverslip 25 mm RoundWarner Instruments64-0705
35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-IrradiatedMatTex IncorporationP35G-0-20-C
35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, SterileCorning Inc430165
95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile PolystyreneFisherbrandFB0875714G
50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat capsVWR89039-656
15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, SterileFalcon352097
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049Extracellulaire oplossing
B-27 Supplement (50X), serum freeB-27 Supplement (50X), serum free17504044Extracellulaire oplossing
Pennicilin, Streptomyocin, GlutamineThermo Fisher Scientific 11995-065Extracellulaire oplossing
200 μ L PipettorsVWR89079-458
2 - 20 μL PipettorsAerosol Resistant Tips2149P
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile]BD Falcon357524
GlucoseGibco15023-021Extracellulaire oplossing
HEPESSigma7365-45-9Extracellulaire oplossing/Beads
NaClSigma-Aldrich7647-14-5Extracellulaire oplossing
KClSigma-Aldrich7447-40-7Extracellulaire oplossing
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Extracellulaire oplossing
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3Extracellulaire oplossing
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cmWorld Precision Instruments500233
Dissection toolsBraun, Aesculap
Poly-D-lysine HydrobromideSigma-AldrichP6407
Micro particles based on polystyrene, 10 μmSigma-Aldrich72986
Borosilicate tubesKing Precision Glass, Inc.14696-2
Horizontal Pipette PullerSutter InstrumentsBrown-Flaming P-97
Micromanipulators, PCS-5000 SeriesSD InstrumentsMC7600R
1 mL SyringeBD Luer-Lok309628
Inverted MicroscopeOlympus IX71
ObjectiveOlympusUIS2, LUCPLFLN 40X
CCD CameraPhotometricsCascade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15 MediumLife Technologies11415-064Rat Dissection
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol redLife Technologies25300054Rat Dissection
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate]Life Technologies11995-065Rat Dissection
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate]Life Technologies14170-112Rat Dissection

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microflu dische apparatenPDL gecoate kraaltjespipet micromanipulatieneuronen uit de hippocampus van rattenneuronale groeisnelheidfunctionele neuronale circuitswhole cell patchclampexperimentele reproduceerbaarheid

Gerelateerde artikelen