Methodenartikel

Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator

DOI:

10.3791/55698

⸱

11 augustus 2017

 , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension, Mayo Clinic College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulaire ion vervoer kan vaak worden geëvalueerd door het toezicht van de intracellulaire pH (pHik). Genetisch een Encoded pH-indicatoren (GEpHIs) optische kwantificering van intracellulaire pH in onbeschadigde cellen. Dit protocol gegevens de kwantificering van de intracellulaire pH via cellulaire ex vivo wonen-imaging van Malpighian tubuli van Drosophila melanogaster met pHerry, een pseudo-ratiometric genetisch gecodeerd pH-indicator.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitheliale ion vervoer is essentieel voor systemische ion homeostase evenals onderhoud van essentiële cellulaire elektrochemische verlopen. Intracellulaire pH (pHik) wordt beïnvloed door vele ion vervoerders en dus controle pHik is een nuttig instrument voor de beoordeling van de activiteit van de vervoerder. Moderne genetisch gecodeerd pH-indicatoren (GEpHIs) een optische kwantificering pHik in onbeschadigde cellen op een cellulaire en subcellular schaal. Dit protocol beschrijft real-time kwantificering van cellulaire pHik regulering in Malpighian tubuli (MTs) van Drosophila melanogaster via ex vivo wonen-imaging van pHerry, een pseudo-ratiometric-GEpHI met een pKeen geschikt voor pH wijzigingen bijhouden in het cytosol. Uitgepakte volwassen vliegen MTs zijn samengesteld uit morfologisch en functioneel verschillende secties van eencellige laag epitheel, en kunnen dienen als een model voor toegankelijk en genetisch hanteerbare voor onderzoek van epitheliale vervoer. GEpHIs bieden verschillende voordelen ten opzichte conventionele pH-gevoelige fluorescente kleurstoffen en ion-Ionselectieve electroden. GEpHIs kan verschillende cel populaties label mits passende promotor elementen beschikbaar zijn. Deze etikettering is vooral handig in ex vivo, in vivoen in situ preparaten, die intrinsiek heterogeen. GEpHIs ook de kwantificering van pHi in intact weefsels na verloop van tijd zonder de behoefte aan herhaalde kleurstof behandeling of weefsel externalization toestaan. Het primaire nadeel van de huidige GEpHIs is de neiging om aggregaat in cytosolische inclusies in reactie op weefselbeschadiging en overmatige expressie op te bouwen. Deze tekortkomingen, hun oplossingen, en de inherente voordelen van GEpHIs zijn in dit protocol door evaluatie van de basolaterale proton (H+) vervoer in functioneel verschillende hoofd- en Notti cellen van uitgepakte vlieg MTs gedemonstreerd. De technieken en analyse beschreven zijn gemakkelijk aanpasbaar aan een breed scala aan gewervelde en ongewervelde preparaten, en de verfijning van de bepaling van het onderwijs labs voor ingewikkelde bepaling van ion flux via specifieke vervoerders kan worden geschaald.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is kwantificering van intracellulaire pH (pHi) met behulp van een genetisch-gecodeerde pH-Indicator (GEpHI) beschrijven en demonstreren hoe deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen basolaterale H+ vervoer in een model insect (overleden melanogaster) renale structuur, de Malpighian zaadvormende (MT). MTs dienen als de uitscheidingsmechanisme organen van de fruitvlieg en functioneel vergelijkbaar zijn met de zoogdieren nefronen in enkele belangrijke opzichten1. MTs zijn gerangschikt als 2 paar tubuli (anterior en posterior) in de borstkas en de buik van de vlieg. De eencellige epitheliale buis voor elke MT is samengesteld uit metabolisch actief belangrijkste cellen met verschillende apicale (luminal) en basolaterale (hemocoel) polariteit evenals tussenliggende Notti cellen. Anterior MTs zijn samengesteld uit 3 morfologisch, functioneel, en ontwikkelingsachterstand afzonderlijke segmenten, met name de aanvankelijke uitgezet segment, overgangs segment en secretoire belangrijkste segment, die naar de urineleider2. Op de cellulaire schaal trans-epitheliale ion vervoer in het lumen wordt bereikt door een apicaal plasmamembraan V-ATPase-3 , evenals een alkali-metalen/H+ -wisselaar en een basolaterale nb+-K+-ATPase4, actieve veredeling-gelijkrichter K+ kanalen5, nb+-gedreven Cl−/HCO3− exchanger (NDAE1)6en nb+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, terwijl Notti cellen Cl- bemiddelen en water transport8,9. Dit complexe maar toegankelijk fysiologische systeem biedt uitstekende mogelijkheden voor onderzoek van endogene ion vervoer mechanismen in combinatie met de diverse genetische en gedragsmatige toolsets van Drosophila.

De reden voor dit protocol was in het beschrijven van een genetisch smeedbaar systeem voor het bestuderen van epitheliale ion vervoer met potentieel voor de integratie van cel tot gedrag en uitvoer van hulpprogramma's voor andere modelsystemen. Uitdrukking van pHerry10, een GEpHI die zijn afgeleid uit een fusie van groene pH-gevoelige super ecliptica pHluorin11,12 (SEpH) en rode pH-ongevoelig mCherry13, in MTs toelaat kwantificering in vervoermiddelen H+ afzonderlijke MT cellen tot en met de hoge K+/nigericin kalibratie techniek14. Zoals vele ion transporters H+ -equivalenten verplaatsen, dient kwantificering van intracellulaire pHik als een functionele weergave van ion verkeer via diverse transporteurs. Het systeem van Drosophila MT model biedt ook krachtige genetische hulpmiddelen in weefsel-specifieke transgenic15 en RNA interferentie (RNAi)16 expressie, die kan worden gecombineerd met cellulaire beeldvorming en geheel-orgel testen17 , 18 , 19 van zaadvormende functie voor het maken van een robuuste toolset met verticale integratie van moleculen tot gedrag. Dit staat in contrast met veel andere protocollen voor de beoordeling van epitheliale biologie, zoals historisch dergelijke metingen hebben vertrouwd op ingewikkeld en ontmoedigend micro-dissectie, verfijnde ion-Ionselectieve electroden20,21, en dure pH-gevoelige kleurstoffen22 met beperkende laden eisen en arme cellulaire specificiteit in heterogene weefsels. GEpHIs werden gebruikt voor het meten van pHik in een verscheidenheid van cel typen23uitgebreid. Vroege werk benut de inherente pH-gevoeligheid van groen Fluorescent proteïne (GFP) volgen pHik in gekweekte epitheliale cellen24 maar de afgelopen twee decennia heb gezien GEpHIs gebruikt in neuronen25, glia26, schimmels27 , en28van de cellen van de plant. De combinatie van het potentieel voor cellulaire targeting van genetische constructies door middel van de GAL4/UAS expressie systeem15 en de fysiologische toegankelijkheid van de Drosophila MT maken dit een ideale voorbereiding voor onderzoek van de pHik verordening en epitheliale ion vervoer.

pHik verordening decennialang is onderzocht en is essentieel voor leven. De MT-voorbereiding biedt een robuust model om te leren van de Fysiologie van pHik verordening maar ook uitvoeren geavanceerde onderzoeken bij pHi verordening ex vivo en in vivo. Dit protocol beschrijft kwantificering van H+ verkeer over het basolaterale membraan van de epitheliale cellen van de Drosophila MT met behulp van de NH-4Cl pulse zuur laden techniek21, maar als pH-indicator is genetisch gecodeerd, kunnen deze methoden en hun theoretisch kader worden toegepast op elk preparaat vatbaar voor Transgenese en live-imaging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle stappen in dit protocol voldoen aan de richtsnoeren voor het gebruik van de dieren van de Mayo Clinic (Rochester, MN).

1. vliegen veehouderij

  1. Raise vliegt en set kruist volgens standaard veehouderij29.
    Opmerking: TL verslaggever expressie door het systeem GAL4/UAS is evenredig met de temperatuur en dus fokken temperatuur kan worden aangepast om te veranderen van expressie niveau. Terwijl hoge expressie niveaus vaak tot een betere signaal-/ ruisverhouding leiden wordt deze voorwaarde ook geassocieerd met verhoogde cytosolische en organellar aggregaten wanneer met behulp van GFP naar rood fluorescerende eiwit (RFP) fusion zoals pHerry10construeert, 30,31. Als samenvoeging onvermijdelijk is, kwantificering is het nog steeds mogelijk door het uitvoeren van punt kalibraties in elk experiment en normaliseren gegevens zodanig dat een verhouding van de fluorescentie van 1.0 komt met pHik 7.0 overeen (zie stap 7.4 nota over kalibratie hieronder).
  2. Set doorkruist homozygoot capaR-GAL432 mannen naar homozygoot UAS-pHerry10 maagdelijke vrouwtjes en homozygoot c724-GAL42 mannetjes met homozygoot UAS-pHerry Maagd vrouwen toe te staan van imaging van pHik in de belangrijkste cellen en Notti cellen van het MT, respectievelijk. Plaats 6 UAS-pHerry vrouwtjes met 3 mannen van de GAL4 in frisse flesjes van voedsel en verlof om te paren bij 28 ° C.
    Opmerking: Larven moeten blijken binnen 4 d en volwassenen zullen beginnen te eclose rond dag 10.
  3. Verzamelen van vrouwelijke vliegen op eclosion en gereserveerd voor de leeftijd voor 10 d bij 28 ° C.
    Opmerking: De timing van de experimenten kan worden aangepast overeen met eventuele beperkende gedrags assays (zoals de Ramsay secretie assay17,19) dat zal worden gecorreleerd aan intracellulair levende pH imaging. Mannelijke vliegen kunnen worden gebruikt maar tubuli van de vrouwtjes zijn vaak groter en robuuster.

2. voorbereiding van Poly-L-Lysine dia's.

  1. Een 40 x 20 mm randen tekenen met de pen van een hydrofobe PAP rond de top van standaard 75 x 25 mm dia's en zet opzij te drogen voor 15 min op RT. gebruik grote coverslips als de dia's niet compatibel zijn met imaging optica.
  2. Pipetteer 2 mL van 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) stockoplossing op elke dia en gereserveerd voor 1 h op RT.
  3. Verwijder overtollige PLL met een pipet. De oplossing in een flacon 50 mL conische voor toekomstig gebruik opslaan. Bewaren bij 4 ° C.
  4. Enige overige oplossing met een vacuüm lijn gecombineerd. De vacuüm lijn over het oppervlak van de hele dia om ervoor te zorgen dat geen oplossing op de dia's blijft worden uitgevoerd.
  5. De dia's gereserveerd voor 1 extra h vastgesteldop RT vóór gebruik. De dia's die op RT droog opslaan voor maximaal 1 maand in een standaard dia-boek.

3. voorbereiding van de ontrafeling van de schotel en glazen buizen

  1. 0,5 mL van elastomeer uithardende agent aan 4.5 mL van elastomeer basis in een 35 x 10 mm polystyreen petrischaal op RT tot een diepte van 5 mm. Mix met een wegwerp pipet tip toevoegen. Toestaan van elastomeer te genezen O/N op RT.
    Opmerking: Elastomeer moet duidelijk en vrij van bubbels. Verrekening van bubbels kan worden vergemakkelijkt door het houden van elastomeer platen in een vacuüm pot voor 10-15 min na het gieten.
  2. Houd een roerstaaf van 5 mm diameter tussen handen en smelt het midden van de staaf over een verlichte Bunsenbrander terwijl de uiteinden uit elkaar trekken. Als het glas trekken smelt meer snel tot een dunne (0,1 mm) en taps toelopende schacht (Figuur 1).
    Opmerking: Een hoek van 45 ° op de schacht is vaak nuttig bij de behandeling van de tubuli. Dit kan worden bereikt door het verlagen van enerzijds, zoals de schacht wordt getrokken (Zie Figuur 1).
  3. Breken de dunne as in het midden met de botte kant van een single-edged koolstofstaal scheermesje. Inspecteer het dunne uiteinde van de staaf onder een ontleden om ervoor te zorgen dat de pauze is schoon.

figure-protocol-1
Figuur 1: Fabriceren glazen buizen voor de verwerking van de tubuli van de Malpighian.
A - E. Proces van verwarmings- en trekken een roerstaaf hoek te produceren een taper geschikt voor de behandeling van MTs. pijlen duiden de richting en de omvang van geweld moeten worden toegepast. F. foto van een hulpmiddel op de juiste manier verzonnen glas. Schaal bar = 10 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

4. bereiding van de oplossingen en perfusie systeem

Opmerking: Perfusie systemen verschillen door fabrikant. Dit protocol is gebaseerd rond een zwaartekracht-gevoed 8-kanaals open reservoir met een input stroom tarief regulator en een uitstroom vacuüm-gedreven, maar de wijze van montage die MTS zoals hier beschreven kunnen worden aangepast om te werken met elk perfusie-systeem.

  1. Voorbereiding van de volgende oplossingen:
    1. Aliquot Schneiders medium (40 mL in 50 mL conische flesjes) en bewaren bij 4 ° C.
    2. Bereiden van oplossingen (d.w.z. insect zoute Phosphate-Buffered (iPBS) en iPBS met NH4Cl) op RT desgewenst volgens tabel 1). Warme oplossingen aan RT vóór gebruik op dag van experiment.
      Opmerking: iPBS en iPBS met 40 mM NH4Cl kunnen worden bereid in grote hoeveelheden (1 L of meer) en opgeslagen bij 4 ° C.
    3. Bereiden van 8 ijkoplossingen in 500 mL volumes bij pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 en 9.0 als aangegeven in tabel 1 en winkel bij 4 ° C. Breng de pH van elke oplossing getitreerd wordt met N-methyl-D-glucamine (NMDG) en HCl.
    4. Op de dag van experimenten, 5 mL aliquots van ijkoplossingen aan RT warm en voorraad nigericin oplossing (20 mM dimethylsulfoxide (DMSO)) toevoegen om een eindconcentratie van 10 µM.
      Let op: De nigericin van de greep met handschoenen. Het behandelen van alle apparatuur die in contact met nigericin als wegwerp komt. Nigericin blijft op glas en plastic en biologische preparaten zal compromitteren als apparatuur wordt hergebruikt.
  2. Perfusie-systeem:
    1. Prime de perfusie-systeem door het invullen van alle reservoirs met ddH2O (Figuur 2). Open de kanalen een op een moment dat alle lijnen proximale aan de regulerende instantie van stroom, tarief te vullen.
      Opmerking: Het kan noodzakelijk zijn om lucht in de lijnen door te openen het vastgelopen kanaal en met behulp van een zuiger naar station stroom uit het reservoir zijn.
    2. Open 2 kanalen en toestaan van ddH2O om het uitlekken. Zodra de stuwmeren bijna leeg zijn, vul de eerste reservoir met iPBS en het tweede reservoir met NH4Cl-gepulseerde iPBS. Debiet ingesteld op maximale met de stroom tarief regulator en toestaan van elke oplossing te stromen voor 1 min te vullen van de distale lijnen, dan stoppen met de stroom (Figuur 2).
    3. Positie 2 sets van solderen klemmen "helping hands" het imaging Microscoop werkgebied. Plaats een klem aan weerskanten van de imaging platform.
    4. Zorgvuldig verwarmen de distale 0,5 inch van een stuk van capillaire glas (binnendiameter 1,5 mm, buitendiameter 0,86 mm, lengte 100 mm) over een bunsenbrander. Een 45 °-bocht maken waardoor het distale einde om te buigen door de zwaartekracht en het verwijderen van het glas van de vlam, zodra de gewenste hoek is bereikt. Herhaal dit proces met een tweede bagagestuk van capillaire glas.
    5. De gebogen glazen capillairen invoegen in de lijn van in-flow en vacuüm-verbonden uitstroom lijn, respectievelijk en monteer ze in de "helpende handen" ze worden uitgelijnd met de beeldvorming stadium van de Microscoop (Figuur 3).

figure-protocol-2
Figuur 2: Perfusie systeem en Imaging configuratie.
Componenten die nodig zijn voor de fysiologische beoordeling van MT basolaterale vervoer functie door middel van gelijktijdige leven fluorescentie beeldvorming en snelle uitwisseling van de oplossing. Gas lijnen getoond zijn optioneel en mogelijk uitbreiding van experimenten voor de beoordeling van het HCO3- vervoer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-protocol-3
Figuur 3: Flow schema van perfusie toestellen voor NH4Cl Pulse experimenten.
Pijlen verbeelden stroom pad en ventiel schakelpunten. Oplossing beweegt uit reservoir model door zwaartekracht stroom en is ontleend aan het specimen kamer aan de afval maatkolf door vacuüm afzuigen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

5. dissectie van volwassen Drosophila Anterior Malpighian tubuli.

  1. Verzamelen van de dissectie-schotel en trok glasstaafje van sectie 3, een PLL beklede dia uit sectie 2, een zelfklevende perfusie-well scheidingslijn, vacuüm vet, een strook 4 x 2" van de sluiting van de film, #5 2 paar fijne pincet, en 40 mL aliquots van ijskoude Schneider's medium en RT iPBS.
  2. Verspreiden van vacuüm vet op de afdichtende tape en druk op de zelfklevende perfusie-well scheidingslijn op de tape onder jas met vet. De zelfklevende perfusie-well scheidingslijn afschilferen en plaats deze vet-side-down op de top van een PLL gecoate dia. Verwijder de perfusie-well scheidingslijn te laten individuele specimen wells getraceerd in hydrofobe vet.
  3. Plaats 200 µL van RT iPBS in de vet-omringd goed op de PLL gecoate dia en verplaats de dia onder de stereoscoop.
  4. Plaats UAS-pHerry/capaR-GAL4 vliegen in een lege fly ampul en anesthetize ze op het ijs gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Deze methode van anesthesie, in tegenstelling tot CO2, zorgt ervoor dat de vliegen niet doen uitdrogen.
  5. Giet ijskoude Schneiders medium in de ontleden schotel en fijne pincet gebruiken voor het overbrengen van een enkele narcose vrouwelijke vlieg in de schotel onder een ontleden stereoscoop.
  6. Houd de vlieg door de thorax met een pincet en gebruik de andere om zachtjes greep de posterior van de buik. Trek de achterste van het vliegen met behulp van de verlostang Kortom, bewuste bewegingen open. Zodra de methaanproductie zichtbaar is, greep het distale einde en vrij van de darm en MTs van de onderliggende tracheoles door te trekken de methaanproductie uit de buurt van het lichaam door repetitieve, korte sleepboten.
    Opmerking: De anterieure en posterieure MTs worden zichtbaar wanneer zij voldoen aan de kruising van de middendarm en methaanproductie via de urineleider. Het eerste paar van MTs als vrije zal waarschijnlijk worden de achterste tubuli zoals ze de methaanproductie omcirkelen. Dit kunnen worden genegeerd (figuur 4A).
  7. Snuifje uit de voorste MTs op de ureter met een fijne Tang zodra de tweede reeks van MTs is gratis van de buik. Dit zal de anterior MTs scheiden van de darm en sluit de urineleider.
  8. De gratis anterior MTs met de getrokken roerstaaf halen door te schuiven van de staaf onder de urineleider, zodanig dat de tubuli aan beide zijden vallen. Til de MTs recht omhoog uit de oplossing.
  9. Draai het glazen staafje zodanig dat de MTs urineleider de hand wordt gehouden aan de onderkant van de staaf en de urineleider recht naar beneden in de dia verschijnt verlagen. Brengt de urineleider en verzegel de distale uiteinden van de MTs door te drukken op de urineleider down op het glasplaatje (figuur 4B). Niet manipuleren de MTs meer dan nodig. De MTs moeten met de urineleider verankerd aan de dia omhoog zweven in de oplossing.
  10. Gebruik het mooie einde van het glazen staafje voorzichtig vegen elke zaadvormende over het oppervlak van de dia. Brace de staaf tegen de dia om te voorkomen breken de zaadvormende en schuif de staaf over de bovenkant van de zaadvormende, verhuizen DISTAAL naar proximaal, de volledige lengte van elke zaadvormende hechten aan het oppervlak van de PLL beklede dia (figuur 4C).
  11. Plaats de zelfklevende perfusie-well scheidingslijn weer op de dia om te vormen van een kleine vloeistof gevulde ruim de gemonteerde zaadvormende.
  12. Plaats het model in het werkgebied van de Microscoop. Plaats de instroom en uitstroom van haarvaten over de inlaat en uitlaat opening van de perfusie goed, respectievelijk.
    Opmerking: De goed scheidingslijn kan worden gebleven als een open perfusie-kamer is gewenst. In dit geval kunnen de instroom en uitstroom haarvaten aan weerszijden van een imaging goed worden uitgelijnd.

6. bevestiging van Imaging Protocol en zaadvormende gezondheid

Opmerking: Dit protocol wordt uitgevoerd op een omgekeerde breed-gebied epifluorescerende Microscoop met GFP (SEpH) en RFP (mCherry) filter sets (470/40 nm excitatie (ex-) 515 nm longpass emissie (em), 500 nm dichroïde en 546/10 nm ex, 590 nm longpass em, 565 nm dichroïde), een 10 X / 0,45 lucht objective, een monochromatische camera voor live-Fotolader en beeldbewerkingssoftware. Het protocol kan worden aangepast voor elke rechtop of ondersteboven Microscoop met geautomatiseerde filter schakelen tussen GFP en RFP optica en afbeelding acquisitie software, hoewel de optimale belichtingstijden, lichtintensiteit en weggooien van parameters zal variëren. In alle analyse, moet de intensiteit van de fluorescentie worden geanalyseerd als gemiddelde pixel intensiteit in de regio van belang (ROI), nadat de achtergrond aftrekken in elk kanaal met behulp van een ROI met bevat geen fluorescentie grenzend aan het signaal ROI.

  1. Inschakelen van de Microscoop, lichtbron en imaging systeem.
  2. Open bijbehorende imaging software.
  3. Kijk door de ooglens en focus handmatig aan te passen totdat het lumen van de MT duidelijk zichtbaar onder doorvallend licht is.
  4. Klik op het tabblad van de "Overname" in de software van de analyse van de afbeelding en selecteer "2 x 2" in het "Weggooien" pull-down menu in de sectie 'Overname modus'.
  5. Een neutrale-opaciteitsfilter van 5% in het licht pad naar verlichting lichte verminderen en minimaliseren photobleaching invoegen.
  6. Klik op het GFP (SEpH) kanaal in het menu "Kanalen", en "Live" om te zien hoe het fluorescent signaal via de camera.
  7. Pas de schuifregelaar voor "Tijd" om in te stellen van de blootstellingstijd zodanig dat de helderste pixelwaarden in het histogram intensiteit ongeveer 40% van de maximale waarde zijn en klik op 'Stop' om te stoppen met de verlichting.
  8. Herhaal stappen 6.6-6,7 in de RFP (mCherry) kanaal en de aanwezigheid van de verwijde eerste segment van de voorste MT bevestigen en het ontbreken van cytosolische mCherry aggregaten (indicatief van weefselschade of overexpressie) (Figuur 4 d).
    Opmerking: De verwijde segment moet duidelijk als het is het meest proximale segment van de zaadvormende en de diameter van de innerlijke lumen van dit segment ~ 20 µm groter dan die van de aangrenzende overgangsperiode segment is. 2 x 2 pixel weggooien is vaak voldoende maar kan worden verhoogd om het verder verminderen van de intensiteit van de vereiste verlichtingssterkte. Typische blootstelling tijden zijn tussen 150 & 800 ms/kanaal. Gebruik zo weinig licht mogelijk te minimaliseren photobleaching. Minimaliseren van photobleaching is essentieel voor het gebruik van dual-fluorophore indicatoren zoals pHerry zoals de twee fluorophores kan zelfstandig, bleken dus ongeldig te laten verklaren elke verhouding kalibratie.
  9. Een time-lapse imaging protocol inschakelen door te klikken op het selectievakje "Tijdreeks".
  10. De "duur" in het pull-down menu in de "Tijdreeks" sectie 10 min en de 'Interval' schuif op 0 als u wilt instellen met een maximale beeldsnelheid van de overname de totale opnametijd aanpassen. Een percentage van de totale overname van 0.2 Hz is vaak voldoende.
  11. Controleer zowel de GFP (SEpH) en RFP (mCherry) vakken in de sectie "Kanalen".
  12. Open de iPBS lijn van de perfusie-systeem door het activeren van de daarvoor bestemde afsluiters controller en start het imaging protocol door te klikken op "Start Experiment." Na 1 minuut, overschakelen naar NH4Cl pulse oplossing voor 20 s door de daarvoor bestemde afsluiters openen en sluiten van de iPBS-lijn, dan terug naar de iPBS door te sluiten van de NH-4Cl lijn en heropening van de iPBS klep. Het volledige imaging protocol om te voltooien voordat u stopt de perfusie-systeem toestaan.
    Opmerking: Time-lapse analyse moet onthullen een stabiele mCherry signaal en een signaal SEpH die toeneemt in aanwezigheid van NH4Cl, Lest op wassen, en geleidelijk herstelt.
  13. Een 2-punts-kalibratie uit te voeren.
    1. De goed scheidslijn door peeling het uit de buurt van de onderliggende dia verwijderen en verwijder de perfusie haarvaten en klemmen van de beeldvorming goed.
    2. 200 µL kalibratie iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericin) van toepassing op de beeldvorming goed met een 200 µL pipet. De oplossing van de beeldvorming goed met de pipet te verwijderen, vervolgens vervangen door een andere 200 µL van kalibratie-oplossing. Herhaal dit proces 4 keer om totaaloplossing uitwisseling te waarborgen.
    3. Incubeer de voorbereiding in de kalibratie-oplossing voor 30 min vóór imaging. Herhaal het imaging protocol gebruikt dezelfde parameters bepaald in stappen 6.6-6.11, met de wijziging van slechts 1 min van beeld vastleggen.
      Opmerking: De perfusie systeem en de haarvaten zijn niet nodig in deze stap en moet niet worden gekoppeld aan de beeldvorming ook om te voorkomen dat bloot de haarvaten naar nigericin.
    4. 200 µL kalibratie iPBS (pH 9.0, 10 µM nigericin) aan de beeldvorming goed met een 200 µL pipet toevoegen. De oplossing van de beeldvorming goed met de pipet te verwijderen, vervolgens vervangen door een andere 200 µL van kalibratie-oplossing. Herhaal dit proces 4 keer om totaaloplossing uitwisseling te waarborgen.
    5. Incubeer de voorbereiding in de tweede kalibratie-oplossing voor 10 minuten vóór imaging. Herhaal het imaging protocol zoals in stap 6.13.3.
    6. Bekijk de stack van de vastgelegde afbeelding in software van de analyse van het beeld om te bevestigen dat er geen pixels in elk kanaal zijn verzadigd door te klikken op "Bedoel ROI" en bladeren al de afbeeldingsstapel met de schuifregelaar om "Frame" met inachtneming van die geen waarden gemeld in het histogram van de intensiteit de maximale waarneembare waarde wordt bereikt. Als alle frames pixels die het bereiken van de maximale detecteerbare intensiteit bevat, verminderen de blootstelling tijd of verlichting intensiteit en herhaal punt 6.
      Opmerking: Zodra vastgesteld imaging parameters tussen experimenten of kalibratie niet wijzigen tenzij punt kalibraties moeten worden gebruikt in elk preparaat (zie stap 8.3).
  14. Analyseer de afbeeldingsstapel u wilt uitzetten van fluorescerende intensiteit en fluorescentie ratio (SEpH/mCherry) als een functie van de tijd.
    1. Klik op "Bedoel ROI" en selecteer het gereedschap Vrije vorm. Klik met de linkermuisknop op te sporen een ~ 50 µm lengte van MT. houden Klik met de rechtermuisknop om te voltooien met het tekenen van de ROI, herhaal dan in een gebied grenzend aan het MT om te definiëren een achtergrond ROI (figuur 5A).
    2. Klik op "Gemiddelde intensiteit" onder "Metingen." Een inhoudsopgave intensiteitswaarden maken door te klikken op "exporteren > tabel > maken."
    3. Klik op het pictogram van de tandrad configuratie en deselecteert u alle parameters staan, behalve "Tijd" en "Mean intensiteit." Met de rechtermuisknop op het tabblad voor de zojuist gemaakte gegevenstabel, selecteer "Save As" en de gegevens exporteren als een CSV-bestand.
      Nota: Soortgelijke metingen kunnen ook worden gemaakt met behulp van vrije software zoals ImageJ.
    4. Open een werkblad tabel en de tabel importeren door te selecteren op het tabblad "Gegevens" gevolgd door "Van de tekst".
    5. Gebruik de functies in het werkblad wilt aftrekken van de achtergrond van de SEpH intensiteit vanaf de SEpH signaal intensiteit op elk tijdstip. Herhaal dit proces voor het mCherry signaal.
    6. Uitzetten van de intensiteit van elk kanaal als een functie van de tijd door te selecteren de kolommen die de tijd en achtergrond-gecorrigeerde intensiteit die gegevens bevat en vervolgens te klikken op "invoegen > Scatter (Charts) > spreidingsdiagram met rechte lijnen" (figuur 5B).
    7. Werkbladfuncties gebruiken voor het berekenen van de verhouding van de fluorescentie SEpH/mCherry op elk tijdstip.
    8. Perceel fluorescentie verhouding als functie van de tijd door te selecteren de kolommen die de tijd en de verhouding die gegevens bevat en vervolgens te klikken op "invoegen > Scatter (Charts) > spreidingsdiagram met rechte lijnen" (figuur 5C).

7. volledige kalibratie van pHerry in Malpighian tubuli Ex Vivo.

  1. Ontleden en monteren van een nieuwe reeks van anterior MTs zoals beschreven in sectie 5.
  2. Uitwisseling iPBS voor kalibratie iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericin) zoals beschreven in stap 6.13.2. Incubeer gedurende 30 min.
  3. Zoek het MTs en verzamelen van paren van SEpH/mCherry beelden zoals beschreven in stappen 6.1-6.11. De oplossing wordt vervangen door een ander bestand van kalibratie iPBS zoals beschreven in stap 6.13.4, wacht 10 minuten en beeld weer. Herhaal dit proces totdat de SEpH/mCherry verhouding heeft zijn beeld in alle oplossingen. Verkrijgen van pH 9.0 beelden duren zoals het specimen zelden van hoge pH herstelt.
  4. Plot fluorescentie verhouding van SEpH aan mCherry van kalibraties in acht exemplaren als een functie van opgelegde pHik zoals beschreven in stap 6.14.9. Grootte van de kalibratiegegevens met een Boltzmann-curve te verkrijgen van de volledige kalibratiefunctie volgens vergelijking 1 (figuur 5D). Als gegevens inconsistent zijn, kalibratie sets van elk specimen genormaliseerd zodat een fluorescentie-ratio van 1.0 komt met de pHi 7.0 overeen uitzetten en opnieuw analyseren (figuur 5E).
    Opmerking: Als het laatste proces noodzakelijk is individuele experimenten moet hun eigen interne punt kalibraties33 (Zie kwantificering onderstaande procedure (stap 8.3)).
  5. Vergelijking 1
    figure-protocol-4
    Waar R = SEpH/mCherry verhouding en een1, een2 xoen dx zijn kromme montage-parameters die minimale fluorescentie verhouding, maximale fluorescentie verhouding, pKeenen breedte van de functie respectievelijk. x-o = schijnbare pKeen van pHerry, die van 7.1 tot 7.4 afhankelijk van het celtype en de kalibratie van de exacte voorwaarden variëren kan.

8. kwantificering van basolaterale zuur extrusie van Ex Vivo Malpighian zaadvormende epitheel.

  1. Afbeelding pHerry-uiten Notti cellen en pHerry-uiten hoofdsom cellen tegelijk.
    1. Ontleden van anterior MTs uit een vlieg UAS-pHerry/capaR-GAL4 , zoals beschreven in sectie 5, maar niet overdragen MTs van het ontleden Schneiders medium aan de imaging goed.
    2. Ontleden anterior MTs uit een vlieg UAS-pHerry/c724-GAL4 in de dezelfde ontleden schotel met behulp van de procedure die wordt beschreven in sectie 5.
    3. Breng de 2 sets van MTs in de zelfde imaging goed zoals beschreven in stappen 5,8-5.11.
      Opmerking: Wanneer het vegen van de takken van de MTs neer aan de dia, plaats de MTs van de UAS-pHerry/c724-GAL4 en de tubuli UAS-pHerry/capaR-GAL4 in de buurt van elkaar zodat pHerry-uiting geven aan hoofd- en Notti cellen kunnen worden gevisualiseerd in de dezelfde veld ( Figuur 6A).
  2. Toepassing van de NH-4Cl prepulse zoals beschreven in stap 6.12.
    Opmerking: Als consistente kalibratie (figuur 4B) kan niet worden bereikt, voert u een punts kalibratie door pHi op 7.0 aan het einde van elk experiment met kalibratie iPBS (pH 7.0, 10 µM nigericin, 30 min incubatie) na de lijm perfusie-well divider en de perfusie-apparatuur zijn verwijderd.
  3. Kalibreren van sporen van Notti en belangrijkste cellen van verschillende MT-segmenten (met behulp van de verhouding tussen de absolute of genormaliseerde voorkomend) met vergelijking 2 en analyseren van de herstelfase na NH4Cl intrekking door toepassing van exponentiële afname functies met behulp van statistische analysesoftware en wijzend op de verval-constante (τ) (figuur 6B).
    Vergelijking 2
    figure-protocol-5
    Waar R = SEpH/mCherry verhouding en een1, een2 xoen dx zijn kromme montage parameters bepaald door kalibratie in stap 7.4 (vergelijking 1).
    1. Berekenen zure extrusie (JH +, Zie vergelijking 3) als een functie van de pHik meetvariaties rusten pHik en zuur laden tussen preparaten34. De exponentiële functies afgeleid in stap 8.3 gebruiken voor het berekenen van de afgeleide van pHik met betrekking tot tijd in elk tijdsinterval.
      Vergelijking 3
      figure-protocol-6
    2. Berekenen van de intrinsieke buffercapaciteit (βi; Vergelijking 4) van het cytosol bij de pHik vanaf het begin van elk interval in stap 8.3.1 gebaseerd op bestaande literatuur (Zie vergelijking 4).
      Opmerking: In Drosophila, komt de meest grondige karakterisering van βik larvale motorische zenuw terminals €35 en deze gegevens kan worden verondersteld te houden voor MT cellen in de afwezigheid van de andere beschikbare gegevens.
      Vergelijking 4
      figure-protocol-7
    3. Berekent het product van βT (uit stap 8.3.2)en departementik/dt (uit stap 8.3.1) om te bepalen JH + (vergelijking 3).
      Opmerking: In nominaal bicarbonaat-vrije oplossingen zoals die welke in dit protocol, bicarbonaat afkomstige buffercapaciteit (β-b) wordt ervan uitgegaan dat ~ 0 mM. Totaal buffercapaciteit (βT) is de som van βik enβben dus βik = βT bij gebrek aan HCO3-/CO236.
    4. Plot JH + als een functie van de pHik aan het begin van elk tijdsinterval zoals beschreven in stap 6.14.9.
    5. Exponentiële afname functies toepassen op het gedeelte van alle datasets die overlappen in pHik met behulp van statistische analysesoftware. Vergelijk tarieven van de verandering van de resulterende functies te vergelijken zure extrusie tarieven tussen cellen en MT segmenten (Figuur 6 c).
      Opmerking: De meest geschikte functie gebruikt voor curve-fitting wellicht niet altijd een exponentiële honkslag. Andere functies kunnen worden vervangen als ze de goedheid van fit verbeteren.
    6. Berekenen van zuur flux (Zie vergelijking 5) als een functie van de pHik meetvariaties Celgrootte en vorm.
      Vergelijking 5
      figure-protocol-8
      Opmerking: Cel dimensies worden rechtstreeks gemeten bij afbeeldingen of kunnen worden benaderd. Belangrijkste cellen kunnen worden weergegeven als de helften van een holle buis met de volgende afmetingen: inwendige diameter 24 µm; buitendiameter 48 µm; hoogte 50 µm. overgangsmaatregelen Notti cellen zijn variabel maar ruwweg kunnen worden weergegeven als cilinders met hoogtes van 50 µm en een diameter van 10 µm. Zie de laatste alinea van Vertegenwoordiger resultaten hieronder.
    7. Exponentiële afname functies toepassen op het gedeelte van alle datasets die overlappen in pHik met behulp van statistische analysesoftware. Vergelijk tarieven van de verandering van de resulterende functies te vergelijken zure stromen tussen cellen en MT segmenten (figuur 6D).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gezonde weefsels en correcte identificatie van anterior MTs zijn essentieel voor het succes van dit protocol. Tijdens de dissectie, moet worden gewaakt om niet direct touch de MTs en enige greep zal hen door de ureter als aangrijpend de MTs rechtstreeks leiden tot breuk (figuur 4Avan- B). Bij MTs zijn geveegd plat op de dia, de tubuli moeten zo weinig mogelijk worden aangeraakt en overtollige beweging vermeden als dit zal sc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van kwantificering van pHik in Drosophila MTs hangt volledig af van de gezondheid van uitgepakte MTs en de kwaliteit van de montage en dissectie (Figuur A - C). De zorgvuldige behandeling van weefsel als is beschreven dus noodzakelijk. Dia's vers gecoat in PLL aanzienlijk steun MT montage als ze de neiging om veel meer lijm dan dia's die eerder zijn blootgesteld aan oplossing. Zorgvuldige montage zal ook helpen bij de identificatie van de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de NIH DK092408 en DK100227 naar MFR. AJR werd gesteund door T32-DK007013. De auteurs bedank Dr. Julian A.T. Dow voor de CapaR-GAL4 en c724-GAL4 Drosophila voorraden. Wij danken ook Jacob B. Anderson voor bijstand behoud van experimentele vliegen kruisen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Poly-L-Lysine (PLL) SolutionSigma-AldrichP4832Opslaan bij 4 °C, kan worden hergebruikt.
Nigericin Sodium SaltSigma-AldrichN7143VOORZICHT: Hanteren met handschoenen. Bewaar als aliquoten van 20 mM stockoplossing in DMSO bij 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, kleefmaat 1 mm, kamerdiameter × dikte 9 mm × 0,9 mm, poortendiameter 1,5 mmSigma-AldrichGBL622105Kan worden vervangen zoals nodig om overeen te komen met perfusiesysteem.
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGVerkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
Helping Hands Soldering StandsHarbor Freight Tools60501Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
Open Gravity-fed Perfusion System met klepregelaar, 8 tot 1 manifold en reservoirsBioscience ToolsPS-8SElk vergelijkbaar perfusiesysteem kan worden gebruikt.
Flow RegulatorWarner Instruments64-0221Kan worden vervangen zoals nodig om overeen te komen met perfusiesysteem.
Schneider's MediumFisher Scientific21720024Opslaan bij 4 °C in steriele aliquoten.
#5 Inox Steel ForcepsFine Science Tools11252-20Kan worden vervangen op basis van comfort van de experimenteerder.
35 x 10 mm polystyreen petrischaalCorning Life SciencesFisher Scientific 08-757-100AExact merk en maat zijn onbelangrijk.
75 x 25 mm microscoopglazenCorning Life Sciences2949-75X25Exact merk en maat kunnen variëren zolang perfusieputjes compatibel zijn.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, dikte 0,32 mmWarner Instruments64-0796Filiment niet noodzakelijk, glas kan worden vervangen om overeen te komen met perfusiebuis en perfusieputjes.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", dikte 1/32"Fisher Scientific14-171-129Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers, kan worden vervangen om overeen te komen met perfusiesysteem.
Vacuum Silicone GreaseSigma-AldrichZ273554Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
Plastic Flow Control ClampFisher Scientific05-869Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers, steriliteit niet vereist
Glazen staven, 5 mm diameterdelphiglass.com9198Exacte grootte is persoonlijke voorkeur, meerdere leveranciers beschikbaar
PAP Hydrophobic PenSigma-AldrichZ377821Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
Sealing FilmSigma-AldrichP7668Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
15 mL Falcon tubeBD Falcon352096Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
50 mL Falcon tubeBD Falcon352070Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acidSigma-AldrichH3375Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrateSigma-Aldrich69892Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acidSigma-AldrichT5130Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
10X/0.45 Air ObjectiveZeiss000000-1063-139Vergelijkbare objectieven kunnen worden vervangen. 40X objectieven kunnen worden gebruikt voor beeldvorming van enkele cellen.
Dissecting StereoscopeZeissDiscovery.V8Elk dissectiesteroscoop kan worden gebruikt.
UAS-pHerry transgenische Drosophila melagnogasterBeschikbaar van Romero LabEerste publicatie: Citatie 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogasterBeschikbaar van Romero LabEerste publicatie: Citatie 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogasterBeschikbaar van Romero LabEerste publicatie: Citatie 2
Monochromatic High Sensitivity Digital CameraZeissAxiocam 506 monoExact merk en model kunnen variëren, kan worden vervangen door elke monochrome hoge gevoeligheidscamera die geschikt is voor live cellulaire beeldvorming.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroicChromaCZ909Elke GFP/FITC filter set kan worden vervangen.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroicChromaCZ915Elke GFP/FITC filter set kan worden vervangen.
Inverted Epifluoescent MicroscopeZeissAxio Observer Z.1Elk vergelijkbaar microscoop met gemotoriseerde filterswitching kan worden gebruikt. Rechtopstaande microscopen kunnen worden gebruikt met open perfusiebaden en water-immersie-objectieven.
Statistische analysesoftwareMicrocalOrigin 6.0Elke software met vergelijkbare functionaliteit kan worden vervangen
BeeldanalysesoftwareNational Institutes of HealthImageJ 1.50iElke software met vergelijkbare functionaliteit kan worden vervangen
BeeldverwervingssoftwareZeissZen 1.1.2.0Elke software met vergelijkbare functionaliteit kan worden vervangen
Eénzijdig koolstofstaal scheermesElectron Microscopy Sciences71960Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
Microscoopslide mapFisher Scientific16-04Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
Bunsen-branderFisher Scientific50-110-1231Verkrijgbaar bij meerdere leveranciers.
Polystrene Drosophila-kweekbuisjes met vleugelsGenesee Scientific32-109BFVergelijkbare items kunnen worden vervangen.
2,5 L laboratorium ijsemmer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151(2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68(2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202(2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897(2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7(2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Malpighische buisjes van Drosophilaepitheliaal ionentransportlive imagingprotonentransportpH kalibratiefluorescente biosensorprincipal cellenstellaire cellen

Gerelateerde artikelen