Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

Samenvatting

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) worden beschouwd als een krachtig instrument voor drugs- en chemische screening en voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro modellen voor toxiciteitsonderzoek, inclusief neurotoxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor de differentiatie van hiPSCs in neuronen en glia beschreven.

Samenvatting

Menselijke pluripotente stamcellen kunnen onderscheiden in verschillende celsoorten die toegepast kunnen worden op in vitro toxiciteitsbepalingen op humane wijze. Een belangrijk voordeel is dat de herprogrammering van somatische cellen om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) te produceren, de ethische en wetgevende problemen in verband met het gebruik van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) vermijdt. HiPSCs kunnen uitgebreid worden en efficiënt gedifferentieerd worden in verschillende soorten neuronale en gliale cellen, die dienen als testsystemen voor toxiciteitstesten en in het bijzonder voor de beoordeling van verschillende pathways betrokken bij neurotoxiciteit. Dit werk beschrijft een protocol voor de differentiatie van hiPSCs in gemengde culturen van neuronale en gliale cellen. De signaalwegen die zijn gereguleerd en / of geactiveerd door neuronale differentiatie worden gedefinieerd. Deze informatie is van cruciaal belang voor de toepassing van het celmodel op het nieuwe toxiciteits testparadigma, waarin chemicaliën worden beoordeeld op basis van hun vermogen om te pezenRturb biologische wegen. Als bewijs van het concept werd rotenon, een remmer van mitochondriale ademhalingskomplex I, gebruikt om de activatie van de Nrf2-signaleringsweg te beoordelen, een sleutelregelaar van het anti-oxidant-respons-element (ARE) -gedreven celverdedigingsmechanisme tegen oxidatieve stress .

Inleiding

Het rapport van de nationale onderzoeksraad van de VS ¹ beschouwde een nieuw toxiciteits testparadigma waarin regulatoire toxiciteitstesten verschoven zouden worden van een aanpak die afhankelijk is van fenotypische veranderingen waargenomen bij dieren, naar een aanpak die zich concentreert op mechanistische in vitro analyses met behulp van menselijke cellen. Pluripotente stamcellen (PSC) derivaten kunnen alternatieven voor kankercelmodellen vertegenwoordigen, aangezien de verkregen cellen meer lijken op de fysiologische omstandigheden van menselijk weefsel en meer relevante hulpmiddelen bieden om chemisch geïnduceerde nadelige effecten te bestuderen. De twee belangrijkste soorten PSC-culturen die het meestbelovend zijn voor toxiciteitstesten zijn menselijke embryonale stamcellen (hESC's) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), die op dit moment veel gebruikt worden op het gebied van basisonderzoek en regeneratieve geneeskunde ^{2 , 3} . Deze expertise kan nu worden gebruikt voor de ontwikkeling van een nieuwe klasse toxicoloIn vitro onderzoeken gericht op het identificeren van de verstoorde fysiologische pathways die betrokken zijn bij de ontwikkeling van bijwerkingen in vivo . Testmethoden voor regelgevende veiligheidsbeoordelingen op basis van hESC's zouden echter onwaarschijnlijk door alle EU-lidstaten en landen wereldwijd worden aanvaard wegens mogelijke ethische problemen en diverse nationale wetgevingsbeleid die het gebruik van embryo-afgeleide cellen regelt.

HiPSCs delen kenmerken vergelijkbaar met hESCs ^{4 , 5} en hebben een groot potentieel voor in vitro methoden, zowel ter identificatie van therapeutische doelen als voor veiligheidsbeoordelingen. Daarnaast vermindert hiPSC-technologie de beperkingen van een beperkt donorpool en de ethische problemen die verband houden met embryo afgeleide cellen. Een belangrijke uitdaging voor hiPSCs is de demonstratie dat deze cellen reproduceerbaar een significant aantal toxicologisch relevante cellederivaten kunnen genereren,Met kenmerken en reacties die typerend zijn voor menselijke weefsels. Vooraf gedefinieerde niveaus van de geselecteerde markers worden meestal gebruikt om celbevolkingen na het differentiatieproces te karakteriseren en inzicht te geven in de stabiliteit van het differentiatieproces.

Eerdere werken hebben de geschiktheid van hiPSCs geëvalueerd om gemengde culturen van neuronale en gliale cellen te genereren en de effecten van rotenon, een remmer van mitochondriale ademhalingskomplex I, te beoordelen bij de activatie van het Nrf2-pad, een belangrijke regelaar voor anti-oxidantverdedigingsmechanismen in Veel celtypes ^{6 , 7} .

Dit werk beschrijft een protocol dat wordt gebruikt voor de differentiatie van hiPSC's in gemengde neuronale en gliale culturen, waarbij details worden gegeven over de signaalwegen (gen- en eiwitniveau) die geactiveerd worden bij neuronale / gliale differentiatie. Bovendien toont het werk representatieve resultaten die aantonen hoe ditHiPSC-afgeleide neuronale en gliale celmodellen kunnen gebruikt worden om Nrf2-signaleringsactivatie geïnduceerd door acute (24-h) behandeling met rotenon te beoordelen, zodat de oxidatieve stressinductie kan worden beoordeeld.

IMR90 fibroblasten werden opnieuw in de hiPSCs bij I-Stem (Frankrijk) geprogrammeerd door de virale transductie van 2 transcriptiefactoren (Oct4 en Sox2) onder gebruikmaking van pMIG vectoren ⁶ . Analoge hiPSC modellen kunnen ook worden toegepast. De hieronder beschreven protocollen samenvatten alle fasen van differentiatie van hiPSCs in neurale stamcellen (NSC's) en verder in gemengde culturen van post-mitotische neuronen en gliale cellen (stap 1 en 2, zie ook de EURL ECVAM DBALM website voor een gedetailleerde beschrijving van Het protocol) ⁸ .

Een extra protocol voor de isolatie, uitbreiding, cryopreservering en verdere differentiatie van NSC's in gemengde neuronen en glialcellen wordt gedetailleerd beschreven in stap 3 en 4 (verwijzen ook naar de EURL ECVAM DBALM weBsite voor een gedetailleerde beschrijving van dit protocol) ⁹ . Stap 5 beschrijft de analyses die kunnen worden gedaan om de fenotypische identiteit van de cellen te beoordelen tijdens de verschillende fasen van inzet en differentiatie.

Protocol

1. Menselijk geïnduceerde Pluripotente Stamcellen (hiPSC) Uitbreiding

OPMERKING: HiPSC's kunnen worden gekweekt op een geschikt eiwitmix substraat in aanwezigheid van mTeSR1 medium dat mTeSR1 5x supplementen bevat (bereid volgens de instructies van de fabrikant; plaat ~ 100 kolonie fragmenten / 60 mm Petri schotel). Wanneer de hiPSC kolonies een geschikte grootte bereiken (zie een voorbeeld van een kolonie in Figuur 2A ), verplaats de cellen zoals hieronder beschreven (een keer per week).

1. Coatschotels met hESC-gekwalificeerde basismembraanmatrix (hierna "gekwalificeerde matrix" genoemd) of een ander geschikt eiwitsubstraat.
   1. Bewaar de gekwalificeerde matrix (zie de tabel van materialen ) bij -80 ° C in 200 μl porties in koude 1,5 ml buizen en koude 5 of 10 ml pipetten.
   2. Voor het doorvoeren, ontdooien 200 μL gekwalificeerde matrix op ijs.
   3. Verdun 200 μL gekwalificeerde matrix in 20 mL DMEM / F12 medium (1: 100 verdunning).
   4. Bedek 60 mm Petri-afwas met deze oplossing (5 ml / schotel).
   5. Incuberen gecoate gerechten bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur.
2. HiPSC kolonie fragment cryopreservering en ontdooien
   1. Na het snijden van de hiPSC-kolonies (zie stap 1.3 voor de hiPSC-kolonie-snijprocedure), zet de hiPSC-koloniefragmenten zacht en langzaam opnieuw in de stamcellenfriesmedium, ~ 100 fragmenten / 250 μL (zie de Tabel van Materialen).
   2. Aliquot de koloniefragmenten in geschikte injectieflacons voor cryopreservering (250 μl / injectieflacon).
   3. Plaats de injectieflacons in een houder gevuld met 2-propanol en plaats de houder bij -80 ° C gedurende minimaal 2 uur en tot 2 weken.
   4. Breng de flesjes over in de dampfase van een vloeibare stikstoftank.
   5. Om de cultuur te herstarten, ontdooit 1 bevroren flesje in waterbad bij 37 ° C.
   6. Verzamel de hiPSC-koloniefragmenten voorzichtig in 7 ml voorverwarmde complete hiPSCMedium (zie de tabel van materialen ) in een 15 ml buis met behulp van een 1, 2 of 5 ml pipet.
   7. Centrifugeer de hiPSC koloniefragmenten bij 130 xg gedurende 3 minuten.
   8. Verwijder de supernatant en zet de hiPSC-koloniefragmenten fors in 1 ml volledig hiPSC-medium met een pipet van 1, 2 of 5 ml.
   9. Verdun de cel suspensie verder in 3 of 4 ml compleet hiPSC medium.
   10. Plak de hiPSC-koloniefragmenten in een gekwalificeerde matrixcoated 60 mm Petri-schotel (~ 100 fragmenten / schotel; bedek de afwas zoals beschreven in stap 1.1).
   11. Incubeer de hiPSCs bij 37 ° C en 5% CO ₂ .
   12. Voer elke dag een totale gemiddelde verandering uit.
3. Passeren van de hiPSC kolonies
   OPMERKING: Ongedifferentieerde hiPSC's moeten rond in vorm zijn, met grote nucleolen en zonder overvloedig cytoplasma. Niet-gedifferentieerde kolonies zouden moeten worden gekenmerkt door een platte en stevig verpakte morfologie. Alleen ongedifferentieerde kolonies (ongeveer 1 mm iN diameter) moeten worden gesneden voor verdere doorgang.
   1. Knip de stamcelkolonies in vierkanten van ongeveer 200 μm x 200 μm met een 1 ml spuit met een 30G-naald of andere in de handel verkrijgbare gereedschappen (zie de tabel). Gebruik een stereoscopische microscoop bij 4x vergroting in een laminaire stroomkast op kamertemperatuur.
   2. Verwijder de koloniefragmenten van het schoteloppervlak met behulp van een pipette van 200 μl door het medium onder het pipette zachtjes te pipetteren om de stukken op te tillen.
   3. Breng de koloniefragmenten (~ 100 stuks) over op een gekwalificeerde matrix-DMEM / F12-beklede plaat, gevuld met 4 ml compleet hiPSC-medium (zie de Tafel van Materialen; bedek de afwas zoals beschreven in stap 1.1).
   4. Incubeer de nieuwe plaat (en) bij 37 ° C en 5% CO ₂ .
   5. Voer elke dag een gemiddelde verandering uit en inspecteer de morfologie van de kolonies met behulp van een fasecontrastmicroscoop bij 4X en 10X magnificaties.

2. HiPSC DivergerNtiation in Mixed Neurons en Glia

OPMERKING: De procedure duurt ongeveer 28 dagen om te voltooien, met de hoofdstappen beschreven in Figuur 1 (bovenste gedeelte).

Figuur 1: Schematische representatie van het Neuronale Differentiatie Protocol. (Bovenste deel) IMR90-hiPSC kolonies kunnen in fragmenten worden gesneden om embryoïde lichaamsdelen (EB's) te vormen. Na 2 dagen in vitro (DIV) kunnen EB's worden geplateerd op laminine- of standaardmatrix-gecoate gerechten en gekweekt in aanwezigheid van neuroepitheliale inductie (NRI) medium om neuroectodermale derivaten te genereren (rozetten, hier gekleurd voor nestin (groen) en β -III-tubuline (rood)). Rozetten kunnen worden gedissocieerd, verzameld, gerepliceerd op laminine- of standaardmatrix-gecoate gerechten, en verder gedifferentieerd tot volwassen neuronale (NF200, rode) en gliale(GFAP, groene) cellen in de aanwezigheid van neuronal differentiatie (ND) medium. (Nerd) rosette-afgeleide NSC's (nestin, rood) kunnen worden uitgebreid in aanwezigheid van neurale inductie (NI) medium, cryopreserveerd, of verder gedifferentieerd in aanwezigheid van ND-medium om gemengde neuronale (NF200, groen) en gliale GFAP, rode) culturen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Generatie van embryoïde lichamen (EBs) (Dagen 0 → 1)
   OPMERKING: Deze procedure vereist goede manuele vaardigheden en precisie. HiPSC-koloniefragmenten moeten van gelijke grootte zijn om homogene embryoïde lichaamsdelen (EB's) in de volgende stappen te verkrijgen. Morfologisch gedifferentieerde kolonies (met grote cytoplasmatische fracties en kleine nucleoli) moeten worden weggegooid.
   1. Vernieuw het hiPSC medium (3 ml / 60 mm Petri schotel) voordat u de ongedifferentieerde hiPSC kolonies snijdt (ongeveer 1 mm in diameterEter, zie figuur 2A ) onder steriele omstandigheden (zoals beschreven in stap 1).
   2. Snijd de ongedifferentieerde kolonies (zoals weergegeven in Figuur 2A en Figuur 2B ) in fragmenten van ongeveer 200 μm x 200 μm met een 1 ml spuit met een 30G naald. Gebruik een stereoscopische microscoop bij 4X vergroting in een laminaire stroomkast op kamertemperatuur.
   3. Verwijder de koloniefragmenten van het schoteloppervlak met behulp van een 200 μL pipet door het zachtjes pipetterende medium onderaan om de stukken op te tillen.
   4. Breng alle vrijstaande fragmenten en het medium over naar een 15 ml-buis met een 1, 2 of 5 ml pipet.
   5. Spoel de schotel af met 2 ml compleet hiPSC medium om alle fragmenten te herstellen.
   6. Centrifuge bij 112 xg gedurende 1 min.
   7. Aspirateer de supernatant en verzacht de fragmenten zachtjes in 5 ml volledig hiPSC EB medium (zie de Tabel van Materialen ).
   8. Plate de coLonyfragmenten in een 60 mm ultra-lage bijlage Petri Schotel (5 ml / 60 mm Petri Schotel).
   9. Incubeer de petrienschotel overnacht bij 37 ° C en 5% CO ₂ .
   10. Op de volgende dag (Dag 1), verzamel de EB's en hun medium in een 15 ml buis met een 1, 2 of 5 ml pipet.
   11. Centrifugeer de EB's bij 112 xg gedurende 1 minuut.
   12. Aspirateer de supernatant zorgvuldig en verzacht de EB's zachtjes in 5 ml volledig hiPSC EB-medium met behulp van een 1, 2 of 5 ml pipet.
   13. Vervang de EB's op een nieuwe 60 mm ultra-lage bijlage Petri schotel (5 ml / 60 mm Petri schotel).
   14. Incubeer de petrienschotel overnacht bij 37 ° C en 5% CO ₂ .
2. Op dag 1 bedek de afwas met keldermembraanmatrix ( bijv. Matrigel, hierna aangeduid als "standaardmatrix") of een ander geschikt eiwitsubstraat ( bijv . Laminine).
   1. Bewaar de standaardmatrix (zie de tabel van materialen ) bij -80 ° C200 μl porties met koude 1,5 ml buizen en koude 5 of 10 ml pipetten.
   2. Doe 200 μL standaardmatrix op ijs.
   3. Verdun 200 μL standaardmatrix in 20 ml DMEM / F12 medium (1: 100 verdunning).
   4. Bedek 60 mm Petri-afwas met deze oplossing (5 ml / schotel).
   5. Incubeer de gecoate gerechten bij 37 ° C overnacht.
      OPMERKING: Deze gerechten worden gebruikt om de EB's (ongeveer 50 EB's / schotels) te platen en neuroepitheliale aggregaten te genereren (rozetten); Zie stap 2.3.
3. Generatie van neuroepitheliale aggregaten (rozetten) (Dagen 2 → 7)
   1. Op dag 2 verwijder de standaardmatrixcoatingoplossing uit de 60 mm Petri-schotels (doe de platen niet af) en vul ze met 5 ml / schotel complete neuroepitheliale inductiemiddel (NRI); Zie de tabel van materialen .
   2. Breng de drijvende EB's (vanaf stap 2.1.14) naar gecoate gerechten (~ 50 EBs / schotel) door een 200 μL pipet onder een stereoscopische miCroscope bij 4x vergroting en geplaatst in een laminar flow cabinet.
      OPMERKING: Het is cruciaal om homogene, middelgrote EB's (~ 200-300 μm in diameter) te selecteren. Te kleine EB's kunnen wellicht niet goed overleven tijdens neuroectodermale differentiatie, terwijl te grote EB's geneigd zijn kernnekrose te ondergaan.
   3. Incubeer de afwas bij 37 ° C en 5% CO ₂ .
   4. De dag daarna (Dag 3), controleer de gerechten onder de microscoop bij 10x vergroting om ervoor te zorgen dat de EB's allemaal zijn aangesloten.
   5. Voer voorzichtig een gemiddelde mediumverandering uit met compleet NRI-medium.
   6. Verander het NRI-medium elke andere dag tot dag 7, wanneer neuroepitheliale aggregaten (rozetten) zichtbaar moeten zijn.
   7. Op dag 7, de standaardmatrix (of laminine), zoals beschreven in stap 2.2, op elke gewenste plaat- of schotelformaat: 96-putjesplaten (100 μL / putje), 24-putjesplaten (250 μl / putje), 12- Putjes (500 μl / putje), MEA-chips (voor elektrische activiteit, 1 mL / single-well chip) of 60 mm Petri disheS (4 ml / schotel).
   8. Incubeer de gecoate platen / afzetten gedurende minstens 2 uur bij 37 ° C en 5% CO ₂ .
4. Rosette dissociatie en neuronale differentiatie (Dagen 8 → 28)
   OPMERKING: Deze procedure vereist goede manuele vaardigheden en precisie. Om te voorkomen dat mesodermale en endodermale cellen worden verzameld, dienen alleen ectodermrozetachtige structuren te worden gedisocieerd en verzameld.
   1. Op dag 8 snijd de rozetvormige structuren in fragmenten onder een stereoscopische microscoop bij 10X vergroting in steriele omstandigheden. Gebruik een 1 ml spuit met een 30G naald. Houd er rekening mee dat de rozetten vaak uit de schotel loskomen wanneer ze met de naald aangeraakt zijn.
   2. Vul de afscheiding van de rozetfragmenten af ​​door gebruik te maken van een pipette van 200 μl.
   3. Breng de schotel onder de laminaire stromende kap en breng de rozetfragmenten en hun medium in een 15 ml conische buis met een 1, 2 of 5 ml pipet. Spoel de schotel af met 2 ml NRI-medium om te herstellenAlle fragmenten.
   4. Spin de rozetfragmenten bij 112 xg gedurende 2 minuten af.
   5. Aspirateer de supernatant.
   6. Resulteer de pellet voorzichtig in 1 ml 1x DPBS (zonder calcium en magnesium) en roer de rozetfragmenten op en neer met behulp van een 1.000 μL pipet voorzichtig om ze te dissociëren.
   7. Voeg 4 ml compleet NRI-medium toe en tel de cellen met behulp van Trypan Blue en een geautomatiseerde celteller (zie de Tabel van Materialen )
      OPMERKING: Verdun 20 μL cel suspensie in 20 μL Trypan Blue. Deze stap kan worden weggelaten als de cellen niet in een enkelcelsuspensie kunnen worden gebracht. Als de rozetfragmenten niet helemaal loskomen, kunnen rozettenfragmenten afgeleid van ongeveer 50 EBs / 60 mm schotel worden geresuspendeerd in 50 ml volledig NRI-medium en geplateerd, zoals aangegeven in tabel 1 .
   8. Aspireer de standaardmatrix (of laminine) coatingoplossing uit de Petri-schotels, borden en / of MEA-chips (vanaf stap 2.3.7). Laat ze niet drogen.
   9. Plateer de cellen in compleet NRI-medium volgens het studieplan (ongeveer 15.000 cellen / cm2, zie tabel 1 voor het platen van volume-indicaties).
   10. Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.
   11. Op dag 10, voer een totale gemiddelde verandering uit met behulp van volledig neuronal differentiatie medium (ND); Zie de tabel van materialen.
   12. Vernieuw het volledige ND-medium twee keer per week tot 28 dagen.
   13. Karakteriseer de neuronale / gliale celderivaten, zoals beschreven in stap 5 (zie tabel 2 voor algemene acceptatiecriteria).

3. HiPSC-afgeleide neurale stamcellen (NSC) Uitbreiding en differentiatie in gemengde neuronen en Glia

OPMERKING: NSC's afgeleid van rozetfragmenten kunnen worden uitgebreid en onderhouden door de onderstaande procedure te volgen ( Figuur 1 , onderdeel). Dit maakt het mogelijk om th te verhogenE aantal cellen voor differentiatie en chemisch testen.

1. Bedek een 60 mm Petri-schotel (of een T-25-fles) met 5 ml standaardmatrix DMEM / F12 coatingoplossing en incubeer deze gedurende minstens 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2 (zoals beschreven in stap 2.2).
2. Spin de rozetfragmenten af ​​die afkomstig zijn van stappen 1-2 (zie stap 2.4.) In een conische 15 ml buis bij 112 xg gedurende 2 minuten.
3. Resulteer de pellet voorzichtig in 5 ml neuraal inductiemiddel (NI); Zie de tabel van materialen.
4. Breng de cellen over op een standaardmatrix-gecoate 60 mm Petri-schotel (of T-25 fles).
5. Cultuur rozet-afgeleide NSC's in aanwezigheid van NI-medium, verversen het medium elke andere dag totdat de cellen samenkomen.
6. Wanneer confluent, verplaats de NSC's zoals beschreven in de volgende stappen.
   OPMERKING: Verplaats de NSC's ongeveer een keer per week; Overweeg het gebruik van vers bedekte gerechten, flessen of platen, afhankelijk van het studieplan.
7. Verwijder het volledige NI medium en gentlY Spoel de NSC's af met DPBS (zonder calcium en magnesium).
8. Voeg 1,5 ml van 0,05% trypsine-EDTA voorverwarmd tot 37 ° C op de 60 mm Petri-schotel (of T-25-fles) die de cellen bevat en plaats gedurende 1 minuut in de incubator.
9. Trek de vaat (of fles) voorzichtig aan om de cellen los te maken.
10. Voeg 1,5 ml trypsine-remmers opgewarmd tot 37 ° C toe en laat de cellen overbrengen naar een 15 ml-buis.
11. Spoel de Petri schotel (of T-25 fles) met een gelijke hoeveelheid NI medium (1,5 ml) en haal het volume in dezelfde 15 ml buis op.
12. Centrifugeer de cellen bij 130 xg gedurende 3 minuten.
13. Verwijder supernatant en verwijder de cellen zachtjes in 1 ml compleet NI-medium met behulp van een 1.000 μL pipet.
14. Verdun de celsuspensie verder in 3 of 4 ml volledig NI-medium en tel de cellen met behulp van trypanblauw en een geautomatiseerde celteller.
15. Platte de NSC's op de 60 mm Petri-schotel (of T-25-fles) van stap 3.1 bij een dichtheid van ongeveer 50.000 cellen / cm2.
16. Doe elke andere dag een totale gemiddelde verandering met compleet NI-medium.
17. Karakteriseer de cellen voor de aanwezigheid van neuronale / gliale celderivaten, zoals beschreven in stap 5.
    OPMERKING: NSC's kunnen gedifferentieerd worden in gemengde culturen van neuronen en glia in volledig ND-medium (zoals beschreven in stappen 2.4.11-2.4.13), en verdubbelt het volledige ND-medium tweemaal per week gedurende 21 dagen.

4. HiPSC-afgeleide NSC Cryopreservation en Thawing

OPMERKING: Bij passaging kunnen NSC's worden bevroren en opnieuw ontdooid volgens deze procedure.

1. Centrifuge passaged NSCs (vanaf stap 3.12) bij 130 xg gedurende 3 minuten.
   OPMERKING: De cellen moeten in stap 3.14 worden geteld.
2. Zacht en langzaam resuspenderen van de NSC's bij 3 x 10 ⁶ / ml vriesmedium (zie de Tabel van Materialen ).
3. Aliquot de cellen in geschikte injectieflacons voor cryopreservering (ongeveer 0,5 ml = 1,5 x 10 ⁶ / injectieflacon).
4. Plaats de flesjes in een container fiMet 2-propanol gelegd en de houder gedurende minimaal 2 uur en tot 2 weken bij -80 ° C plaatsen.
5. Breng de flesjes naar de dampfase van een vloeibare stikstoftank.
6. Om de celcultuur opnieuw te starten, ontdooit 1 bevroren flesje in een waterbad bij 37 ° C.
7. Verzamel de cellen voorzichtig in 7 ml voorverwarmd compleet NI-medium in een 15 ml-buis met behulp van een 1.000 μL pipet.
8. Centrifugeer de cellen bij 130 xg gedurende 3 minuten.
9. Verwijder de supernatant en verwijder de cellen zachtjes in 1 ml volledig NI-medium met behulp van een 1000-μL pipet.
10. Verdun de celsuspensie verder in 3 of 4 ml volledig NI-medium en tel de cellen met behulp van trypanblauw en een geautomatiseerde celteller. Let op: verdun 20 μL celsuspensie in 20 μL trypanblauw, de levensvatbaarheid na ontdooien ≥ 80 %).
11. Platte de NSC's in een gecoate 60 mm Petri-schotel (of T25-fles) bij een dichtheid van ongeveer 50.000 cellen / cm2.

5. CharaCterisatie van hiPSC afgeleide neuronale en gliale cellen

OPMERKING: Bij differentiatie kunnen neuronale en gliale derivaten worden gekenmerkt door gebruik te maken van verschillende technieken, zoals die welke in de volgende secties worden beschreven.

1. Kwantitatieve real-time PCR (qPCR) analyses ¹⁰
   1. Spoel hiPSC-koloniefragmenten, EB's en / of NSC's bij 130 xg gedurende 3 minuten af.
   2. Resuspendeer de celpellet in 100 μL koude RNA lysisbuffer die in een geschikte kit voor RNA-extractie wordt verschaft.
   3. Alternatief, verzamelen neuronale / gliale derivaten direct van de platen door het medium te aspireren en koude RNA lysisbuffer aan de putjes toe te voegen om de cellen te verzamelen.
   4. Isoleer het RNA volgens de instructies van de fabrikant.
   5. Reverse-transcribe 500 ng van het totale RNA met behulp van een geschikte kit voor RNA naar cDNA retrotranscriptie.
   6. Voer qPCR reacties in tweevoud uit met behulp van de geschikte master mix en primerSets (zie de Tabel van Materialen ).
   7. Noteer de fluorescentie-emissie in real-time: 45 cycli met primers die bij 60 ° C gloeien.
   8. Normaliseer de relatieve RNA-hoeveelheden op GAPDH en β-actine als referentiegenen en gebruik ongedifferentieerde hiPSC's of onbehandelde cellen voor de kalibreringsomstandigheden (ΔΔCt-methode). Alternatief, gebruik een andere geschikte methode.
2. Immunocytochemie en high-content imaging (HCI) ^{6 , 11}
   1. Fix de hiPSC-kolonies, NSC's en / of neuronale / gliale derivaten met koude 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Was de cellen zachtjes in 1X PBS en houd de platen op bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand.
   3. Wanneer u klaar bent voor het vullen, permeabiliseer de cellen in de permeabilisatiebuffer (1x DPBS die 0,1% triton-X-100 en 3% BSA bevatten) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Verwijder de permeabilisatie buFfer en incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in blokkerende buffer (3% BSA / 1X DPBS) om de nonspecifieke binding van antilichamen te voorkomen.
   5. Verwijder de blokkerende buffer en incubeer de cellen gedurende de nacht bij 4 ° C in blokkerende buffer die geschikte primaire antilichamen bevat (zie de tabel van materialen ).
   6. Was de cellen 3 keer met 1x PBS.
   7. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in blokkerende buffer die fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen bevat (zie de Tabel van Materialen ), waarbij de kernen met DAPI-kleurstof tegenversteken worden.
   8. Kwantificeer de gemiddelde fluorescentieintensiteit en de relatieve percentages celtypes met behulp van een geschikt beeldvormingsplatform voor hoogwaardige inhoud, indien beschikbaar (zie de Tabel van Materialen ).
      OPMERKINGEN: Om het intensiteitsniveau van de fluorescerende achtergrond te bepalen, incubereer enkele cellen / putten alleen met secundaire antilichamen. De flowcytometrische analyse van levend (niet vast), undGepubliceerde hiPSCs kunnen worden uitgevoerd om de expressie van PSC-specifieke markers, zoals SSEA4, te beoordelen (zie de Tabel van Materialen ). Niet-gedifferentieerde hiPSC kolonies kunnen worden geanalyseerd voor alkalische fosfatase activiteit met gebruik van commercieel verkrijgbare BCIP / NBT kits, volgens de instructies van de fabrikanten (zie de Tabel van Materialen ). Daarnaast kunnen assays en analyses van omgekeerde fase eiwit (RPPA) worden uitgevoerd, zoals beschreven in Referentie 12 (voor een lijst van geteste antilichamen, zie de Tabel van Materialen ).
3. Elektrofysiologische metingen ¹³
   1. Plate de dissociëerde rozetfragmenten (na 7 DIV) of NSC's afgeleid van rozetten op gecoate multielektrode arrays (MEAs, zie de Tabel van Materialen ) in compleet ND-medium (~ 1 x 10 ⁵ cellen / single-well MEA chip).
   2. Differentieer de cellen gedurende 3 weken in compleet ND medium, verfrissende thE medium twee keer per week.
   3. Na afloop van de differentiatie, verzegel de MEA-chips met een semi-doorlatend membraan onder een laminaire stroomkap om de culturen steriel te houden voor herhaalde metingen.
   4. Vervang een van de elektroden met één grondreferentie, zodat u de resterende elektroden kunt opnemen.
   5. Noteer de gemiddelde vuurfrequentie (MFR, aantal spikes / min) met behulp van een MEA versterker met de geïntegreerde temperatuur procesregeling aangepast op 37 ° C en 5% CO ₂ .
   6. Ontdek pieken van de MEA-ruwe gegevens met behulp van drempelwaarde van -4.7σ (σ staat voor de standaardafwijking van het basale geluid).
   7. Verwerk de post-opname data met een geschikte software.

Resultaten

Karakterisering van ongedifferentieerde hiPSCs

Om het fenotype van de hiPSCs te beoordelen, moet de analyse van de kolonie / celmorfologie, de bepaling van PSC-specifieke markers en het onderzoek van de genexpressie en alkalische fosfaatactiviteit worden uitgevoerd. Ongedifferentieerde hiPSC's zouden rond moeten zijn, met grote nucleolen en zonder overvloedig cytoplasma. De meerderheid van de kolonies zou moeten worden gekenmerkt door een platte en stevig verpakte morfologie, indicatief voor een ongedifferentieerd fenotype ( Figuur 2A en Figuur 2B ). Bovendien zouden meer dan 80% van de kolonies positief moeten zijn voor alkalische fosfatase-activiteit kleuring ( Figuur 2C ).

Ongeveer 80% van de cellen zou positief moeten zijn voor klassieke pluripotentie-gerelateerde markers, zoals Oct4, SSEA3, SSEA4 en Tra1-60 ( Figuur 2D-H ), zoals getoond door immunocytochemie en stromingscytometrie, terwijl percentages nestin ⁺ en β-III-Tubulin ⁺ cellen significant lager moeten zijn (respectievelijk 8% en 3% Zoals getoond in figuur 2H ). Deze resultaten zouden over de passages reproduceerbaar moeten zijn.

Figuur 2. Karakterisering van ongedifferentieerde IMR90-hiPSCs. (A en B) Representatieve fase-contrast beelden (10X en 20X vergrotingen) van ongedifferentieerde IMR90-hiPSC kolonies. (C) representatieve afbeeldingen van alkalische fosfatase-gekleurde kolonies (4X vergroting). (DF) Representatieve immunocytochemische beelden van (D) Oct4 (rood), (E) SSEA3 (groen) en (F) TrA1-60 (groen). (G) Representatieve stip plot van SSEA1 (CD15) en SSEA4 kleuring, geanalyseerd door flow cytometry. (H) De staafdiagram geeft de percentages van Oct4 ⁺ (~ 75-80%), Tra1-60 ⁺ (~ 75-80%), SSEA3 ⁺ (~ 75-80%), nestin ⁺ (~ 10-15% ) En β-III-tubuline ⁺ (~ 3 - 7%) cellen, tegenverfsteld met DAPI en gekwantificeerd door HCI, met een gemiddelde van 3 tot 5 biologische replicaten ± de SEM (grafiek gemodificeerd uit referentie 6). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Beoordeling van pluripoten via EB-vorming

HiPSC's zijn pluripotent, wat betekent dat ze onder kieme omstandigheden drie kiemlaaggerelateerde genen uitdrukken. Om de hiPSC pluripotency te beoordelen, is het mogelijk om een ​​gemeenschappelijke toepassing toe te passenAanpak gebaseerd op spontane EB-vorming, die de vorming van de drie kiemlagen ¹⁴ induceert. Analyses van kiemlaagspecifieke genen moeten een tijdsafhankelijke toename van endoderm (α-fetoproteïne (AFP) en cytytatine 18 (KRT18)) aanduiden, ectoderm (Nestin, SRY-doos 1 (Sox1) en gepaarde doos 6 (Pax6) ) En mesoderm (natriuretische peptide A (NPPA) en Brachyury-T) -relateerde genexpressie ( Figuur 3A en Figuur 3B ); Zie de tabel van materialen.

Figuur 3. Beoordeling van Pluripotentie door EB-vorming. (A) Representatief fasecontrastbeeld van EB's op dag 1. (B) De staafdiagram toont qPCR-analyses van mesodermale (NPPA en brachyury), ectodermale (Pax6, Sox1 en nestin) en endodermale (AFP en KRT18 ) Genen genormaliseerd naar de referentie genen, β-actine en GAPDH, en gekalibreerd naar niet-gedifferentieerde cellen (Dag 0). Dit is de ΔΔCt methode, met een gemiddelde van 5 onafhankelijke analyses ± de SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Grafiek gewijzigd van Referentie 6. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Inductie van neuronale en gliale differentiatie

IMR90-iPSC's kunnen worden onderscheiden in gemengde culturen van post-mitotische neuronen en glialcellen volgens de stappen samengevat in figuur 1 en in de protokol secties. 5-8 dagen na de plating van de EB's op standaardmatrix- of laminine-gecoate gerechten in aanwezigheid van compleet NRI-medium, moeten rozetachtige structuren zichtbaar worden (= "Xfig"> Figuur 4A). Rozetten worden gekenmerkt door de aanwezigheid van nestin ⁺ cellen (neuronale precursoren, ~ 90%), met weinig β-III-tubulin ⁺ cellen (toegewijde neuronale cellen, ~ 5 - 10%), die meestal hoofdzakelijk gelokaliseerd zijn aan de periferie van de Rozetten ( figuur 4B , rozetten op dag 12).

Bij rosette dissociatie en repliceren op laminine- of standaardmatrix-gecoate schotels of platen in aanwezigheid van compleet ND-medium beginnen cellen onderscheid te maken in gemengde culturen van neuronen en glia, die clusters van neuronale cellichamen die verbonden zijn met bundels van neurieten progressief vormen ( Figuur 4C en figuur 4D ). Vergelijkbare resultaten zouden moeten worden verkregen bij het analyseren van neuronale populaties verkregen door roset-afgeleide NSC's uit te breiden en ze te differentiëren in neuronen en glia. NSC's die uit rozetten worden uitgebreid, moeten n zijnEstin ⁺ ( Figuur 4E , inset met nestin ⁺ cellen).

Na 21 dagen van differentiatie zouden de cellen positief moeten zijn voor P-III-tubuline; NF200; tau; En MAP2, de late marker van dendriten ( Figuur 4D , 4F en Figuur 4H), met tenminste 10-15% van de cellen die positief zijn voor het glialfibrillair zuur eiwit (GFAP), een astrogliale marker ( Figuur 4G en Figuur 4H) . Bovendien zou ~ 20 - 30% van de cellen de expressie van nestin na differentiatie behouden ( Figuur 4H ). Het is belangrijk om te overwegen dat het percentage van elk celtype ( dat wil zeggen neuron, astrocyt, nestin ⁺ cellen) per passage kan variëren en de gebruiker-afhankelijke variabiliteit kan worden waargenomen.

Door het analyseren van specifieke neuronale subpopulaties, vertegenwoordigen GABAergische neuronen15 tot 20% van de totale cellen, dopaminergische neuronen ~ 13-20% en glutamatergische neuronen ~ 35-42%, zoals getoond door immunostaining voor gamma-aminoboterzuur (GABA), tyrosinehydroxylase (TH) en vesiculair glutamaat Transporteur 1 (VGlut1), respectievelijk (zie de representatieve kwantificering in Figuur 4H ). De inductie van differentiatie kan ook worden beoordeeld aan de hand van de analyse van pluripotentie-gerelateerde markers (bijvoorbeeld Oct4, Tra1-60 en SSEA3), die in gedifferentieerde cellen versus niet-gedifferentieerde hiPSC's moet worden geregeld (niet getoond, zie Referentie 6). Dit kan ook bevestigd worden door middel van de analyse van genuitdrukking door qPCR, die een afname van Oct4 en Nanog zou aanduiden en de upregulatie van neuronale genen, zoals neurale celadhesiemolecule 1 (NCAM1) en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2); Het presynaptische gen, synaptofysine (SYP); En het post-synaptische gen, microtubule-geassocieerde eiwit tau (MAPT), zoals getoond in < Sterke klasse = "xfig"> Figuur 4I. Verder zijn dopaminergische (TH en NR4A1), noradrenerge (PHOX2A en PHOX2B), glutamatergische (NARG2, GRIA1 en GAP43), GABAergic (GABRA1 en GABRA3), motorneuronen (ISL1 en LHX3) en cholinergische (SLC5A7 en SLC18A13) verwante genen Resulteren in upregulated neuronale cellen vergeleken met ongedifferentieerde cellen ( Figuur 4J ).

De analyse van spontane elektrische activiteit, met behulp van MEA, is een waardevolle uitlezing om de functionaliteit van het neuronale netwerk in gedifferentieerde hiPSCs te beoordelen. Aan het einde van de differentiatieperiode worden neuronale derivaten gekenmerkt door een gemiddelde vuurfrequentie (MFR) van ten minste 60 spikes / min (zie het representatieve rasterplot in figuur 4K ). Er worden echter geen barsten gezien.

55702fig4.jpg "/>
Figuur 4. Differentiatie van IMR90-hiPSCs in Gemengde Culturen van Neuronen en Glia. (A en B) Representatieve beelden van rozetten na 7 DIV (A) en na 12 DIV (B) , gekleurd voor nestin (groen) en β-III-tubuline (rood). (C en D) Representatieve beelden van gedifferentieerde cellen na 22 DIV (C) en 28 DIV (D) , gekleurd voor P-III-tubuline (rood) en NF200 (groen)). (E) Representatief beeld van NSC's afgeleid van rosette dissociatie en expansie (inzet toont nestin ⁺ cellen, rood). (F en G) Representatieve beelden van neuronale cellen ( F , gekleurd voor NF200 (rood) en Tau (groen)) en gliale cellen ( G , gekleurd voor GFAP (rood)) onderscheiden van NSC's (na 21 DIV). (H) Kwantificering van nestine, MAP2, GFAP, gamma-aminoboterzuur (GABA), vesiculaire glutamaattransporteur 1 (VGlut1) en tyrosinehydroxylase (TH) -positieve cellen door HCI, waarbij IMR90-hiPSC-derivaten en cellen werden gedifferentieerd van IMR90-hiPSC afgeleide NSC's (grafiek gemodificeerd uit referentie 7). (I en J) Staafdiagrammen die qPCR-analyses van pluripotencygenen (Oct4 en Nanog) en neuronale genen (NCAM1, MAP2, SYP en MAPT) (I) en van dopaminergische (TH en NR4A1), noradrenerge (PHOX2A en PHOX2B) tonen, Glutamatergic (NARG2, GRIA1 en GAP43), GABAergic (GABRA1 en GABRA3), motorneuron (ISL1 en LHX3) en cholinergische (SLC5A7 en SLC18A13) verwante genen (J) . Alle analyses werden genormaliseerd naar de referentie genen, β-actine en GAPDH, en gekalibreerd naar niet-gedifferentieerde cellen (groene staven). Dit is de ΔΔCt methode, met een gemiddelde van 5 onafhankelijke analyses ± de SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. De grafieken in I en J werden gewijzigd uit Referentie 6. (K) Representatieve raster-grafiek van IMR90-NSC-afgeleide neurOns (de opname werd uitgevoerd voor minimaal 600 s, de verticale staven vertegenwoordigen enkele spikes). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een specifieke handtekening van neuronale markers wordt geherreguleerd in gedifferentieerde IMR90-hiPSC's

In het nieuwe toxiciteits testparadigma is het essentieel om de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die zich voordoen in een cel na blootstelling aan een bepaald toxicant te definiëren. Daarom is het relevant om te specificeren welke signaalwegen worden geactiveerd en / of gereguleerd binnen het onderzochte cellulaire model.

Commercieel beschikbare arrays voor de analyses van proteïne kinase genuitdrukking kunnen gebruikt worden om ongedifferentieerde hiPSCs tegen gedifferentieerde cellen te vergelijken. GesplitsteGedifferentieerde IMR90-hiPSC's ondergaan de upregulatie van genen die betrokken zijn bij de controle van neurotrofinreceptoren, axonbegeleiderregulatie, neurietgroei modulatie, glial-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) receptoren, botmorfogenetische eiwit (BMP) / TGF-beta pathway en bloedplaatjes- Afgeleide groeifactor (PDGF) receptoren ( Figuur 5A en Figuur 5B ).

De analyse van RPPA toont de upregulatie van een specifieke neuronale handtekening in gedifferentieerde IMR90-hiPSCs. In het bijzonder worden Erk / CREB, Akt / PDK1 / mTOR en Notch1 signaalwegen geactiveerd bij differentiatie ( Figuur 5C ).

Figuur 5. Gedifferentieerde Neuronale en Gliale cellen tonen de Activatie van Neuron-gerelateerde Wegen. (EENEn B) Staafgrafieken rapporteren de qPCR analyses van neuron-gerelateerde kinasen (A) en andere kinase gerelateerde genen (B) . Gene-expressiegegevens werden genormaliseerd aan de referentiegenen 18S en GAPDH (in de matrix verschaft) en gekalibreerd naar niet-gedifferentieerde cellen. Voor deze analyses werd een gen significant gereguleerd als zijn expressie tenminste 2x hoger was dan in niet-gedifferentieerde cellen (2 ^-ΔΔCt ≥ 2); Gemiddelde van 3 onafhankelijke analyses ± de SEM). (C) De staafdiagram toont de absolute eiwit kwantificeringen door middel van RPPA analyse, waarbij gedifferentieerde (rode staven) en ongedifferentieerde cellen (groene staven) worden vergeleken. De eiwitten die behoren tot dezelfde signaleringspadcascades worden als volgt samengevoegd: CREB / ERK / AKT, PDK1 / mTOR / Erk / Akt, Notch1, Shh en Wnt, SAPK / JNK en BMP / SMAD. Gemiddelde ± de SEM van 4 onafhankelijke analyses. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Grafiek gemodificeerd fRom Referentie 6. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

IMR90-hiPSC-afgeleide neuronale / gliale culturen kunnen worden gebruikt om de effecten van rotenon te beoordelen

Rotenon, een remmer van complex I van de mitochondriale ademhalingsketen, is bekend om oxidatieve stress te veroorzaken door de activatie van de Nrf2-weg te activeren. Onder rustige omstandigheden wordt Nrf2 verankerd in het cytoplasma door Keap1 (Kelch-achtig ECH-geassocieerd eiwit 1), een Nrf2-repressor, die Nof2-ubiquitinatie en proteolyse ¹⁵ vergemakkelijkt. Na de inductie van oxidatieve stress translateert Nrf2 in de kern en activeert de expressie van Nrf2-ARE doelgenen ¹⁶ .

IMR90-hiPSC-afgeleide neuronen enD glialcellen kunnen gebruikt worden om de effecten van rotenon op Nrf2-activering te beoordelen door de cellen gedurende 24 uur aan verschillende concentraties rotenon (bijvoorbeeld 1, 10 en 100 nM) bloot te stellen. Deze concentraties werden vastgesteld volgens eerdere studies ^{17 , 18} .

Bij deze concentraties en tijden van blootstelling resulteerde rotenon niet in cytotoxiciteit, zoals blijkt uit de kwantificering van levende DAPI ⁺ celkernen ( Figuur 6A ). Rotenon geïnduceerde Nrf2 nucleaire translocatie, vooral nadat de cellen werden blootgesteld aan 100 nM rotenon ( Figuur 6B en Figuur 6E ). Bij dezelfde concentratie werd een significante daling van de cytoplasmatische Keap1 waargenomen ( Figuur 6C ), samen met een toename van zowel NAD (P) H-kinonoxidoreductase 1 (NQO1) en Sulfiredoxine 1 (SRXN1), twee Nrf2-target enZymes ^{19 , 20} ( Figuur 6D ).

Figuur 6. Effecten van Rotenone op Nrf2 nucleaire translocatie, Keap1, SRXN1 en NQO1 eiwitgehalten. (A) Kwantificering van levende DAPI ⁺ cellen ( dwz non-pyknotische kernen) na 24 uur behandeling met 1, 10, 100 nM rotenon en genormaliseerd naar onbehandelde cellen (Control, Ctr). (B) nucleaire translocatie van nrf2-eiwitten ( dwz nucleaire / cytoplasmatische verhoudingen) na 24 uur blootstelling aan rotenon, beoordeeld door metingen van fluorescentie-intensiteit met behulp van HCI-analyse. (C) Kwantificering van cytoplasmatische Keap1 eiwitgehalten bij rotenonebehandeling, beoordeeld door HCI analyse. (D) Kwantificering van NAD (P) H-kinon oxidoreductase 1 (NQO1) en SulfiRedoxine 1 (SRXN1) door middel van immunofluorescentie en HCI na 24 uur behandeling met rotenon. (E) Representatieve beelden van Nrf2 eiwit lokalisatie (groen). Alle waarden worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM van 3 biologische replicaten. * P <0,05, ** p <0,01; Figuur gewijzigd van referentie 7. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Bij deze concentraties en tijden van behandeling heeft rotenon ook een concentratieafhankelijke toename van het astrogliale (GFAP ⁺ ) celpercentage opgewekt ( Figuur 7A en Figuur 7B ), zonder de proporties van NSC's (nestin ⁺ ) en neuronen (MAP2 ⁺ ) te beïnvloeden ( Figuur 7B ). Door naar de verhoudingen van specifieke neuronale subtypen te kijken, werd rotenonebehandeling (10 nM en 100 nM)Het aantal dopaminergische neuronen (TH ⁺ ) ( Figuur 7C en D ) daalde aanzienlijk, terwijl de percentages GABAergic (GABA ⁺ ) en glutamatergische (VGlut1 ⁺ ) neuronen niet veranderden ( Figuur 7D ). Analoog hebben vorige in vivo en in vitro studies een rotenonafhankelijke en selectieve dopaminergische neuronale cel-dood ^{21 , 22 , 23} beschreven.

Figuur 7. Effecten van Rotenone op Glialcellen en Dopaminerge Neuronen. (A) Representatieve afbeeldingen van GFAP ⁺ cellen (rood), met 40X vergroting in de insets, onbehandeld of behandeld met 100 nM rotenon gedurende 24 uur. (B) Kwantificering Van nestin ⁺ , MAP2 ⁺ en GFAP ⁺ cellen, genormaliseerd naar onbehandelde cellen (controle, Ctr). (C) Representatieve beelden van dopaminergische TH ⁺ neuronen (groen), met 40X vergroting in de insets, onbehandeld of behandeld met 100 nM rotenon gedurende 24 uur. (D) Kwantificering van GABA ⁺ , VGlut1 ⁺ en TH ⁺ neuronale cellen, genormaliseerd naar onbehandelde cellen (Ctr). Alle waarden worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM van 3 biologische replicaten. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Figuur gewijzigd van referentie 7. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Statistische significantie werd beoordeeld door een eenmalige ANOVA met Dunnett's Multiple Comparison Test als post-test (vergelijking van alle kolommen versus de controle kolom)Xref "> 24 of door twee-tailed unpaired of paired t-test volgens het type analyse. Alle gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van ten minste drie biologische replicaten ± de standaard fout van het gemiddelde (SEM). Een sterretje over een balk geeft aan Een significant verschil met de controlegroep. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Tafel 1.
Opmerking over gedissocieerde rozetplatingdichtheid: als rozetfragmenten niet helemaal gedissocieerd worden, om een ​​celplatingdichtheid van ongeveer 15.000 cellen / cm2 te bereiken, kunnen dissocieerde rozettenfragmenten die afkomstig zijn van ongeveer 50 EBs / 1 x 60mm-schotel opnieuw worden gesuspendeerd in 50 ml compleet NRI-medium en als volgt geplateerd (afhankelijk van de plaatformaat):

Multiwellplaten / MEA	Groei gebied (cm 2 / putje)	Volume van cel suspensie naar plaat per putje (of MEA chip)	Maximaal aantal platen die kunnen worden geplateerd (met 50 ml cel suspensie)
96 putten	0.3	100 ul	5
48 putten	0.7	220 ul	4
24 putten	2	625 ul	3
12 putten	4	1,25 ml	3
6 putten	10	3.125 ml	2
Enkele goed MEA chip	3.5	1,1 ml	45

Tabel 2: Acceptatiecriteria

Markeerstift /Antilichaam	Percentage (op DAPI + (levende) cellen) na 28 DIV
B-III-tubuline (Tuj1)	35-45%
MAP2	50-60%
NF200	45-55%
GFAP	10-25%
Nestin	15-25%

Discussie

Dit werk beschrijft een robuust en relatief snel protocol voor de differentiatie van IMR90-hiPSC's in postmittotische neuronen en glialcellen. Voorheen gepubliceerde neuronale differentiatieprotocollen op basis van hESCs en hiPSCs geven gewoonlijk hoge percentages neurale precursors ^{25 , 26} en een significant aantal neuronale doelcellen ^{27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33} . Analoog is het hier beschreven hier beschreven differentiatieprotocol geschikt om heterogene kulturen van GABAergische, glutamatergische en dopaminergische neuronale cellen te genereren, samen met glia en een discreet aandeel van nestin ⁺ cellen. De aanwezigheid van glutamatergische (~ 35-42%) en GABAergic (~ 15-20%) neurale cellen suggereert datDeze cultuur bezit voorhoofd, corticale eigenschappen, en de aanwezigheid van een discreet aantal dopaminerge neuronen (~ 13-20%) kan ook de middelste hersenen specificiteit aanduiden. Bovendien kan de duur van een bescheiden deel van nestin ⁺ cellen blijken geschikt te zijn voor de studie van neurogenese en de mogelijke effecten van chemicaliën op NSC's, die hoofdzakelijk beperkt zijn tot zowel de hippocampus als de subventriculaire zone (SVZ) van het voorhoofd ³⁴ . Verdere immunocytochemische en genexpressie-analyses zouden helpen om de regionale specificiteit van de gedifferentieerde celderivaten beter te definiëren.

De twee meest kritische stappen in het differentiatieprotocol beschreven in dit document zijn: (i) het snijden van hiPSC-kolonies in homogene fragmenten (die van cruciaal belang is voor de generatie van EB's met homogene afmetingen) en (ii) het snijden van neuroectodermale structuren (rozetten ) Voor NSC-differentiatie, die een aanzienlijke handvaardigheid vereistEn precisie om te voorkomen dat mesodermale en endodermale cellen worden verzameld die de verhoudingen van neuronen en glialcellen die worden verkregen bij differentiatie, kunnen verminderen.

Het is van cruciaal belang om de fenotypen van de cellen tijdens expansie te karakteriseren (als ongedifferentieerde kolonies of NSC's) en tijdens alle differentiatie stappen. In het bijzonder zouden de gen- en eiwituitdrukkingsprofielen van de neuronale / gliale celderivaten upregulatie en activatie van neurongerelateerde signaleringswegen moeten tonen, terwijl de expressie van pluripotentiemarkers moet worden verlaagd.

De generatie van EB's en neuroectodermale derivaten (rozetten) kan manueel uitdagend en vatbaar zijn voor variabiliteit. Om deze reden hebben we een protocol ontwikkeld voor de uitbreiding van rosette-afgeleide NSC's en hun verdere differentiatie in neuronale / gliale cellen.

Mogelijke beperkingen van dit differentiatieprotocol zijn voornamelijk (i) het relatief lage percentage dGerelateerde glialderivaten en (ii) het gebrek aan volwassen neuronale netwerkfuncties (zoals blijkt uit het gebrek aan barsten). Bovendien kunnen specifieke subpopulaties van astrocyten functioneren als primaire stamvogens of NSC's ³⁵ . Terwijl nestine / GFAP dubbel-positieve cellen niet in deze gedifferentieerde celkweek werden waargenomen (data niet getoond), wordt verondersteld dat de GFAP ⁺ -cellen in deze gemengde culturen astrocytische stamvaders en astrocyten zijn. Het is aannemelijk dat door het verlengen van de tijd van differentiatie het aantal astrocyten kunnen toenemen, en hun morfologie kan volwassen worden, zoals reeds aangegeven door de vorige werken van Zhang's groep ^{36 , 37} .

In het nieuwe toxiciteits testparadigma is kennis over chemisch geïnduceerde verstoringen van biologische wegen van het grootste belang bij het beoordelen van chemische tegenstrijdigheid. Daarom moeten in vitro testsystemen kunnenNegatieve effecten op versteurings van signaalwegen veroorzaken, volgens het concept van de ongunstige uitkomstweg (AOP). Als bewijs van concept kan rotenon gebruikt worden om de activatie van de Nrf2-weg te beoordelen, die betrokken is bij de cellulaire verdediging tegen oxidatieve of elektrofile stress ³⁸ en oxidatieve stress is een belangrijk en algemeen belangrijk gebeurtenis in verschillende AOP's die relevant zijn voor Ontwikkelings- en volwassen neurotoxiciteit ³⁹ .

Rotenon zou de activatie van de Nrf2-weg moeten ontlokken, die kan worden aangetoond door Nrf2 proteïne nucleaire translocatie en verhoogde expressie van Nrf2-doel enzymen, waaronder NQO1 en SRXN1. Er is gebleken dat rotenon een dosisafhankelijke toename van GFAP-eiwitgehalten induceert, indicatief voor astrocytactivering ^{40 , 41} . Rotenon vermindert ook het aantal dopaminerge (TH ⁺ ) cellen, die in overeenstemming is met previIn vitro en in vivo onderzoeken die rotenonafhankelijke dopaminergische celdood zien, aangezien dit type neuron bijzonder gevoelig is voor oxidatieve stress ^{21 , 22 , 23} .

Ten slotte is dit hiPSC-afgeleide neuronale en gliale celcultuurmodel een waardevol hulpmiddel om de neurotoxische effecten van chemicaliën die oxidatieve stress oplevert, te leiden tot de activering van Nrf2-pathologie. Aangezien dit differentiatieprotocol zorgt voor de opwekking van gemengde culturen van neuronale cellen (GABAergische, dopaminergische en glutamatergische neuronen) en astrocyten, kan het wellicht geschikt zijn om de kruisvorming tussen neuronen en glia in fysiologische en pathologische aandoeningen te bestuderen, zoals bij neurodegeneratieve ziekten ( Bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson). Bovendien kan de aanwezigheid van een significant deel van NSC's helpen bij het beoordelen van de mogelijke effecten van chemicaliën op neurale progEnitors, die bekend zijn als het hoofddoel van chemisch geïnduceerde mutaties of virale infecties ⁴² .

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Complete hiPSC medium:
mTeSR1 Basal Medium	Stem Cell Technologies	05851	(Stap 1.2.6). Complete mTeSR1 is stabiel wanneer bewaard bij 2 - 8 °C gedurende maximaal 2 weken. 5x Supplements kunnen worden verdeeld in werkende aliquots en bewaard bij -20 °C. Gevroren aliquots binnen 3 maanden gebruiken.
mTeSR1 5x Supplements	Stem Cell Technologies	05852
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	1:100 (Stap 1.1). Ontdooi Matrigel op ijs, bereid 200 μL aliquots voor en bewaar deze in -80 °C. Voor coating, verdun 200 μL aliquot in 20 mL van DMEM/F12 medium.
CryoStem Freezing Medium	Stemgent	01-0013-50	Vries ~ 100 fragmenten/250 μL/vial (Stap 1.2.1)
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
hiPSC EB medium:
Knockout DMEM	Thermo-Fisher	10829-018	(Stap 2.1.7)
Knockout Serum Replacement (KOSR)	Thermo-Fisher	10828-028	20% uiteindelijke concentratie (Stap 2.1.7)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Stap 2.1.7)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL uiteindelijke concentratie (Stap 2.1.7)
L-Glutamine 200 mM Solution	Thermo-Fisher	25030-081	2 mM uiteindelijke concentratie (Stap 2.1.7)
β-Mercaptoethanol	Thermo-Fisher	31350-010	50 µM uiteindelijke concentratie (Stap 2.1.7)
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Complete neuroepithelial inductiemedium (NRI):
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	(Stap 2.3.1)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Stap 2.3.1)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Stap 2.3.1)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL uiteindelijke concentratie (Stap 2.3.1)
Heparine Grade I-A, ≥180 USP eenheden/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	2 µg/mL uiteindelijke concentratie (Stap 2.3.1)
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	20 ng/mL uiteindelijke concentratie toegevoegd voor gebruik (Stap 2.3.1)
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	1:100 (Stap 2.2). Ontdooi Matrigel op ijs, bereid 200 μL aliquots voor en bewaar deze in -80 °C. Voor coating, verdun 200 μL aliquot in 20 mL van koud DMEM/F12 medium.
Laminine	Sigma-Aldrich	L2020	1:100 (Stap 2.2). Verdun in PBS 1x.
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Complete Neuronal Differentiatiemedium (ND):
Neurobasal Medium	Thermo-Fisher	21103049	(Stap 2.4.11)
B-27 Supplements (50x)	Thermo-Fisher	17504044	(Stap 2.4.11)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Stap 2.4.11)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL uiteindelijke concentratie (Stap 2.4.11)
GDNF	Thermo-Fisher	PHC7045	1 ng/mL uiteindelijke concentratie. Toegevoegd voor gebruik. (Stap 2.4.11)
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	2.5 ng/mL uiteindelijke concentratie. Toegevoegd voor gebruik. (Stap 2.4.11)
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Neural inductiemedium (NI):
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	(Stap 3.3)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Stap 3.3)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Stap 3.3)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL uiteindelijke concentratie (Stap 3.3)
Heparine Grade I-A, ≥180 USP eenheden/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	2 µg/mL uiteindelijke concentratie (Stap 3.3)
B-27 Supplement (50x), minus vitamine A	Thermo-Fisher	12587010	(Stap 3.3)
L-Glutamine 200 mM Solution	Thermo-Fisher	25030-081	2 mM uiteindelijke concentratie (Stap 3.3)
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	10 ng/mL uiteindelijke concentratie. Toegevoegd voor gebruik (Stap 3