De herkenningstest roman-Object voor het onderzoek naar leren en geheugen in muizen

Samenvatting

De herkenningstest object (ORT) is een eenvoudige en efficiënte test voor de evaluatie van leren en geheugen in muizen. De methodologie wordt hieronder beschreven.

Samenvatting

De herkenningstest object (ORT) is een veelgebruikte gedrags assay voor het onderzoek van verschillende aspecten van het leren en geheugen in muizen. De ORT is vrij eenvoudig en kan worden afgerond over 3 dagen: gewenning dag, trainingsdag en testen dag. Tijdens de opleiding is de muis toegestaan om het 2 identieke objecten te verkennen. Op dag van de test, wordt een van de objecten van de opleiding vervangen door een nieuw object. Omdat muizen een aangeboren voorkeur voor nieuwheid, hebben als de muis het vertrouwde object wordt herkend, zal het verteren allermeest zijn tijd op het nieuwe object. Als gevolg van deze aangeboren voorkeur is er geen behoefte aan positieve of negatieve versterking of lang trainingsschema's. De ORT kan daarnaast ook worden gewijzigd voor tal van toepassingen. De retentie-interval kan worden ingekort om te onderzoeken van korte-termijn geheugen of verlengd om de sonde van de lange-termijn geheugen. Farmacologische interventies kan worden gebruikt op verschillende tijdstippen voorafgaand aan de opleiding, na de training, of voorafgaand aan herinneren om te onderzoeken van de verschillende fasen van het leren van (dat wil zeggen, overname, vroeg of laat consolidatie of recall). Over het geheel genomen de ORT is een relatief lage-stress, efficiënte test voor geheugen bij muizen, en is geschikt voor de detectie van neuropsychologische veranderingen na farmacologische, biologische of genetische manipulaties.

Inleiding

Het object herkenningstest (ORT), ook bekend als het nieuwe object herkenningstest (NOR), is een relatief snel en efficiënt middel voor de verschillende fasen van het leren en geheugen testen in muizen. Het was oorspronkelijk beschreven door Ennaceur en Delacour in 1988 en wordt vooral gebruikt in ratten¹; echter, het sindsdien met succes aangepast voor gebruik in muizen^2,3,4,5,6,7. De test is gebaseerd op zo weinig als drie sessies: een gewenning sessie, één trainingssessie en een testsessie. Opleiding gaat gewoon visuele verkenning van twee identieke objecten, terwijl de testsessie omvat een van de eerder onderzocht objecten te vervangen door een nieuw object. Omdat knaagdieren een aangeboren voorkeur voor nieuwheid hebben, zal een knaagdier die het vertrouwde object onthoudt besteden meer tijd het verkennen van het nieuwe object^7,8,9.

Het belangrijkste voordeel van de ORT over andere knaagdieren geheugentests is dat het is gebaseerd op de natuurlijke neiging van de knaagdieren voor het verkennen van de nieuwheid⁸. Daarom is er geen behoefte talrijke trainingen of een positieve of negatieve versterking te motiveren gedrag. Dit betekent dat de ORT veel minder stress, ten opzichte van andere proeven^{10,11,12,13,14,15 is}, en aanzienlijk vereist minder tijd in beslag dan andere geheugen veelgebruikte proeven, zoals de Morris water maze of Barnes doolhof, die beide kan tot een week of langer. Bijgevolg de voorwaarden van de ORT meer sterk gelijken op die welke worden gebruikt bij het bestuderen van de menselijke cognitie, verhoging van de ecologische validiteit van de test over vele andere knaagdieren geheugentests. Ook omdat ORT een eenvoudige visuele terugroepen taak is, is het geweest met succes aangepast voor gebruik in vele soorten, met inbegrip van mensen en niet-menselijke primaten, om te beoordelen van verschillende aspecten van de tussen de verschillende soorten van declaratieve geheugen ^{2,16 ,17}. Tot slot kan de ORT eenvoudig worden aangepast om te onderzoeken van de verschillende fasen van het leren en geheugen (d.w.z., acquisitie, consolidatie of recall), om te beoordelen van verschillende soorten geheugen (b.v., ruimtelijke geheugen), of om te beoordelen van verschillende retentie intervallen (dat wil zeggen, op korte termijn versus lange-termijn geheugen).

De veelzijdigheid van de ORT biedt een platform voor ontelbare onderzoek toepassingen. Studies kunnen maken gebruik van farmacologische agenten te verstoren of geheugen te verbeteren. Variërend van de tijd van drug administratie vóór of na de training, of vóór de test kan wijzen op de onderliggende neurale mechanismen die tot leiden verstoord of verbeterde geheugen^{6,18,19, 20}. op een gelijkaardige manier, optogenetic technologie kan worden gebruikt op deze zelfde verschillende tijdstippen te kijken naar de neurale activering/inhibitie die aan de verschillende fasen van het leren en geheugen bijdraagt. De ORT is ook geschikt voor de beoordeling van de verschillen in transgene dieren, in de laesie studies, in neurodegeneratieve modellen of in veroudering studies^{21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28}. de tijd tussen opleiding en testen, bekend als de retentie-interval, kan worden gewijzigd om te kunnen beoordelen van om het even welk van deze wijzigingen op korte - en lange-termijn geheugen²⁶. Uiteindelijk, de ORT kan worden gebruikt als een instrument voor het bestuderen van neurologische, farmacologische en genetische veranderingen om te leren en geheugen, of deze hulpprogramma's kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de basis van leren en geheugen in de ORT.

Protocol

alle procedures hier uitgevoerd werden ingediend bij en goedgekeurd door de Animal Care Comité en -gebruik werden uitgevoerd volgens richtlijnen van de NIH.

1. selectie van objecten en experimentele Setup

1. Selecteer objecten die verschillen genoeg worden gemakkelijk gediscrimineerd door muizen, maar hebben een vergelijkbare mate van complexiteit (structuur, vorm, kleur patronen en helderheid, etc.) oog op het minimaliseren van eventuele geïnduceerde object voorkeur die de resultaten (Zie Ennaceur 2010 voor een uitgebreide beschrijving van het object keuze ⁷) kan invoerbereikpatroon.
   1. Test voor aangeboren voorkeur en discriminatie (zie stap 2 & 3).
   2. Gebruik-objecten die zijn muis-formaat of alleen iets groter ter bevordering van verkenning ( Figuur 1). Verklein geïnduceerde voorkeur en zorgen ervoor dat muizen kunnen klimmen op zowel objecten of noch object, al kunnen klimmen op een object kan toenemen belangstelling voor exploratie (tijd besteed gewoon zittend op een object wordt niet meegeteld voor exploratie tijd.)
   3. Hebben ten minste 2 exemplaren van elk object. Hebben echter om te beperken mogelijke signalen van de geur tijdens het testen, ten minste 3 van elk object, duplicaten voor training en één voor het testen.
   4. Gebruik objecten gemaakt van niet-breekbaar materiaal, als verlies van een object moeten beschadigen tijdens experimenten zou kunnen interfereren met de continuïteit van het testen, en kunnen leiden tot schade of letsel aan het dier.
   5. Grondig reinigen van de objecten vóór en tussen gebruik (70% vol/vol ethanol past).
2. Verlicht rond 20 lux te minimaliseren van de stress van felle verlichting, diffuse, laag-verlichting, met het midden van de doolhof gebruiken. Gebruik een temperatuur en vochtigheid vergelijkbaar met reguliere huisvesting. Als het muizen zijn uit een behuizing kamer verplaatst naar een andere kamer voor het experiment, muizen naar hun nieuwe kamer voor ten minste 1 h vóór gebruik elke dag acclimatiseren.
3. Handvat muizen ook voorafgaand aan de opleiding. Omdat de test is gebaseerd op de natuurlijke neiging van knaagdieren te onderzoeken van de nieuwheid, verminderen stress of angst van behandeling die kan interfereren met hun wens om de arena, en vervolgens de objecten te verkennen. In het ideale geval behandelen muizen 1 - 2 keer per dag gedurende ten minste 1 min., 1 tot 2 weken voor het testen van ^{15 , 29}.
4. Voor de belangrijkste arena, gebruik een vierkante kamer (ongeveer 40 cm x 40 cm x 40 cm) gemaakt van wit of zwart, niet-poreus kunststof, contrast tot de kleur van de muis. Alternatief, gebruik een ronde arena ed. specifiek, wanneer u angstig muizen die in de hoeken van een vierkant arena zitten kunnen, een ronde arena kan wenselijk zijn om verkennend gedrag ^{18 , 30}.
   1. Op trainingsdag, 2 identieke objecten te plaatsen op de diagonaal (d.w.z. één in de NW hoek en één in de SE hoek). Als objecten te licht zijn en kunnen worden verplaatst door de muis, zet de ze vast aan de vloer. Verwisselbaar montage stopverf werken goed.
   2. Voor het testen van dag, deze 3 ^rd kopie van elk object te gebruiken om één vertrouwd object en één roman object op hetzelfde diagonale als de trainingsdag ( Figuur 2).
   3. Tegenwicht vormen voor het gebruik van elke verzameling objecten zodat elk object ook als een vertrouwd object en als een nieuw object gebruikt wordt. Ook, tegenwicht bieden aan de locatie van het nieuwe object aan elk van de 4 hoeken van de arena. Noteer welke diagonal voor welk dier wordt gebruikt zodat de diagonaal gebruikt op de dag van de opleiding hetzelfde als die op de test dag, voor elke muis gebruikt is.
   4. Grondig reinigen van de apparatuur en de objecten die u wilt verwijderen van de geur signalen vóór en tussen gebruik (70% vol/vol ethanol past).
5. De camera direct overhead van het apparaat voor optimale weergave van exploratie. Alleen software gebruiken met neus-punt detectie voor nauwkeurige analyse. Als met behulp van software, een opname achtergrond met de objecten in plaats vóór het opstarten. Stel in de software, het gebied van exploratie zich ongeveer 2-3 cm rond het object.
6. Om de experimentator inmenging, opnemen van het proces en het later te noteren. Blind de scorer aan de experimentele omstandigheden. Als handmatig scoren tijdens het experiment, ervoor zorgen dat de experimentator meer dan 1 meter van de arena, en niet zichtbaar voor de muis.
   Opmerking: Elk gewenst moment de muis besteedt zittend op het object zonder actieve snorharen vegen of snuiven niet als exploratie tijd telt.
7. Definiëren exploratie als wanneer de muis ' s lawaai is wees naar het object en binnen 2-3 cm van het object, met actieve snorharen vegen of snuiven. Tellen niet elk moment zittend op het object zonder indicatie van actieve exploratie.

2. Noodzakelijke Pilot experimenten

1. testen voor geïnduceerde voorkeur
   1. voor gewenning, verwijder de muis uit haar kooi en plaats deze in het midden van de open arena. Laat de muis om te vrij verkennen voor 5 min.
   2. Op de dag van de opleiding (T1), 2 verschillende objecten in tegenovergestelde kwadranten van het apparaat, (dat wil zeggen NW en SE hoeken) plaatsen. Verwijder de muis uit haar kooi en plaats deze in het midden van de open arena. Laat 10 min. gratis exploratie
   3. Berekening van de discriminatie-index. Als er geen geïnduceerde voorkeur, moet de discriminatie-index nul of bijna nul te zijn. Alle objecten die voorkeur mag niet worden gebruikt voor ORT.
2. Testen voor discriminatie vermogen
   1. voor gewenning, muis verwijderen uit haar kooi en plaats deze in het midden van de open arena. Laat de muis om te vrij verkennen voor 5 min.
   2. Op trainingssessie (T1), 2 identieke objecten in tegenovergestelde kwadranten plaatsen. Plaats van de muis in het midden van de arena en laat de muis om te verkennen voor 10 min.
   3. Op testen sessie (T2), plaats één van het object dat wordt gebruikt tijdens de T1 en één roman object in tegenovergestelde kwadranten (dat wil zeggen NW en SE hoeken). 60 min na T1, plaatst u de muisaanwijzer in het midden van de arena en toestaan dat vrije exploratie 10 min.
   4. Berekening van de discriminatie-index. Met een tussenpoos van 60 min retentie, moet de discriminatie-index boven 0,25.

3. Experimentele Procedure

1. gewenning
   1. verwijderen van de muis uit haar kooi en plaats deze in het midden van de open, lege arena. Laat gratis exploratie van de arena voor 5 min. Zodra de kooi leeg is, op te slaan voor gebruik als een bedrijf kooi de volgende dag.
   2. Aan het einde van 5 minuten, verwijder de muis en plaats in de kooi van een bedrijf. De muis niet tot zijn oorspronkelijke kooi terugkeren, of dit van invloed kan zijn op het gedrag van de resterende muizen te beproeven.
   3. Grondig reinigen van het apparaat tussen muizen met behulp van 70% vol/vol ethanol.
      Opmerking: Tijdens gewenning, angst-achtig gedrag kan worden geëvalueerd door een berekening van de tijd doorgebracht in het midden (Zie Proet & Belzung 2003 ³¹). Dit is een nuttige metriek wanneer gezien de lengte van tijd voor T1. Hogere angst muizen voorschrijven een sessie 10 min te bereiken van het criterium van de minimale exploratie.
2. Training (T1)
   1. twee identieke objecten plaatsen in tegenovergestelde kwadranten van de arena (d.w.z., NE hoek en SW hoek).
   2. 24 h na gewenning, verwijder de muis uit haar kooi en plaats deze in het midden van de arena, van de 2 identieke objecten equidistante.
   3. De gratis verkenning van de toestaan voor een minimum van 5 min. Als een stam van muizen waarvan bekend is dat hebben lage motorische of exploratie activiteit, gebruikt (dat wil zeggen, de meeste muizen niet tot een minimum van 20 s verkenning van beide objecten door 5 min, zoals opgemerkt in de proefprojecten of de literatuur), het proces tot 10 min voor alle mic uit te breiden e in de cohort.
   4. Aan het eind van de proef, de muis verwijderen en plaatsen in de kooi van het bedrijf. Zodra de kooi leeg, op te slaan voor gebruik is Als de kooi van het bedrijf op dag testen.
   5. Grondig reinigen van de apparatuur en de objecten tussen muizen met behulp van 70% vol/vol ethanol.
3. Testen (T2)
   1. plaats van één object gebruikt tijdens T1 (dat wil zeggen, het vertrouwde object) en één roman object in tegenovergestelde kwadranten van de arena. Gebruik van dezelfde locaties zoals gebruikt tijdens T1 voor elke muis.
   2. Op de T1 T2 interval te kiezen, te muis verwijderen uit haar kooi en plaats deze in de center arena, gelijke afstand van de bekende object en het nieuwe object.
      Opmerking: Tussenpoos een retentie van 24 h, de meeste muizen kunnen niet te discrimineren tussen het vertrouwde en nieuwe object (meestal -0,2 < d2 < 0,2, in vergelijking met een positieve controle ³²). Als tests voor nootropic effecten, gebruikt u dit tijdstip sonde voor geheugenuitbreiding. Om de sonde voor geheugen tekorten, gebruiken een korter interval van de retentie van ergens tussen 20 min om 4 uur, afhankelijk van de soort muis.
   3. De gratis exploratie toestaan gedurende 10 minuten. Aan het eind van de proef, de muis verwijderen en plaatsen in het bedrijf kooi.
4. Voor zowel T1 en T2, score de eerste 5 min. Als de muis niet voldoet aan de minimale exploratie tijd van 20 s voor beide objecten, blijven scoren verleden 5 min tot totale exploratie meer dan 20 s.

4. Data-analyse

1. Uitsluitingscriteria
   1. tijdens beide opleiding (T1) en testen (T2), de tijd van de totale exploratie voor beide objecten voor elke sessie (e1 en e2) berekenen. De meeste muizen moeten het bereiken van een minimale verkenning totaal voor beide objecten van 20 s door 5 min.
   2. Verlengen T1 en T2 tijd om 10 min voor muizenstammen met lage exploratie doen niet voldoen aan deze minimale criterium door 5 min, zoals waargenomen tijdens de pilot testen.
   3. Gedrag score voor 5 min of na 5 min totdat ze de 20 s minimum criterium.
   4. Als muizen niet 20 s minimaal exploratie voor beide objecten voor T1 of T2 op 10 min tot, uitsluiten van analyse, als het niet worden bevestigd ze hebben genoeg tijd verkend om te leren/discrimineren.
2. Absolute vs relatieve analyse
   Opmerking: verschillende formules voor analyse en hun relatie tot elkaar kunnen worden gezien in tabel 1.
   1. Berekenen e1 als de tijd van de totale exploratie tijdens de training voor 2 identieke objecten, waar a1 en a2 de identieke objecten zijn.
      e1 = a1 + a2
   2. Berekenen e2 als de totale exploratie tijd tijdens het testen voor het vertrouwde object (a) en de roman bezwaar (b).
      e2 = a + b
   3. Berekenen d1 zo eenvoudig de tijd het verkennen van de roman object minus tijd bezig geweest met het verkennen van het vertrouwde object. De absolute discriminatie maatregel (d1) geen rekening wordt gehouden met verschillen in exploratie tijd tussen muizen of behandeling groepen, hoewel in bepaalde omstandigheden kan het een gevoeliger voor maatregel ².
      d1 = b-a
   4. Berekenen d2 als de tijd het verkennen van het nieuwe object minus de tijd bezig geweest met het verkennen van het vertrouwde object gedeeld door totale exploratie tijd. De meest gebruikte maat is een waarde van de relatieve discriminatie vaak aangeduid als de discriminatie-index (d2), die niet wordt beïnvloed door verschillen in exploratie tijd. Dit betekent dat alle waarden zal vallen tussen -1 en + 1.
      d2 = d1/e2
   5. Berekenen als alternatief, de erkenning of voorkeur index (d3) ³. Dit is de tijd het verkennen van het nieuwe object gedeeld door de totale tijd. Dit betekent dat alle waarden tussen 0 en 1 zal vallen. Het is vaak vermenigvuldigd met 100 en gebruikt als percentagewaarde.
      d3 = b/e2 * 100
3. Statistische analyse
   1. met behulp van de discriminatie van de gemiddelde waarden voor elke groep, bepalen de werking van het geheugen met one-way ANOVA. Voor verdere analyse, maken twee richtingen post hoc vergelijkingen met de behandelde vs staat van het voertuig en de positieve/negatieve controlegroepen.

Resultaten

Een algemene experimentele opstelling voor de ORT is afgebeeld in Figuur 2. Op gewenning dag (T0) muizen zijn geplaatst in de lege arena voor 5 min. vierentwintig uur later, de muizen zijn terug in de kamer met 2 identieke objecten geplaatst en kunnen vrij verkennen voor maximaal 10 min (T1). Op het testen van dag (T2), zijn de muizen weer geplaatst in de arena, maar met één vertrouwd object en één roman object en toegestaan om te verkennen voor maximaal 10 m...

Discussie

De ORT is een efficiënte en flexibele methode voor het bestuderen van leren en geheugen in muizen. Bij het opzetten van een experiment, is het belangrijk om te overwegen een aantal variabelen die de uitkomst kan beïnvloeden. Zoals besproken in de representatieve resultaten, zal de stam van de muis beïnvloeden zowel exploratie-tijd en retentie-interval. Een afname van de exploratie tijd kan scheeftrekken of masker resulteert in een absolute discriminatie analyse^2,3

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Open Field Box	Panlab/Harvard Apparatus	LE800SC	Beschikbaar in grijs, wit of zwart
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	Gedragsregistratiesysteem
EthoVisionXT 12	Noldus		Gedragsregistratiesysteem; vereist 3-puntstracking
Videocamera	Elke		De videocamera moet direct boven het apparaat worden gemonteerd
70% Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4	Voor het starten van de test en tussen de proeven, moet elk object zorgvuldig worden schoongemaakt. Ook de vloer en muren van het apparaat moeten worden schoongemaakt.