Wij presenteren een protocol voor het genereren van een chondrogeen afkomst van menselijk perifere bloed (PB) via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van een integratievrije methode, waaronder embryoïde lichaamsvorming (EB), uitbreiding van fibroblastische cellen en chondrogeeninductie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
In deze studie hebben we perifere bloedcellen (PBC's) als zaadcellen gebruikt om chondrocyten te produceren via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in een integratievrije methode. Na de vorming van embryoïde lichaam (EB) en fibroblastische celuitbreiding worden de iPSC's geïnduceerd voor chondrogeen differentiatie gedurende 21 dagen onder serumvrije en xeno-vrije condities. Na chondrocytische inductie worden de fenotypes van de cellen geëvalueerd door morfologische, immunohistochemische en biochemische analyses, evenals door het kwantitatieve real-time PCR onderzoek van chondrogeen differentiatie markers. De chondrogeenpellets tonen positieve alcianblauw en toluidine blauwkleuring. De immunohistochemie van collageen II en X-kleuring is ook positief. Het gesulfateerde glycosaminoglycan (sGAG) gehalte en de chondrogeen differentiatie merkers COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 en AGGRECAN worden significant in de chronisch gereguleerdRogenic pellets vergeleken met hiPSCs en fibroblastische cellen. Deze resultaten suggereren dat PBC's kunnen worden gebruikt als zaadcellen om iPSC's te genereren voor kraakbeenherstel, dat is patiëntspecifiek en kosteneffectief.
Inleiding
Kraakbeenweefsel heeft een zeer slechte capaciteit voor zelfherstel en regeneratie. Diverse chirurgische interventies en biologische behandelingen worden gebruikt om kraakbeen- en gewrichtsfunctie te herstellen, met onbevredigende resultaten. De recente ontwikkeling van stamceltechnologie kan het hele kraakbeenherstelveld 1 veranderen . Verschillende stamcellen zijn als zaadcellen bestudeerd, maar door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) lijken de meest veelbelovende keuzes te zijn, omdat ze vele soorten patiëntenpecifieke cellen kunnen leveren zonder afwijzingsreacties te veroorzaken 2 . Bovendien....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol voor het genereren van hiPSC's van PBC's is te vinden in onze vorige studie 5 . De studie is goedgekeurd door de Institutional Review Board van onze instelling.
1. Embryoid Body (EB) Formation
- Maak 50 ml hiPSC-medium: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 15% knock-out serumvervanging (KSR), 5% foetaal bees serum (FBS), 1 x niet-essentiële aminozuren, 55 μM 2-mercaptoethanol, 2 mM L -glutamine, en 8 ng / ml basis fibroblast groeifactor (bFGF).
- Maak 50 ml EB formatiemedium: DMEM aangevuld met 15% KSR, 5% FBS, 1x nonessential aminozuren, 55 μM 2-m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Chondrogen Differentiatie van hiPSCs:
EB formatiemedium en basaal cultuurmedium werden gebruikt om de hiPSC's te differentiëren in de mesenchymale afstamming. Een multi-step cultuur methode werd gebruikt ( Figuur 1 ). Ten eerste werden de hiPSC's spontaan gedifferentieerd via EB-vorming gedurende 10 dagen (D10; Figuur 2A ). Ten tweede kwamen cellen nog 10 dagen u.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier leveren we een protocol om chondrocyten van PBC's te genereren via iPSCs. Omdat PBC's meer voorkomend zijn en veel gebruikt worden op het klinisch gebied, worden ze gepresenteerd als een mogelijk alternatief voor herprogrammering. In deze studie werden episomale vectoren (EV) gebruikt om PBC's in iPSC's te herprogrammeren, volgens de methode die door Zhang et al werd vastgesteld. 11 . Deze integratievrije aanpak houdt in dat er geen virusgeassocieerde genotoxiciteit .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Xiaobin Zhang bedanken voor zijn plasmide. We bedanken ook Shaorong Gao en Qianfei Wang voor hun vriendelijke hulp tijdens het experiment. Deze studie wordt ondersteund door de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (nr.81101346, 81271963, 81100331), het Beijing 215 hoogwaardige talentproject (nr.2014-3-025) en het Beijing Chao-Yang Hospital Fund (nr. . CYXX-2017-01) en de Youth Innovation Promotion Association van de Chinese Academie voor Wetenschappen (YL).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium gebruikt voor hiPSC-cultuur en EB-vormingsmedium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | Een meer gedefinieerd, FBS-vrij mediumsupplement gebruikt voor hiPSC-cultuur en EB-vormingsmedium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Gebruikt voor hiPSC-cultuur en EB-vormingsmedium, biedt uitstekende waarde voor celcultuur |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Gebruikt als groeisupplement in alle celcultuurmedium, om celgroei en levensvatbaarheid te verhogen |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | Een aminozuur dat vereist is voor celcultuur |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | Een cytokine dat wordt gebruikt voor het in stand houden van de pluripotentie en zelfvernieuwing van hiPSC's |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Gebruikt voor hiPSC-dissociatie voor subcultuur |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium gebruikt voor MSC-cultuurmedium |
| 0.1% gelatine | Millipore | ES-006-B | Gebruikt voor celhechting op de schalen |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Gebruikt voor celdissociatie |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Een uitgebalanceerde zoutoplossing die wordt gebruikt voor celwassen of bereidingen van reagentia |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Gebruikt als groeisupplement in alle celcultuurmedium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution. Gebruikt voor chondrogene differentiatie. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Bekend als vitamine C. Het helpt bij actieve groei en heeft een antioxiderende eigenschap. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Toegevoegd aan celcultuurmedium als energiebron naast glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | Een cytokine dat celproliferatie, groei en chondrogene differentiatie reguleert. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | Dit antilichaam reageert met Type II-collagen, dat specifiek is voor kraakbeenweefsel. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | Dit antilichaam reageert met Type X-collageen, dat een product is van hypertrofische chondrocyten. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | Voor montage en langdurige opslag van dia's |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Gebruikt voor detectie van proteoglycanen. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Gebruikt voor detectie van glucosaminoglycanen. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Gebruikt om chondrogene pellets te verteren. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Gebruikt om glycosaminoglycanen te kwantificeren |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Gebruikt om de standaardcurve voor sGAG-gehaltemeting te trekken. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Gebruikt om het DNA-gehalte te bepalen |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Gebruikt voor RNA-isolatie uit cellen |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Gebruikt om RNA om te zetten in cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Gebruikt voor real-time PCR |
Referenties
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells.
The corresponding author was updated from:
Yueying Li
yueyinglee2010@hotmail.com
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu
waterkins@163.com
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University
