Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

Samenvatting

Wij presenteren een protocol voor het genereren van een chondrogeen afkomst van menselijk perifere bloed (PB) via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van een integratievrije methode, waaronder embryoïde lichaamsvorming (EB), uitbreiding van fibroblastische cellen en chondrogeeninductie.

Samenvatting

In deze studie hebben we perifere bloedcellen (PBC's) als zaadcellen gebruikt om chondrocyten te produceren via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in een integratievrije methode. Na de vorming van embryoïde lichaam (EB) en fibroblastische celuitbreiding worden de iPSC's geïnduceerd voor chondrogeen differentiatie gedurende 21 dagen onder serumvrije en xeno-vrije condities. Na chondrocytische inductie worden de fenotypes van de cellen geëvalueerd door morfologische, immunohistochemische en biochemische analyses, evenals door het kwantitatieve real-time PCR onderzoek van chondrogeen differentiatie markers. De chondrogeenpellets tonen positieve alcianblauw en toluidine blauwkleuring. De immunohistochemie van collageen II en X-kleuring is ook positief. Het gesulfateerde glycosaminoglycan (sGAG) gehalte en de chondrogeen differentiatie merkers COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 en AGGRECAN worden significant in de chronisch gereguleerdRogenic pellets vergeleken met hiPSCs en fibroblastische cellen. Deze resultaten suggereren dat PBC's kunnen worden gebruikt als zaadcellen om iPSC's te genereren voor kraakbeenherstel, dat is patiëntspecifiek en kosteneffectief.

Inleiding

Kraakbeenweefsel heeft een zeer slechte capaciteit voor zelfherstel en regeneratie. Diverse chirurgische interventies en biologische behandelingen worden gebruikt om kraakbeen- en gewrichtsfunctie te herstellen, met onbevredigende resultaten. De recente ontwikkeling van stamceltechnologie kan het hele kraakbeenherstelveld ^{1 veranderen} . Verschillende stamcellen zijn als zaadcellen bestudeerd, maar door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) lijken de meest veelbelovende keuzes te zijn, omdat ze vele soorten patiëntenpecifieke cellen kunnen leveren zonder afwijzingsreacties te veroorzaken ² . Bovendien kunnen ze de beperkte proliferatieve aard van volwassen cellen overwinnen en hun zelfvernieuwende en pluripotente vaardigheden handhaven. Bovendien kan gen targeting gebruikt worden om het genotype te veranderen om specifieke soorten chondrocyten te verkrijgen.

Fibroblasten zijn veel gebruikt om iPSCs te genereren, omdat hun herprogrammeringspotenties ook goed bestudeerd zijn.Er zijn echter nog enkele beperkingen die moeten worden overwonnen, zoals de pijnlijke biopsie van patiënten en de noodzaak voor de in vitro- uitbreiding van de fibroblasten, die kan leiden tot genmutaties ³ . Onlangs bleken PBC's voordelig te zijn voor herprogrammering ⁴ ; Bovendien werden ze veelal gebruikt en overvloedig opgeslagen. Het is mogelijk dat ze de studiefocus van de huid kunnen doorsturen. Naar ons beste weten, zijn er maar weinig rapporten over PBC-herprogrammering gevolgd door differentiatie in chondrocyten.

In de huidige studie gebruiken we PBC's als een alternatieve bron door ze in iPSCs te programmeren en vervolgens de iPSC's te differentiëren in de chondrogene lijn door middel van een pelletcultuur systeem om chondrocytevorming na te bootsen.

Protocol

Het protocol voor het genereren van hiPSC's van PBC's is te vinden in onze vorige studie ⁵ . De studie is goedgekeurd door de Institutional Review Board van onze instelling.

1. Embryoid Body (EB) Formation

1. Maak 50 ml hiPSC-medium: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 15% knock-out serumvervanging (KSR), 5% foetaal bees serum (FBS), 1 x niet-essentiële aminozuren, 55 μM 2-mercaptoethanol, 2 mM L -glutamine, en 8 ng / ml basis fibroblast groeifactor (bFGF).
2. Maak 50 ml EB formatiemedium: DMEM aangevuld met 15% KSR, 5% FBS, 1x nonessential aminozuren, 55 μM 2-mercaptoethanol en 2 mM L-glutamine.
3. Maak 50 ml basaal cultuurmedium: DMEM aangevuld met 20% FBS, 1 x niet-essentiële aminozuren, 55 μM 2-mercaptoethanol en 2 mM L-glutamine.
4. Bereid 10 ml dispasoplossing, 1 mg / ml in knockout DMEM op.
5. CultuRe hiPSCs op 60 mm weefselkweekschotels met voedercellen ( dwz een monolaag van bestraalde muis embryonale fibroblastcellen). Wanneer de cellen 80-90% samenvloeien, verwijder de cellen met dispase en verplaats de hiPSCs 1: 3 om de 4-5 dagen. Plaats de cellen in een 37 ° C en 5% _CO2 incubator.
6. Dissect de ongedifferentieerde hiPSC kolonies in kleinere stukken (ongeveer 50-100 μm in diameter) met een vuurgetrokken glazen naald wanneer de iPSCs 80-90% samenvloeien. Gebruik in het algemeen hiPSC kolonies in een 60 mm schotel om EB's te genereren in een 100 mm Petri schotel.
   1. Cultuur minder dan 100 kleine kolonies in een 100 mm non-adherent Petri schotel met 10 ml EB formatiemedium. Plaats de afwas in een 37 ° C en 5% CO _2- broeikas.
7. Vervang ongeveer 25% van het initiële medium met een gelijke hoeveelheid van het basale kweekmedium om de 2 dagen. Kantel de schotel om de EB te laten vallen. Verwijder voorzichtig 3 mlVan het bovenste medium en voeg 4 ml vers basaal cultuurmedium toe. Verstoor de EB's niet.
   OPMERKING: De EB's worden morfologisch gekenmerkt door de kolonies, waarbij ze een ronde verschijning hebben met gladde randen onder de microscoop.
8. Na 10 dagen kweek in de non-adherent Petri-schotel, bedek een nieuwe 100 mm weefselkweekschotel met 4 ml 0,1% gelatine gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor gebruik.
9. Breng het medium plus EB's van een 100 mm non-adherent Petri-schotel over op een 15 ml kegelbuis. Laat het EB-sediment voor 4-5 min. Aspirateer de supernatant zorgvuldig en laat minder dan 0,5 ml medium plus EB's
10. Zaai minder dan 100 EB's op een 100 mm gelatine-gecoate weefselkweekschotel met 10 ml basaal kweekmedium. Plaats de afwas in een 37 ° C en 5% CO _2- broeikas.

2. Cell Pellet Formation en Chondrocyten Differentiatie

1. Maak 10 ml 0,25% trypsine / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Maak 80 ml basAl cultuurmedium: DMEM aangevuld met 20% FBS, 1x nonessential aminozuren, 55 uM 2-mercaptoethanol en 2 mM L-glutamine.
2. Maak 10 ml chondrogeen differentiatie medium: DMEM (hoge glucose) aangevuld met 10% insuline-transferrine-selenium oplossing (ITS), 0,1 μM dexamethason, 1 mM ascorbinezuur, 1% natriumpyruvaat en 10 ng / ml transformerende groeifactor- Bèta 1 (TGF-β1).
3. Vernieuw het medium met 10 ml basaal kweekmedium na 48 uur. Vervolgens vernieuw het medium om de drie dagen met 10 ml basaal cultuurmedium.
   OPMERKING: Na 10 dagen in de cultuur zouden fibroblastische celuitgroeiingen uit de EB's moeten zijn uitgebreid.
   1. Bedek de 100 mm schoteltjes met 4 ml 0,1% gelatine gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor gebruik. Gooi de celsupernatant weg en doe de cellen eens met Dulbecco's Fosfaatbufferde Saline (DPBS).
   2. Digest de cellen met 3 ml 0,25% trypsine / EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten en neutraliseer met 4 mL van basaal cultuurmedium.
4. Dissocieer de cellen in enkele cellen door de 5-10 keer op en neer te pipetteren en ze door een 70 μm nylon gaas te passeren. Centrifugeer de cel suspensie bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zet de cellen opnieuw op een nieuwe 100 mm gelatine-gecoate weefselkweekschotel met 10 ml basaal cultuurmedium.
5. Vernieuw het medium met 10 ml basaal kweekmedium na 48 uur. Vervolgens vernieuw het medium om de drie dagen met 10 ml basaal cultuurmedium.
   OPMERKING: De cellen verwerven een homogene, fibroblast-achtige morfologie.
6. Wanneer ~ 90-100% samenvloeiing bereikt wordt ( dwz ongeveer 5-7 dagen), oogst de cellen gedurende 5 minuten met 3 ml 0,25% trypsine / EDTA bij 37 ° C. Neutraliseer met 4 ml basaal cultuurmedium. Dissocieer de cellen in enkele cellen door 5 keer op en neer te pipetteren. Gebruik een hemocytometer om het celnummer te tellen.
   1. Plaats 3 x 10 ⁵ cellen in een 15 ml polypropyleenbuis. Centrifuge bij 200 xgGedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). De cellen opnieuw opschorten in 1 ml chondrogeen differentiatie medium.
7. Hercentrifugeer de cellen bij 300 xg gedurende 3 minuten en houd de cellen in kleine pelletvorm. Zet de buis gedurende 21 dagen in de 37 ° C en 5% CO ₂ incubator. Schroef het deksel niet stevig vast en laat het gas uitwisselen.
8. Vervang 3/4 van het kweekmedium om de drie dagen met vers chondrogeen differentiatie medium.
   OPMERKING: Na 21 dagen in de cultuur zouden hiPSC-chondrogeenpellets (hiPSC-Chon) moeten zijn gevormd. Menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) worden als positieve controle verzameld en gekweekt in het chondrogeen differentiatiemedium gedurende 21 dagen om chondrogeenpellets (hMSC-Chon) te vormen.

3. Analyse van Chondrogeen Differentiatie

1. Bereid 10 ml 10% neutrale gebufferde formaline op.
2. Bereid 50 ml 0,1% alcianblaag reagens en 50 ml 1% toluidine blauw reagens op.
3. PrEpare 1 ml van de primaire antilichamen: konijn polyclonale antilichamen tegen collageen II (1:50) of monoklonale monoklonale antilichamen tegen collageen X (1:50). Bereid ook anti-konijnen of muis secundaire antilichamen op.
4. Maak 1 ml papainoplossing: 10 U / ml in PBS met 0,1 M natriumacetaat, 2,4 mM EDTA en 5 mM L-cysteïne.
5. Maak 100 ml dimethylmethyleenblauw (DMMB) kleurstofoplossing: 100 μl 16 mg / L 1,9-dimethylmethylenblauw, 40 mM glycine, 40 mM NaCl en 9,5 mM HCI; PH 3,0.
6. Bepaal chondrogene differentiatie door alcia blue en toluidine blauwe vlekken van de pelletsecties.
   1. Fixeer een hiPSC-Chon pellet of hMSC-Chon pellet in 1 ml 10% neutrale gebufferde formaline gedurende 24 uur.
   2. Breng de pellet 1 ml 70% ethanol in _H2O Dehydrateer het pellet met 1 ml van een gegradeerde ethanolreeks (dat wil zeggen, 25, 50, 75, 90, 95, 100 en 100%, 3 min ieder).
   3. Verduidelijkt de pellet in 1 ml 100% xyleen drie keer. infiltratE de pellet met paraffine gedurende 1 uur in een 65 ° C oven. Breng de pellet in de paraffineblokken met een 7 x 7 x 5 mm ³ basisvorm na de routine histologische procedures ⁶ .
   4. Maak aangrenzende delen door microtome met een dikte van ongeveer 4 μm ⁷ . Houd de secties op glazen glijbanen vast.
   5. Droog de glijbanen gedurende 2 uur bij 60 ° C in een oven. Deparaffinize de secties in drie cycli (3 minuten elk) met 100% xyleen.
   6. Gebruik een afnemende alcoholreeks voor rehydratie ( dwz 100, 100, 95, 95, 70, 50 en 25% in H ₂ O, 3 min elk) en voer dan 5 minuten spoelen met gedeïoniseerd water.
   7. Vlek de secties met 0,1% alcianblauw reagens of 1% toluidine blauwkleuren gedurende 4-5 uur en spoel ze vervolgens met gedestilleerd water.
   8. Dehydrateer met een gegradeerde ethanol serie ( dwz 25, 50, 75, 90, 95, 100 en 100%, 3 minuten elk) gevolgd door drie opeenvolgende stEps van verduidelijking in 100% xyleen. Monteer de dia's en visualiseer ze onder een microscoop.
7. Doe immunohistochemie.
   OPMERKING: Extra pelletsecties worden verder beoordeeld door immunohistochemie.
   1. Na de deparaffinisatie en rehydratie, breng de glijbanen in 1 mM EDTA, pH 8,0 (waterdicht in water gekookt door autoclaaf). Laat ze 8 minuten bij een onderkooktemperatuur zitten en laat de dia's bij RT afkoelen.
   2. Spoel de glijbanen 3 keer met gedeïoniseerd water af. Incubeer de secties 3% H _{2O 2-oplossing} in methanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min om endogene peroxidase activiteit te blokkeren.
   3. Spoel de glijbanen met gedeïoniseerd water en laat ze 5 minuten in DPBS dompelen. Voeg 50-100 μl van geschikt verdund (1:50) primair antilichaam toe aan de afdelingen op de glijbanen en incubeer deze vervolgens gedurende een uur in een bevochtigde kamer bij RT.
   4. Was de dia's 3 keer (5 min elk) met DPBS. Incubeer de saMples met de bijbehorende secundaire antilichamen ( dwz anti-konijn of muis) gedurende 15 min bij RT.
   5. Was de dia's 3 keer (voor 5 minuten elk) met DPBS. Voer DAB detectie onder een microscoop uit.
   6. Was de dia's met DPBS 3 keer (2 min elk). Contrasteer de celkernen door de dia's in hematoxyline gedurende 1-2 minuten te dompelen. Dehydreren met een gegradeerde ethanol serie (25, 50, 75, 90, 95, 100 en 100%; 3 minuten elk) gevolgd door drie opeenvolgende stappen van verduidelijking met xyleen. Tenslotte, monteer de dia's en visualiseer ze onder de microscoop.
8. Ontdek sGAG-inhoud.
   1. Digg chondrogeenpellets in papainoplossing bij 60 ° C gedurende 2 uur.
   2. Bepaal het DNA-gehalte met behulp van de dsDNA assay kit en fluorometer systeem. Meet de sGAG-inhoud door het te mengen met DMMB-kleurstofoplossing bij het meten van absorptie bij 525 nm ⁸ .
   3. Bereken de concentratie van sGAG tegen een standaardkromme vanHaai chondroitine sulfate.
9. Voer de real-time PCR analyse van de chondrogeen differentiatie markers in hiPSC-Chon pellets uit.
   1. Oogst 3-4 van dezelfde chondrogeenpellets door 500 μL ijskoud extractie reagens toe te voegen aan één buis. Vortex grondig. Incubeer het monster gedurende 5 minuten bij RT.
   2. Voeg 0,1 ml chloroform toe. Vortex het monster gedurende 15 s en incubeer het bij 3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 xg en 4 ° C. Breng de bovenste waterfase (ongeveer 250 μl) over in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
   3. Voeg 25 μl natriumacetaat en 1 μl glycogeen toe aan het monster. Precipiteer het RNA door hem te mengen met 250 μl isopropylalcohol. Meng grondig. Incubeer het monster bij RT gedurende 10 minuten.
   4. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 xg en 4 ° C. Verwijder de supernatant volledig. Was de RNA-pellet tweemaal met 500 μl 75% ethanol.
   5. Centrifuge gedurende 5 minutenBij 7.500 xg en 4 ° C. Verwijder alle resterende ethanol en laat de RNA-pellet 5-10 minuten drogen. Los het RNA op in 10 μL nuclease-vrij water.
   6. Zet het RNA om in cDNA met behulp van een reverse transcriptase systeem. Onderwerp de cDNA-monsters in real-time PCR met behulp van qPCR kit master mix (2x) en een real-time PCR systeem ⁹ .
      OPMERKING: De primer sequenties zijn:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H ß-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H -ACTIN- R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Resultaten

Chondrogen Differentiatie van hiPSCs:

EB formatiemedium en basaal cultuurmedium werden gebruikt om de hiPSC's te differentiëren in de mesenchymale afstamming. Een multi-step cultuur methode werd gebruikt ( Figuur 1 ). Ten eerste werden de hiPSC's spontaan gedifferentieerd via EB-vorming gedurende 10 dagen (D10; Figuur 2A ). Ten tweede kwamen cellen nog 10 dagen u...

Discussie

Hier leveren we een protocol om chondrocyten van PBC's te genereren via iPSCs. Omdat PBC's meer voorkomend zijn en veel gebruikt worden op het klinisch gebied, worden ze gepresenteerd als een mogelijk alternatief voor herprogrammering. In deze studie werden episomale vectoren (EV) gebruikt om PBC's in iPSC's te herprogrammeren, volgens de methode die door Zhang et al werd vastgesteld. ¹¹ . Deze integratievrije aanpak houdt in dat er geen virusgeassocieerde genotoxiciteit ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	Basal medium gebruikt voor hiPSC-cultuur en EB-vormingsmedium
Knockout Serum Replacement (KSR)	Invitrogen	10828028	Een meer gedefinieerd, FBS-vrij mediumsupplement gebruikt voor hiPSC-cultuur en EB-vormingsmedium
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	sh30070.03	Gebruikt voor hiPSC-cultuur en EB-vormingsmedium, biedt uitstekende waarde voor celcultuur
Nonessential amino acids	Chemicon	TMS-001-C	Gebruikt als groeisupplement in alle celcultuurmedium, om celgroei en levensvatbaarheid te verhogen
L-glutamine	Invitrogen	TMS-002-C	Een aminozuur dat vereist is voor celcultuur
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	100-18B	Een cytokine dat wordt gebruikt voor het in stand houden van de pluripotentie en zelfvernieuwing van hiPSC's
Dispase	Invitrogen	17105041	Gebruikt voor hiPSC-dissociatie voor subcultuur
DMEM	Gibco	C11960	Basal medium gebruikt voor MSC-cultuurmedium
0.1% gelatine	Millipore	ES-006-B	Gebruikt voor celhechting op de schalen
0.25% trypsin/EDTA	Gibco	25200072	Gebruikt voor celdissociatie
DPBS	Gibco	14190250	Een uitgebalanceerde zoutoplossing die wordt gebruikt voor celwassen of bereidingen van reagentia
2-mercaptoethanol	invitrogen	21985023	Gebruikt als groeisupplement in alle celcultuurmedium.
ITS	invitrogen	41400045	Insulin, Transferrin, Selenium Solution. Gebruikt voor chondrogene differentiatie.
Ascorbic acid	Sigma	4403	Bekend als vitamine C. Het helpt bij actieve groei en heeft een antioxiderende eigenschap.
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	Toegevoegd aan celcultuurmedium als energiebron naast glucose.
Transforming growth factor-beta 1	Peprotech	AF-100-21C	Een cytokine dat celproliferatie, groei en chondrogene differentiatie reguleert.
Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II	Abcam	ab34712	Dit antilichaam reageert met Type II-collagen, dat specifiek is voor kraakbeenweefsel.
Mouse monoclonal antibodies to Collagen X	Abcam	ab49945	Dit antilichaam reageert met Type X-collageen, dat een product is van hypertrofische chondrocyten.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Voor montage en langdurige opslag van dia's
Toluidine blue	Sigma	89640	Gebruikt voor detectie van proteoglycanen.
Alcian blue	Amresco	#0298	Gebruikt voor detectie van glucosaminoglycanen.
Papain	Sigma	P4762-25MG	Gebruikt om chondrogene pellets te verteren.
Dimethylmethylene blue	Sigma	341088-1G	Gebruikt om glycosaminoglycanen te kwantificeren
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-250MG	Gebruikt om de standaardcurve voor sGAG-gehaltemeting te trekken.
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32851 (100)	Gebruikt om het DNA-gehalte te bepalen
TRIzol	Invitrogen	15596018	Gebruikt voor RNA-isolatie uit cellen
Reverse Transcriptase System	Promega	A3500	Gebruikt om RNA om te zetten in cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix	Kapa	KK4601	Gebruikt voor real-time PCR