Methodenartikel

Systemische levering van MicroRNA met behulp van Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 voor de behandeling van neuromusculaire ziekten bij knaagdieren

DOI:

10.3791/55724

⸱

10 augustus 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurogenetics Branch, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Section on Nervous System Development and Plasticity, The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child and Human Development, National Institutes of Health, 3Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University, 4Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de levering van microRNA met behulp van een recombinant adeno-associated virus serotype 9 in een muismodel van een neuromusculaire ziekte. Eenmalige perifere toediening in muizen geleid tot aanhoudende miRNA overexpressie in spieren en motorische neuronen, bieden een kans om studie miRNA functie en therapeutisch potentieel in vivo.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA-interferentie via de endogene miRNA pathway regelt genexpressie door het beheersen van de eiwitsynthese via post-transcriptional gene zwijgen. In de afgelopen jaren is miRNA-gemedieerde genregulatie potentiële voor behandeling van neurologische aandoeningen veroorzaakt door een giftige winst van functie mechanisme gebleken. Efficiënte levering te onderzoeken weefsels heeft echter beperkte dat de toepassing ervan. Hier hebben we een transgeen muismodel gebruikt voor spinale en bulbaire musculaire atrofie (SBMA), een neuromusculaire ziekte veroorzaakt door uitbreiding van de polyglutamine in de androgeen receptor (AR), voor het testen van gene monddood maken door een nieuw geïdentificeerde AR-targeting miRNA, miR-298. We overexpressie miR-298 met behulp van een vector van de serotype 9 recombinante adeno-associated virus (rAAV) ter vergemakkelijking van de transductie van niet-delende cellen. Een enkele staart-veneuze injectie in SBMA muizen geïnduceerde langdurige en wijdverbreide overexpressie van miR-298 in skeletspieren en motorische neuronen en resulteerde in een verbetering van de neuromusculaire fenotype bij de muizen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNAs zijn niet-coderende RNAs, 21-23 nucleotiden in lengte, die een belangrijke rol bij de regulering van de expressie van genen en controle van diverse cellulaire en metabole paden spelen. 1 genexpressie wordt voornamelijk geregeld door inducerende zwijgen of mRNA aantasting van de post-transcriptional gen. 2 MiRNAs zijn meestal complementair aan de 3' niet-vertaalde regio (UTR) voor codering van genen, hoewel binden aan de 5' UTR en codering van de regio's van de doelstelling van die mRNA is ook beschreven. 3

Aangezien het huidige begrip van de rol van miRNA in de pathogenese van ziekten bij de mens groeit, wordt farmacologische modulatie van individuele miRNAs of miRNA gezinnen steeds meer een haalbare therapeutische optie. Vergeleken met andere remming RNA strategiën, miRNAs hebben veel voordelen: miRNAs minder toxisch en minder immunogeen en vanwege het kleine formaat gemakkelijk in cellen kunnen worden afgeleverd. 4 , 5 , 6 MiRNAs hebben meestal veel doelen binnen netwerken voor mobiele telefonie, daarom potentiële af-target effecten en de bezorgdheid over de veiligheid moet worden rekening gehouden, samen met efficiënte levering te onderzoeken weefsels.

Neuromusculaire ziekten zijn verworven of voorwaarden die spier en motorische neuronen beïnvloeden zijn overgenomen. Het richten van drugs naar de skeletspieren is een opkomende gebied van onderzoek, waar de grootste uitdaging is om wijdverspreide distributie binnen het therapeutisch venster. 7 motorische neuronen zijn moeilijker te richten, vooral omdat de drug toegang is uitgesloten door de bloed-hersenbarrière.

Cel cultuur en muis modellen van spinale en bulbaire musculaire atrofie (SBMA) werden gebruikt in deze studie. SBMA is een neuromusculaire ziekte veroorzaakt door een giftige winst van functie-mechanisme, waarin zowel de spier en de motorische neuronen worden beïnvloed. 8 , 9 SBMA (Kennedy's ziekte; OMIM #313200) is een X-gebonden ziekte, gekenmerkt door spierzwakte en atrofie, veroorzaakt door CAG herhalen expansie in het AR-gen, dat codeert voor een uitgebreide polyglutamine tract in het AR -eiwit. 10 geen ziekte-aanpassen-behandeling is momenteel beschikbaar voor deze aandoening. De transgene muismodel gebruikt in deze studie recapituleert de kenmerken van de ziekte, met inbegrip van het geslacht specificiteit, motor-neuron pathologie en progressieve spieratrofie. 11

In deze studie, onze inspanningen gericht op het identificeren van een miRNA die rechtstreeks ontstekingsuitlokkende uitdrukking van de mutant AR transgenic en over het ontwerpen van een veilige en efficiënte wijze van levering van de miRNA aan het ruggenmerg en skeletspieren van onze muismodel van ziekte.

Hier we geïdentificeerd een relatief genfunctieonderzoek miRNA, miRNA-298 (toetreding nummer MIMAT0004901),12 om direct mutant AR expressie in SBMA modellen. Met het oog op levering van miR-298 te onderzoeken weefsels, hebben we een virale strategie, met recombinant adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) gebruikt. rAAV9 is geschikt voor de overschrijding van de bloed-hersenbarrière en bemiddelen op lange termijn genexpressie in niet-delende cellen, met inbegrip van neuronen. 13 eenmalige systemische toediening van AAV9-miR-298 geleid tot aanhoudende uitdrukking van de miRNA, efficiënte transductie van spieren en motorische neuronen, down-regulatie van AR expressie, en verbetering van het fenotype van de ziekte in SBMA muizen. 14 deze methode kan worden gebruikt om miRNA of antagomirs overexpressie in vivo.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (8e ed., National Academies Press, herzien 2011), en door het NINDS Animal Care Comité zijn goedgekeurd.

1. AAV9-miRNA ontwerp strategie en miRNA selectie

  1. MiRWalk voorspellende database gebruiken om te selecteren van de kandidaat-miRNAs die met het mRNA 3' UTR regio van het target-gen communiceren. 15
    Opmerking: Minimale zaad lengte van miRNA reeks tot ten minste 7 nucleotiden beperken. Selecteer andere programma's van gevestigde miRNA, voorspelling (miRanda, miRDB, Targetscan) voor vergelijkende analyse. Op basis van deze selectiecriteria, hier, werden miR-185, miR-298, miR-873 en miR-877 geselecteerd voor verdere evaluatie.
  2. De volgorde van de geselecteerde miRNA ophalen miRBase (http://www.mirbase.org/).
  3. Kloon de pri-mir (60-70 nts) en haar 250-300 nts flankerende genomic sequentie op beide partijen, of een mock sequentie, in de juiste AAV cis vector.
    Opmerking: De begeleidende volgorde is vereist voor correcte pri-mir expressie en volwassen microRNA verwerking. Selecteer een dual-promotor rAAV cis vector met een cassette van de expressie bestaat bijvoorbeeld uit een rek van de menselijke factor-1 alpha (EIF1α) promotor gevolgd door de geselecteerde miRNA of mock reeks en de promotor van de menselijke cytomegalovirus (CMV) gevolgd door de cDNA codering de fluorescerende GFP-tag. De promotor van de EIFα werd gekozen omdat stabiel en homogeen expressie, met minimale risico's monddood maken dit. De specifieke of voorwaardelijke initiatiefnemers weefsel kunnen worden gebruikt, afhankelijk van specifieke toepassingen.
  4. Voorbereiden, zuiveren en titreer de AAV, volgende gepubliceerde protocollen. 16
    Opmerking: Hier, klonen van de pri-mir in de AAV vector en virale productie werden uitgevoerd door een externe fabrikant.

2. de staart veneuze injectie van AAV-miRNA plasmide

Opmerking: Deze stap moet worden aangepast volgens het target-gen en de leeftijd en het gewicht van de muizen. Gebruik de richtlijnen institutionele en Animal Care en gebruik Comité (IACUC) om te bepalen van de dosisinterval, het volume en de beste wijze van toediening op basis van de leeftijd en het gewicht van de muizen. GFP fluorescentie signaal en miRNA expressie niveaus in onderzoeken weefsels wordt verwacht dat de piek vanaf 2 weken na de injectie. Het volgende protocol verwijst naar de mannelijke muizen in de vroege volwassenheid. AAV moet worden behandeld als een biohazard onder Biosafety Level 1 richtsnoeren.

  1. Verdeel AAV-miRNA plasmide voorraad in 100-200 µL aliquots met een virale lading van 1010-10-11 virale genoom per mL (vg/mL) met behulp van steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Laboratorium biohazard persoonlijke beschermingsmiddelen moet worden gebruikt om de AAV-oplossing.
    Opmerking: Zodra een aliquoot gedeelte is ontdooid het kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal twee weken. Virale voorraad kan worden opgeslagen in de vriezer-80 ° C.
  2. Het beperken van de muis in de handel verkrijgbare fixeren zoals plastic of taps toelopende plastic folie buis van de juiste maat.
  3. Reinig het oppervlak van de staart met 70% alcohol doekjes.
  4. Een warme pad (28-30 ° C) te houden onder de staart toe vasodilatatie voor 30 s. als alternatief, warm de dieren met behulp van een red warmte lamp (op een afstand van 2-3 voeten) of door dompelen de staart in warm water.
  5. Met ingang van het distale deel van de staart, de naald (27-30 G) geladen met de virale aliquot invoegen, schuine rand, 15° van de staart, in de ader. Vóór injectie, zorgen dat de naald op de juiste manier is geplaatst.
    1. Als weerstand tijdens de injectie wordt gevoeld of zwelling onder de huid verschijnt, beëindigt de procedure. Verwijder de naald en de naald boven de vorige injectieplaats opnieuw in te voegen.
      Opmerking: Als alternatief, dit kan worden bereikt door voorzichtig aspirating de naald en observeren van bloed. Harde aspiratie kan het instorten van de ader van de staart. Als de ader blanches tijdens injectie, is de naald correct geplaatst.
  6. Na de injectie is voltooid, wacht een paar seconden voordat het verhogen van de naald.
  7. De injectieplaats voor bloeden observeren. Toepassing van matige druk uitoefent met behulp van twee vingers aan de site tot het bloeden stopt.
  8. Het dier terug naar haar kooi.

3. gedrags Assays

Opmerking: Alle experimenten werden door een derde partij met achterhouden van behandelingen door een unieke gecodeerde flesjes blindelings uitgevoerd. Volgorde van behandelingen was gerandomiseerd. Bij het uitvoeren van de tests die hieronder worden beschreven, moeten proefomstandigheden (soort kamer) en het tijdstip van de dag worden gecontroleerd om variatie. Deze test moet worden uitgevoerd op muizen die ouder zijn dan vier weken te bereiken van betrouwbare resultaten. Muis onderging gedrags beoordeling eenmaal vóór de virale injectie op 5 weken van leeftijd te verkrijgen van de basislijn van normale prestaties. Na virale injectie, werden muizen beoordeeld eenmaal per week gaan 48u na injectie, maximaal 40 weken van leeftijd.

  1. Breng de muis ingespoten met AAV aan een rustige, donkere ruimte die vrij is van ruis of andere verstoringen ten minste 30 min voordat de tests. De dieren niet storen tijdens deze periode van acclimatisatie.
  2. De muis naar de nieuwe kamer voor 30 min acclimatiseren en start de volgende gedrags assays (stap 3.3 en 3.4). Houd een kloof van 10 min tussen elke gedrags assay.
  3. Opknoping draad test
    Opmerking: Deze test controleert spierkracht en motorische dysfunctie.
    1. Gebruik een opvulling blad om te fungeren als een kussen. De muis halen door zijn staart en plaats deze in het midden van het raster draadrek. Hef het rek 15-20 inch boven het oppervlak en langzaam het omkeren van het scherm zodat het dier te passen haar greep op het scherm.
    2. Zodra het rek is volledig omgekeerd, start de timer en neem de tijd om te vallen.
      Opmerking: Muizen zal hangen met vier ledematen een raster. Als de draad is te laag ingesteld kunnen de muizen niet hangen. Als muizen vallen van het raster voor 60 s, plaats ze terug op de grid, de timer opnieuw en herhaal deze procedure tot twee meer probeert. Registreer de beste prestaties.
    3. Wanneer de termijn van 60 s wordt bereikt, het dier terug keren naar de kooi.
  4. Voet afdrukken test
    Opmerking: Moet het absorberend blad een smalle baan ongeveer 70 cm lang en 5 cm breed met 5 cm hoge muren.
    1. Houd de muis voorzichtig door enerzijds en rode inkt van toepassing op de voorste poten en blauwe inkt op de achterste poten met een borstel.
    2. Plaats het absorberend blad op de grond van een smalle baan.
    3. Laat de muis om te wandelen of lopen over een absorberend blad in een rechte lijn in de baan van het ene eind naar andere.
    4. Herhaal dit proces twee keer met de muis met behulp van een verse absorberend blad.
    5. Meet de afstand tussen twee opeenvolgende stappen in de voorwaartse beweging. Niet eerste en laatste paar voetafdrukken waar het dier is gewoon starten en afwerking van het punt.

4. euthanasie en weefsel oogst

  1. Gebruik een euthanasie-kamer of een glazen stolp. Als met behulp van een glazen stolp, voert u de procedure onder een zuurkast.
  2. Geniet van katoen met Isofluraan en plaats deze in de glazen stolp. Een fysieke scheidingsteken gebruiken om te voorkomen dat het dier fysiek contact met het materiaal van de verdoving. Plaats het dier in de pot onmiddellijk na deze stap.
    Opmerking: De glazen stolp mag niet vooraf geladen met Isofluraan om te voorkomen dat de mogelijkheid van hypoxemia bij de dieren.
  3. Isofluraan blootstelling blijven tot 30 s na de ademhaling stopt.
  4. Onmiddellijk na het verwijderen van de muis uit de pot, euthanaseren door cervicale dislocatie.
    Opmerking: Deze stap moet plaatsvinden zo spoedig mogelijk om te voorkomen dat de aantasting van het weefsel.
  5. Oogst de spinal cord eerst en vervolgens de quadriceps skeletspieren.
    1. Oogst van het ruggenmerg, bloot de achterkant van de muis en de vier ledematen vast aan de kant een dissectie-board.
    2. Wassen van de site van dissectie met 70% ethanol.
    3. Uitvoeren van cervicale dislocatie met een scherpe schaar.
    4. Maak een incisie in de huid in de mediaan lijn. Verwijder de pelt door snijden of voorzichtig scheuren van de huid in het dwarsvlak, gevolgd door het trekken van de pelt omhoog en over het hoofd. Verwijder het hoofd door te snijden met schaar onder de schouderbladen en op de C1-2 regio van de kolom (gevonden grenzend aan de onderkant van de schedel).
      1. Snijd de buikwand spieren aan de ventrale zijde en blijven lateraal, één richting tegelijk, totdat de wervelkolom is bereikt.
    5. Gebruik een scherpe schaar verwijderen wervels vanaf het cervicale ruggenmerg. Verwijder de zijdelingse delen van de wervels door te snijden in de wervel bogen aan beide zijden.
    6. Laat na het verwijderen van de gehele wervels het ruggenmerg.
  6. Module bevriezen de geoogste weefsels in vooraf gekoelde 2-methylbutane met de volgende methode:
    1. De helft een roestvrij staalkom vullen met 2-methylbutane en dompelen van het kwartaal van de onderkant van de kom in een container gevuld met vloeibare stikstof.
    2. Vooraf chill de 2-methylbutane in vloeibare stikstof voor 1-2 min.
    3. Plaats de skeletspieren met pincet in de 2-methylbutane totdat het wordt wit. Onmiddellijk overdracht het weefsel om droog ijs en sla het op-80 ° C.
  7. Insluiten voor immunokleuring van ruggenmerg, het weefsel in paraffineblokken bij kamertemperatuur voordat module bevriezing zoals beschreven. 17
  8. Voor biochemische analyse en kwantificering van de miRNA,1 plaats van de geoogste weefsel in een cryovial en bevriezen in vloeibare stikstof. Opslaan van de monsters bij-80 ° C.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een virale lading van 1011 vg van AAV9-miR-298 werd geïnjecteerd door middel van een enkele staart-veneuze injectie in 5 weken oude SBMA muizen. Deze muizen dragen de menselijke AR transgenic met abnormaal uitgebreid polyglutamine tract in de AR (AR97Q) en het ontwikkelen van symptomen van neuromusculaire ziekten door 10 weken oud (gewichtsverlies, gebogen rug en spieratrofie). 11 lumbale ruggemerg en quadriceps spier zijn geoogst op 2, 4, 8 en 12 weken na toediening voor miRNA kwantificering, biochemische bepaling en immunohistochemistry (Figuur 1). Beheer van de behandeling en de daaropvolgende analyses werden uitgevoerd door geblindeerde onderzoekers.

qRT-PCR analyse toonde miR-298 expressie in de skeletspieren en het ruggenmerg twee weken en vier weken na de behandeling respectievelijk, met pieken van de expressie op 8 weken in de skeletspieren en 12 weken in het ruggenmerg na de injectie (Figuur 2 ). Met behulp van een microscoop (Axiovert 100 M), werd groene fluorescentie signaal ontdekt in spierweefsel en spinale motorische neuronen door co lokalisatie van GFP en de motor neuron marker choline acetyltransferase (Flash ChAT) 10 weken na de behandeling, wanneer de muizen beginnen te tonen ziekte-uitingen (Figuur 2).

Met behulp van de dezelfde dosis regime, was een cohort van SBMA muizen gerandomiseerde spotten 7 weken van leeftijd via staart veneuze injectie voor biochemische analysen en functionele karakterisering te ontvangen ofwel miR-298. Injectie werd gevolgd door per gewicht en gedrags beoordeling omhoog tot 40 weken van leeftijd. qRT-PCR analyse toonde aan dat miR-298 behandeling vermindert de niveaus van mutant AR in de aangetaste weefsels (Figuur 3), en verhoogd lichaamsgewicht en motor prestaties (Figuur 4 verbeterde) vanaf 10 weken na de injectie.

figure-results-1
Figuur 1: schematische van studie ontwerp. Om het verhogen van de expressie van miR-298 in vivo geïnjecteerd we SBMA muizen met (A) de dubbele promotor AAV vector plasmide uiten GFP en miR-298 of mock. (B) muizen werden ingespoten via een enkele staart-ijdele injectie op 7 weken van leeftijd (vooraf symptomatische fase). Ruggenmerg en quadriceps spier werden verzameld van een cohort van SBMA muizen op verschillende tijdstippen voor weefsel distributie analyse (groen). Een cohort van SBMA muizen werd behandeld en geofferd op 16 weken oud voor biochemische analysen (rood). Gewicht en gedrags testen werden uitgevoerd wekelijks omhoog tot 40 weken van leeftijd voor functionele karakterisering (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: AAV9-miR-298 levering in muizen. Met behulp van de methode beschreven hier, ontvangen muizen AAV9-miR-298-GFP of AAV9-mock-GFP via intraveneuze injectie. Totale miRNA werd bijeengezocht uit lumbale ruggemerg en quadriceps spier op 2,4,8 en 12 weken na de injectie. qRT-PCR werd uitgevoerd voor het inschatten van de expressie niveau van miR-298 in (A) quadriceps spier (n = 5) (B) lumbale ruggemerg (n = 5, P < 0,01). Alle gegevens worden gerapporteerd als middel van ± standaardafwijking betekenen. De wijdverbreide transductie van de AAV-vector in weefsels geoogst op 10 weken na de behandeling werd bevestigd door de lokalisatie van de kleuring voor GFP in de (C) quadriceps spier (oorspronkelijke vergroting, 10 X. Schaal bar = 100 µm) en (D) motorische neuronen in de lumbale ruggemerg (oorspronkelijke vergroting, 40 X. Schaal bar = 10 µm. GFP (groen), ChAT (rood) en de DAPI (blauw). De figuur is gewijzigd van doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: MiRNA-298 overmatige expressie ontstekingsuitlokkende mutant AR in ruggenmerg en quadriceps spier in muizen. qRT-PCR werd uitgevoerd voor het inschatten van de expressie niveaus van AR mRNA in de lumbale ruggemerg (A) en (B) quadriceps spier behandeld met AAV9-miR-298-GFP of AAV9-mock-GFP. Transcript niveaus werden genormaliseerd naar snoRNA202 (n = 5 per behandeling). * P < 0,05, ** P < 0,01. Alle gegevens worden gerapporteerd als middel van ± standaardfouten. De figuur is gewijzigd van doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

figure-results-4
Figuur 4: MiR-298 overmatige expressie verbetert motor functie en gewichtsverlies vermindert. Gedrags beoordeling werd uitgevoerd wekelijks (w), tussen week 5 tot en met 40. Lichaamsgewicht (links) en hangende draad (rechts) prestaties van muizen (n = 15 per groep). Alle gegevens worden gerapporteerd als middel van ± standaardfouten. De figuur is gewijzigd van doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen we een zeer efficiënte en toegankelijke methode om te selecteren en te leveren via injectie van de staart een miRNA met behulp van rAAV9 als een virale vector richten skeletspieren en motorische neuronen in muizen. 14 vergeleken met andere strategieën RNAi, zijn miRNAs minder giftig en minder immunogeen. 18 bovendien hun kleine omvang maken hen geschikt voor de verpakking van de beperkte capaciteit van virale vectoren. 2 computationele algoritmen en voorspelling hulpmiddelen kunnen de identificatie van vermeende miRNA-mRNA doelen. Zodra geïdentificeerd, moeten de effecten van miRNA op doel genexpressie worden geverifieerd. Een gemeenschappelijke aanpak is om een bepaalde miRNA in vitro overexpress en detecteren streefniveau eiwit expressie met behulp van de westelijke analyse. 14 , 19

Verschillende studies hebben virale en niet-virale strategieën gebruikt voor het leveren van miRNAs. 13 hier we gebruikten adeno-associated virus (AAV) als een gen levering tool. Vergeleken met andere virale vectoren, AAV lokt lage immunogeniciteit, kan op lange termijn genenoverdracht, en heeft een breed spectrum van tropisme in delen en niet-delende cellen. 18 deze leveringsmethode ook de behoefte aan chemische wijziging die invloed kan zijn op de functionaliteit en de specificiteit van het RNA-molecuul kan omzeilen. Er zijn verschillende serotypes van AAV, die meestal worden bepaald door de samenstelling van de eiwitten Eiwitmantel. Deze serotypen verschillen in hun tropisme en transduce van verschillende celtypes. Het is noodzakelijk om te selecteren van de juiste serotype bij het overwegen van het doelweefsel is terechtgekomen. Wij hebben gekozen rAAV9, dankzij haar hoge transductie rendement in het centrale zenuwstelsel en skeletspieren na perifere administratie19,20. Deze aanpak heeft grotere transductie werkzaamheid aangetoond in neonatale dieren ten opzichte van volwassen dieren, waarschijnlijk te wijten aan verschillen in de samenstelling van de extracellulaire matrix, neuron-glia-verhouding, en de rijpheid van de bloed-hersen-barrière. 21 , 22

Een belangrijke stap in dit protocol is het ontwerp van de expressie-vector. In vergelijking met bicistronic vectoren, die worden belemmerd door lagere expressie van het tweede gen in vergelijking met het eerste gen naast de promotor, kan de dubbele promotor vector een back-to-back-configuratie levert hoge expressie van zowel de miRNA en EGFP, dus het toestaan van lokalisatie van de miRNA in muis weefsel met immunofluorescentie.

Intraveneuze injectie van AAV9 resulteerde in hoog rendement en homogene signaaltransductie in de onderzoeken weefsels, skeletspieren en motorische neuronen. Deze route van injectie maakt de toegediende dosis te bereiken van de systemische circulatie en kruis de bloed-hersenbarrière, die belangrijk is voor therapieën gericht op het centrale zenuwstelsel. Bovendien is het een niet-invasieve methode voor levering aan de CNS. MiR-298 expressie steeg in het ruggenmerg en het spier na 2-4 weken met een enkele perifere injectie op 5 weken oud. Wanneer met behulp van single-stranded genoom AAV vectoren, de DOVO -synthese van de tweede bundel van DNA goed zijn voor de vertraagde transductie. 23

Niveaus van menselijke miR-298 waren niet detecteerbaar in behandelde muizen 20 weken na eenmalige toediening, suggereren dat voor chronische ziekten, meerdere injecties verlangd worden kunnen tot een therapeutisch nut hebben. MiRNA degradatie na verloop van tijd kan echter worden beperkt wanneer een levenslang herhaalde toediening vereist is. Adaptieve immuniteit AAV vectoren kan bovendien, een andere hinderpaal voor een succesvolle gene levering vormen. 24 zo generatie van AAV vectoren die via het immuunsysteem veroorzaakte inert is cruciaal voor herhaalde toediening en het bereiken van de effecten op lange termijn met deze veelbelovende uitvoeringssysteem. 25

Een beperking op het gebruik van miRNA als een therapeutische strategie is het risico van off-target effecten. MiRNAs kunnen communiceren door middel van incomplementary basis in paren rangschikken met andere gen afschriften, vormt die een veiligheidsrisico met deze aanpak. Verbeterd ontwerpen van de RNAi sequenties, met inbegrip van gebruik van niet-canonieke miRNAs, zoals mirtrons, die het micro-processor complex omzeilen en uitgebreide veiligheid en verdraagbaarheid langetermijnstudies zijn van cruciaal belang voor het vertalen van deze strategie in een veilige en effectieve therapie. 26 , 27 , 28

De hier beschreven methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor miRNA overexpressie, maar het kan ook worden gebruikt voor de miRNA remming therapie met behulp van antagomirs.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict. Wij danken SignaGen laboratoria (Rockvile, MD, USA) voor de productie van AAV9 virus. Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NINDS, NIH. Philip R. Lee werd gesteund door fondsen van de divisie van intramurale onderzoek van NICHD. Carlo Rinaldi werd gesteund door een beurs van de Association Française contre les myopathieën (AFM).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
QIAzol Lysis ReagentQiagen79306Lysis van vette en standaard weefsels vóór RNA-isolatie
miRNeasy Mini KitQiagen217004Zuivering van miRNA en totaal RNA
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kitThermoFisher Scientific4366596Een zeer specifiek kit die alleen volwassen miRNA's kwantificeert
snoRNA202 PrimerThermoFisher Scientific1232Taqman miRNA controle assay in muis
miR-298 PrimerThermoFisher Scientific2190Taqman miRNA-298 assay in muis
Anti-GFP antibodyabcamab290Konijn polyklonaal voor GFP - ChIP Grade
Rode inktpadDovecraft Essentials
Blauwe inktpadDovecraft Essentials
AAV9-GFP vectorSignaGen LaboratoriesSL100840Grootschalige AAV plasmideconstructie, verpakking en zuivering
mmu-miR-298-5pThermoFisher ScientificMC12525mirVana miRNA mimic
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFPVector Biosystems Inc

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broderick, J. A., Zamore, P. D. miRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).
  3. Pickering, B. M., Willis, A. E. The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease. Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).
  4. Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration. Mol Cell. 24, 157-163 (2006).
  5. Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis. Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).
  6. Liu, N., et al. The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila. Nature. 482, 519-523 (2012).
  7. Ebner, D. C., et al. Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery. Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).
  8. Giorgetti, E., Lieberman, A. P. Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease. Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).
  9. Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management. Oral Dis. 20, 6-9 (2014).
  10. La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature. 352, 77-79 (1991).
  11. Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 35, 843-854 (2002).
  12. Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1. J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).
  13. Choudhury, S. R., et al. Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector. Mol Ther. 24, 726-735 (2016).
  14. Pourshafie, N., et al. MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy. Mol Ther. 24, 937-945 (2016).
  15. Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by "walking" the genes of three genomes. J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).
  16. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348(2011).
  17. Stuard, D. A., Oorschot, D. E. Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord. J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).
  18. Huang, F., et al. miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3. FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).
  19. Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. Experimental validation of miRNA targets. Methods. 44, 47-54 (2008).
  20. Yang, N. An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).
  21. Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Front Mol Neurosci. 7, 50(2014).
  22. Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  23. Wang, Z., Ma, H. -I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).
  24. Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).
  25. Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington’s disease. Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).
  26. Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
  27. Lowenstein, P. R. Crossing the rubicon. Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).
  28. Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. Silencing of Parkinson's disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224. Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Aflevering van microRNArecombinant AAV9neuromusculaire ziektegene silencingspinale bulbaire spieratrofieinjectie in de staartskeletspiermotorische neuronenkwantitatieve RT PCRgedragsassays

Gerelateerde artikelen