Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

11.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55736

⸱

3 juni 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Cellular and System Medicine, National Health Research Institutes

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Samenvatting

Cellen kunnen communiceren via exosomen, ~ 100 nm extracellulaire vesicles (EV's) die proteïnen, lipiden en nucleïnezuren bevatten. Non-adherent / mesenchymale mammary epithelial cell (NAMEC) -gerelateerde extracellulaire vesicles kunnen worden geïsoleerd uit NAMEC medium via differentiële ultracentrifugatie. Op grond van hun dichtheid kunnen EV's worden gezuiverd via ultracentrifugatie bij 110.000 x g. De EV-bereiding uit ultracentrifugatie kan verder worden gescheiden door gebruik te maken van een continu dichtheidsgradiënt om verontreiniging met oplosbare eiwitten te voorkomen. De gezuiverde EV's kunnen vervolgens verder geëvalueerd worden met behulp van nanoparticle-tracking analyse, die de grootte en het aantal blaasjes in de bereiding meet. De extracellulaire blaasjes met een grootte van 50 tot 150 nm zijn exosomen. De NAMEC-afgeleide EV's / exosomen kunnen worden ingezet door mammale epitheelcellen, die kunnen worden gemeten door flowcytometrie en confocale microscopie. Sommige mammale stamcellen eigenschappen ( bijv. Membraanvormende vermogen) kunnenWorden overgebracht van de stamachtige NAMEC's ​​naar epitheliale cellen via de NAMEC-afgeleide EV's / exosomen. Geïsoleerde primaire EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epithelialcellen kunnen geen mammaklieren vormen nadat ze in muizenvetpads zijn getransplanteerd, terwijl EpCAM lo / CD49f hi basale mammary epitheelcellen na de transplantatie membraan vormen. Toepassing van NAMEC-afgeleide EV's / exosomen door EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epithelialcellen stelt hen in staat om melkklippen te genereren na transplantatie in vetpads. De EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen overdragen de kliervormende vermogen van EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epitheelcellen.

Inleiding

Exosomen kunnen cellulaire communicatie bemiddelen door membraan- en cytosolische eiwitten, lipiden en RNA's tussen cellen 1 over te brengen . Exosoomgemedieerde communicatie is aangetoond dat zij betrokken zijn bij veel fysiologische en pathologische processen ( dwz antigeenpresentatie, ontwikkeling van tolerantie 2 en tumorprogressie 3 ). Exosomen hebben vaak dezelfde inhoud als die van de broncellen die ze vrijmaken. Zo kunnen de exosomen specifieke celeigenschappen van de broncellen dragen en deze eigenschappen overbrengen naar de cellen die ze innemen 4 .

Exosomen zijn 50- tot 150 nm dubbellaagse membraan vesicles en aanwezige specifieke markers ( bijv. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix en TSG101). Zo moeten exosomen worden gekenmerkt door verschillende methoden voor verschillende aspecten. Transmissie elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om membraan vesicles te visualiserenZoals exosomen 4 , 5 . Nanoparticle tracking analyse (NTA) en dynamische lichtverspreiding analyse (DLS) worden gebruikt voor het meten van de grootte en het aantal gezuiverde exosomen 4 . Het lipidemembraangehalte van exosomen kan door dichtheidsgradiënt worden gecontroleerd. Exosomale markers, zoals CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix en TSG101 6 , 7 kunnen worden gemeten door Western blotting.

Mammary basale cellen hebben de mogelijkheid om mammekirtels te genereren wanneer ze in vetpads geïmplanteerd worden, terwijl luminale cellen niet kunnen 8 , 9 , 10 . Zo worden ook basaalcellen van mammoet ook aangeduid als mammografische repopulerende eenheden. Door gebruik te maken van het model van basale en luminale cellen van de mammoet kan het vermogen van EV's / exosomen om celkenmerken tussen verschillende celpopulaties over te dragen, worden onderzocht. Dit werkDemonstreert de werkwijze voor het overbrengen van kliervormend vermogen van basale epitheelcellen naar mammary luminale epitheelcellen door gebruik te maken van EV's / exosomen afgeleid van mammale basale epitheelcellen. Luminale mammary epithelialcellen verworven basale cel eigenschappen na de inname van EV's / exosomen afgescheiden van basale cellen en kunnen dan mammary klieren 4 vormen .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle onderzoeken waarbij dieren betrokken zijn, voldoen aan protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenwelzijn.

1. Extracellulaire Vesikel / Exosome Isolatie en Validatie

  1. Cultuur mammale epitheliale basale cellen, NAMECs 4 , met vers, serumvrij medium gemaakt van 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 met natriumbicarbonaat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 μg / ml); Insuline (5 μg / ml); Boviene hypofyse extract (BPE; 35 μg / ml); En GW627368X (1 μg / ml) in 15 cm gerechten.
  2. Na het tellen van de cellen met een hemocytometer, zaad 1,2 x 10 6 cellen in 12 ml medium per 15 cm gerecht op dag 0 gedurende 4 dagen 4 .
  3. Na 4 dagen in cultuur centrifugeer het kweekmedium bij 300 xg gedurende 5 minuten met behulp van een tafelcentrifuge. Breng de supernatant over naar een conische buis ( Figuur 1 ).
  4. Centrifugeer het supernatantGedurende 20 minuten bij 2000 xg in een tafelcentrifuge. Breng de supernatant over naar een ultracentrifugebuis en laat de dode cellen en celresten achter ( Figuur 1 ).
  5. Centrifugeer het supernatant bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Breng de supernatant over naar een nieuwe ultracentrifugebuis ( Figuur 1 ).
  6. Centrifugeer het supernatant bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS ( Figuur 1 ).
  7. Centrifugeer het supernatant bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant. Resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS ( Figuur 1 ). Resuspendeer de pellet geïsoleerd van 240-480 ml NAMEC-geconditioneerd medium in 100 μl.
  8. Meet de eiwitconcentratie van de EV-suspensie met de BCA-eiwitassay. Zorg ervoor dat de concentratie ongeveer 20-40 μg / 100 μL bedraagt. Bewaren bij -20 ° C voorverdere analyse.
  9. Meet de concentratie en grootte van de EV's / exosomen door nanoparticle tracking analysis (NTA), zoals eerder beschreven door Gardiner et al. 11 . Verdun de EV's / exosomen (20 μg / 100 μL) met PBS tot 10.000 keer voor NTA-analyse.
    OPMERKING: Het resultaat van de NTA-analyse weerspiegelt het aantal en de grootte van de geanalyseerde blaasjes.
  10. Beeld de EV's / exosomen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), zoals eerder beschreven door Lin et al. 4 .

2. Exosome zuivering met behulp van een dichtheidsgradiënt

  1. Resuspendeer de 110.000 g pellet uit stap 1.7 in 40% (w / v) iodixanol in PBS (2 ml). Plaats het mengsel in volgorde met een hoeveelheid van 30%, 20%, 10% en 5% (w / v) iodixanol in PBS (2 ml elk) om een ​​dichtheidsgradiënt in een ultracentrifugebuis te vormen.
  2. Centrifugeer het mengsel bij 200.000 xg gedurende 8 uur bij 4 ° C.
  3. Verzamel elke gradiëntfractie (10 fractions; 1 ml / fractie) met een pipet uit de bovenkant van de buis.
  4. Analyseer de aanwezigheid van exosoommarkers ( bijv. CD81, CD9, CD63 en Tsg101) in elke fractie door SDS-PAGE 12 en Western blot. Loop 50 μl suspensies van elke fractie op een 10% gel bevattende 0,1% (w / v) SDS en scheid de eiwitten in fracties met gelelektroforese.
  5. Breng de eiwitten over van een gel naar een PVDF membraan en incubeer het membraan met antilichamen tegen de exosoommarkeringen ( bijv. CD81, CD9, CD63 en Tsg101) en huishoudelijke eiwit GAPDH overnacht ( Table of Materials ) bij 4 ° C.
    OPMERKING: Het resultaat identificeert de fractie die exosomen bevat.

3. Extracellulaire Vesicle / Exosome Etikettering

  1. Schors de EVs / exosomen, verkregen in stap 1.7, in 10 μM carboxyfluoresceïne succinimidyldiacetaatester (CFSE) bij 20 μg exosomaal eiwit / 100 μl. Bereid een parallel monster coAlleen CFSE en PBS, op dezelfde wijze verwerkt, als een negatieve controle voor de latere EV / exosome opname assays. Laat de mengsels gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  2. Schors de EV's / exosomen in 50x volume PBS en centrifugeer de suspensie bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS. Herhaal stap 3.2 een keer.
  3. Suspenseer de EV's / exosomen in PBS bij een concentratie van 20 μg exosomale eiwit / 100 μl en filter vervolgens de EV's / exosomen door middel van 0,22 μm membranen voordat de EV's / exosomen aan de cellen worden toegevoegd.

4. Extracellulaire Vesikel / Exosome Opname Assay

  1. Om cultuurmedium te maken, meng 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 met natriumbicarbonaat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 μg / ml); Insuline (5 μg / ml); En BPE (35 μg / ml) 4 . Platte de HMLE-cellen van de menselijke mammary epitheel in 6-putjes (1 x 10 6 </ Sup> cellen / putjes) één dag voor EV / exosome behandeling. Voeg 2 μg / ml CFSE fluorescentie-gemerkte EVs / exosoom, verkregen in stap 3.3, toe aan het kweekmedium van de HMLE-cellen gedurende 2-6 uur. Behandel de HMLE-cellen van de negatieve controlegroep met de parallelle bereiding, beschreven in stap 3.1.
  2. Na de 2- tot 6-uur incubatie wassen de cellen tweemaal met 4 ml PBS bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder de cellen met 0,25% trypsine gedurende 10 minuten en zet de cellen opnieuw op in PBS die 0,2% FBS bevat. Meet de EV / exosome opname uit de fluorescentie-intensiteit in de cellen met behulp van een fluorescentiecelanalysator 4 . Beeld de cellen die met EV's / exosomen worden behandeld of de negatieve controle met behulp van confocale microscopie.
    OPMERKING: De groene fluorescentie in de cellen wordt veroorzaakt door de opname EV / exosome. Zie de legende van Figuur 6 voor de instellingen van de microscoop.

5. Isolatie van Primaire Muis Mammary Epithelial Cells

  1. Bereid gelatine-gecoate gerechten door 12 ml 0,1% gelatineoplossing toe te voegen aan 10 cm gerechten. Plaats de platen in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten. Verwijder de gelatineoplossing en laat de deksels gedurende 4 uur in een laminaire stromende afkoeling laten vallen tot de gelatine-bekleding gedroogd is.
  2. Dissecteer de 2, 3, 4 en 5 borstklippen ( Figuur 2 ) van 12-jarige vrouwelijke C57BL / 6-muizen met behulp van een schaar en snijd de klieren in kleine stukken (2 mm 2 ) met een scheermes.
  3. Verdere dissociatie van de slurrie van borstklippen (van 10 muizen) gedurende 60 minuten bij 37 ° C, 120 rpm geroerd met 50 ml DMEM / F12 bevattende 0,2% collagenase type IV, 0,2% trypsine, 5% FBS, 5 ug / ml gentamycine , En 1x pen-streep.
  4. Pellet de epitheliale organoïden uit het mengsel door centrifugeren bij 350 xg gedurende 10 minuten.
  5. Suspensieer de epitheliale organoïden in 4 ml DMEM / F12 met 0,1 mg / ml DNase I gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 6 ml DMEM / F12 toe aan een finaleVolume van 10 ml.
  6. Centrifugeer de suspensie bij 400 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg.
  7. Resulteer de pellet in 10 ml DMEM / F12. Centrifugeer de vering maar sla de rem als de snelheid 400 x g bereikt. Gooi de supernatant weg.
    OPMERKING: Door de rem te slaan worden epitheliale organoïden snel gepelletteerd, terwijl fibroblasten, als enkele cellen, nog in de supernatant blijven.
  8. Herhaal stap 5.6 en 5.7 5-7 keer. Voeg een druppel van de suspensie toe aan een hemocytometer en controleer vervolgens de speling van fibroblasten uit het organoïde mengsel onder microscopie na elke centrifugeringsronde ( Figuur 3 ).
  9. Platte de organoïden in de gelatine gecoate schotel, verkregen in stap 5.1, gedurende 48 uur met DMEM / F12 die 1x ITS, 5% FBS, 50 μg / ml gentamycine, 10 ng / ml EGF en 1x penstrip bevatten.
  10. Na 48 uur verwijder de drijvende cellen in de kweek door het medium te vervangen door vers cultureel medium zonder FBS (FBSDMEM / F12 bevattende 1x ITS, 50 μg / ml gentamycine, 10 ng / ml EGF en 1x penstreep).
  11. Bevestig dat een monolaag van mammale epitheelcellen migreert en groeit uit de bijgevoegde epitheliale organoïden in 3 dagen.

6. Scheiding van Primaire Muis Basale / Luminale Mammary Epithelial Cells

  1. Na de 3-daagse cultuur, verwijder de muis primaire mammarycellen met een natuurlijk enzymmengsel met proteolytische en collageenolytische enzymactiviteit gedurende 20 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS.
  2. Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 5 mg / ml dispas gedurende 20 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS.
  3. Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg.
  4. Zet de cellen opnieuw op in 100 μl PBS met 0,2% FBS bij een concentratie van 10 7 cellen / ml met de verdundeAnti-CD49f en anti-EpCAM antilichamen op ijs gedurende 1 uur in het donker.
  5. Was de cellen met PBS en incubeer vervolgens de cellen met fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam op ijs gedurende 30 minuten in het donker.
  6. De cellen in PBS wassen en opnieuw opschorten met 0,2% FBS.
  7. Sorteer de EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epitheelcellen op een cel sorter 4 .

7. Extracellulaire Vesikel / Exosome Behandeling

  1. Zet de gesorteerde EpCAM hi / CD49f lo luminale mammale epitheliale cellen uit stap 6.7 op gelatinecoated 6-putjes (2 x 10 5 cellen / putjes) en behandel ze vervolgens met PBS of de 2 μg / mL NAMEC-afgeleide EV's / exosomen Verkregen in stap 1.7.
  2. Om de biologische werkzaamheid van de EV's / exosomen te waarborgen in de langdurige cultuurbehandeling, vervang het celkweekmedium met vers medium die PBS bevat of 2 μg / ml NAMEC-afgeleide EV's / exosomen om de twee dagen. Verdeel de muis niet primaRij luminale cellen tijdens de 10-daagse behandeling.

8. Vetpasta Injectie Van Mammary Epithelial Cells

  1. Anesthetiseer een 3-jarige vrouwelijke C57BL / 6-muizen met isofluoraan 2-3% inhaleermiddel.
  2. Plaats de verdoofde muis op zijn rug. Verwijder de vacht op het middel van de buik met een scheermes / haarcrème en maak de operatieplaats schoon met drie alternatieve cycli van 70% alcohol en povidon-jodium.
  3. Maak een 1,5 cm verticale insnijding door de huid langs het ventrale thoracale inguinale gebied met een schaar en wissel dan de rechter en linker 4e dikke vetpads.
  4. Verwijder elk vetpaneel door het verwijderen van klierparenchyma met een schaar. Plaats de lymfeklieren in het vetpaneel en verwijder het hele klierparenchym onder het lymfeknoop.
    OPMERKING: tweederde van het vetblok moet op zijn plaats blijven.
  5. Verwijder de cellen die zijn verkregen uit stap 7.2 met een natuurlijk enzymmengsel (zie de Tabel van Materialen ) met proteolytische aEn collagenolytische enzymactiviteit gedurende 10 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS.
  6. Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. Tel de cellen met een hemocytometer en schud de cellen in PBS bij een concentratie, zodat 15 μL de gewenste celdosis bevat (10 4 -10 2 cel / pad).
  7. Spuit 15 μL van de epitheelcel suspensie in een vetpaneel met behulp van een 100 μL glazen spuit bevestigd aan een 27G naald.
  8. Herhaal de stappen 8.4-8.7 voor het vetpaneel aan de andere kant.
  9. Sluit de huid met wondklemmen.

9. Mammary Gland Whole Mount

  1. Euthanize de muis met CO 2 plus cervicale dislocatie na 8 weken na de celinjectie (stap 8.7).
  2. Maak een verticale snede door de huidlaag van het thoracale gebied naar het inguinale gebied met behulp van een schaar en laat dan zowel rechts als links 4e mAmmary dikke pads. Verwijder de 4e borstklieren ( figuur 2 ).
  3. Spreid de vetbladen op glasmicroscoopschuiven en maak de vetbladen met Kahle's fixatief (4% formaldehyde, 30% EtOH en 2% ijsazijn) bij kamertemperatuur 's nachts.
    Let op: Kahle's fixative is een irritant. Doe deze stap in een chemische kap.
  4. Was de vetbladen in 250 ml 70% EtOH gedurende 15 minuten en daarna gedurende 250 minuten in 250 ml dH20. Vlek de vetpadsjes met karminealuminium (1 g karmine en 2,5 g aluminiumkaliumsulfaat in 500 ml dH 2 O) bij kamertemperatuur 's nachts.
  5. Was de vetpadsjes gedurende 15 minuten met 250 ml 70% EtOH gedurende 250 minuten, 250 ml 95% EtOH en 250 ml 100% EtOH gedurende 15 minuten.
  6. Reinig de vetblokken in xyleen voor dagen en stop de xyleen incubatie wanneer de vetpadsjes transparant worden.
    Let op: Xylene is een irritant. Doe deze stap in een chemische kap.
  7. Monteer de glijbanen wiMontage medium en neem afbeeldingen (2.400 dpi) van de dikke pads met behulp van een digitale dia scanner.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Aangezien aangetoond is dat het blokkeren van PGE 2 / EP 4 signalering triggers EV / exosome vrijgave van basale basale stamcellen 4, presenteert dit werk een werkwijze voor het isoleren van de geïnduceerde EV's / exosomen uit mammary epithelial basal cell (NAMEC) cultuur. Aangezien NAMEC's ​​worden gekweekt in serumvrij medium, zijn er geen bestaande EV's / exosomen afgeleid van serum 13 . Voor cellen die in serum beva...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Exosomen dragen vaak eigenschappen van de cellen die hen vrijgegeven, en de hoeveelheid vrijgegeven exosomen kan door stimuli 4 worden geïnduceerd. Het kweekmedium van cellen kan worden verzameld en onderworpen aan differentiële ultracentrifugatie voor EV / exosoom-collectie ( Figuur 1 ). Er is momenteel geen algemene overeenstemming over een ideale methode om EV's / exosomen te isoleren. De hier gebruikte optimale methode is bepaald door de downstream applicatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Health Research Institutes (05A1-CSPP16-014, HJL) en van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MCDB 170 USBiologicalM2162
DMEM/F12Thermo1250062
Optima L-100K ultracentrifugeBeckman393253
SW28 Ti RotorBeckman342204
SW41 RotorBeckman331306
NANOSIGHT LM10MalvernNANOSIGHT LM10voor nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep Sigma-AldrichD155660% (w/v) oplossing van iodixanol in water (steriel).
CD81-antilichaamGeneTexGTX1017661:1.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 °C, overnacht 
CD9-antilichaamGeneTexGTX1009121:1.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 °C, overnacht 
CD63-antilichaamAbcamAb594791:1.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 °C, overnacht 
TSG101-antilichaamGeneTexGTX1187361:1.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 °C, overnacht 
GAPDHGeneTexGTX1001181:6.000 in 5% w/v magere droge melk, 1x TBS, 0,1% Tween 20 bij 4 °C, overnacht 
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetaat ester)ThermoV12883
FACSCaliburBD Biosciencesfluorescentiecelanalyzer
collageenase Type IV Thermo17104019
trypsineThermo27250018
 ITSSigma-AldrichI3146een mengsel van recombinant menselijk insuline, humane transferrine en natriumseleniet
accutaseebioscience00-4555-56een natuurlijk enzymmengsel met proteolytische en collagenolytische enzymactiviteit
dispase STEMCELL79135 mg/mL = 5 U/mL
anti-CD49f-antilichaamBiolegend3136111:50
anti-EpCAM-antilichaamBiolegend1182131:200
FACSAriaBD Biosciencescelsorteerder
carmine alumSigma-AldrichC1022
menselijke borstpieronstelcellen (HMLE-cellen, NAMEC's)geschenken van Dr. Robert Weinberg
permountThermo Fisher Scientific SP15-500
natriumbicarbonaatZymeset BSB101
EGFPeprotechAF-100-015
HydrocoritisonSigma-AldrichSI-H0888
Insuline Sigma-AldrichSI-I9278
BPE (runde hypofyse-extract)Hammod Cell Tech 1078-NZ
GW627368X Cayman10009162
15 cm kweekschotelFalcon 353025
tafelcentrifugeEppendrof Centrifuge 3415R
ultracentrifugebuisBeckman344058
PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) Corning46-013-CM
BCA-eiwitassayThermo Fisher Scientific 23228
Transmissie-elektronenmicroscopieHitachiHT7700
gelatine STEMCELL7903
10 cm kweekschotelFalcon 353003
6-wells kweekschotelCorning3516
vrouwelijke C57BL/6-muizenNLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (fetaal bovien serum)BioWest S01520
gentamycineThermo Fisher Scientific 15710072
Pen/StrepCorning30-002-Cl
DNase I5PRIMER2500120
isofluoraan HalocarbonNPC12164-002-25
formaldehydeMACRONH121-08
EtOH (ethanol)J.T. Baker800605
glaciumazijnzuurPanreac131008.1611
kaliumsulfaat van aluminiumSigma-Aldrich12625
Xyleen Leica3803665
0,22 μm membranenMerck MilliporeMillex-GP
AUTOCLIP-wondclips, 9 mmBD Biosciences427631
AUTOCLIP-wondclipapplierBD Biosciences427630
CellMask™ Deep RedThermo Fisher Scientific C10046plasmamembraankleuring

Referenties

  1. Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
  2. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  3. Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
  4. Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
  5. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
  6. György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  7. Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  12. Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  13. Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  16. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
  17. Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
  18. Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
  19. Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Exosoomisolatieultracentrifugatiedichtheidsgradi ntnanoparticle trackingflowcytometrieconfocale microscopiemammaire epitheelcellenstamceleigenschappenvermogen tot kliervorming
Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.