Methodenartikel

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

DOI:

10.3791/55738

⸱

1 juni 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de scheiding van functionele mitochondriale elektronen transportketen complexen (Cx) IV en supercomplexen daarvan door gebruik te maken van natieve elektroforese om informatie over hun montage en structuur te onthullen. De inheemse gel kan onderworpen worden aan immunoblotting, in-gel assays, en zuivering door elektroelutie om individuele complexen verder te karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mitochondriale elektronen transportketen (ETC) omzetten de energie die wordt afgeleid van de verdeling van verschillende brandstoffen in de bioenergetische munteenheid van de cel, ATP. De ETC bestaat uit 5 massieve eiwitcomplexen, die ook worden samengevoegd in supercomplexen die respirasomen genoemd worden (CI, C-III en C-IV) en synthasomen (CV), die de efficiëntie van elektronenvervoer en ATP-productie verhogen. Voor meer dan 50 jaar zijn verschillende methoden gebruikt om de ETC-functie te meten, maar deze protocollen geven geen informatie over de montage van individuele complexen en supercomplexen. Dit protocol beschrijft de techniek van native gel polyacrylamide gelelektroforese (PAGE), een methode die meer dan 20 jaar geleden werd gemodificeerd om ETC complexe structuur te bestuderen. Inheemse elektroforese maakt het mogelijk de ETC-complexen te scheiden in hun actieve vormen, en deze complexen kunnen dan worden onderzocht met behulp van immunoblotting, in-gel assays (IGA) en zuivering door elektroelutie. Door de reSulten van inheemse gel PAGE met die van andere mitochondriale tests, is het mogelijk om een ​​vollediger beeld van ETC-activiteit, zijn dynamische montage en demontage te verkrijgen en hoe dit mitochondriale structuur en functie regelt. In dit werk worden ook beperkingen van deze technieken besproken. Samengevat is de techniek van native PAGE, gevolgd door immunoblotting, IGA en electroelution, hieronder weergegeven, een krachtige manier om de functionaliteit en samenstelling van mitochondriale ETC supercomplexen te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale energie in de vorm van ATP is niet alleen essentieel voor de overleving van cellen, maar ook voor de regulering van de cel dood. De generatie van ATP door oxidatieve fosforylering vereist een functionele elektronen transportketen (ETC, Cx-I tot IV) en mitochondriale ATP synthase (Cx-V). Recente studies hebben aangetoond dat deze grote eiwitcomplexen in supercomplexen worden georganiseerd, respirasomen en synthasomen 1 , 2 genoemd . Het is uitdagend om de assemblage, dynamiek en activiteitregulering van deze massale complexen en supercomplexen te analyseren. Terwijl zuurstofverbruiksmetingen die zijn genomen met een zuurstofelektrode en enzymassays die worden uitgevoerd met behulp van een spectrofotometer, waardevolle informatie over ETC-complexe activiteit kunnen geven, kunnen deze analyses geen informatie verschaffen over de aanwezigheid, grootte en subeenheidssamenstelling van het betrokken eiwitcomplex of supercomplexen. De ontwikkeling van blauw en duidelijk natuurlijk (BN en CN) PAGINA 3 heeft een krachtig instrument gecreëerd voor het onthullen van belangrijke informatie over complexe samenstelling en montage / demontage en over de dynamische regulering van de supramoleculaire organisatie van deze vitale ademhalingscomplexen onder fysiologische en pathologische aandoeningen 4 .

De montage van deze complexen in hogere orde supercomplexen lijkt de mitochondriale structuur en functie 5 te reguleren. Bijvoorbeeld, respirasome assemblage verhoogt de efficiëntie van elektronoverdracht en de generatie van de protonmotief kracht over het mitochondriale binnenmembraan 5 . Bovendien verhoogt de assemblage van synthasomen niet alleen de efficiëntie van ATP-productie en de overdracht van energie-equivalenten in de cytoplasma 2 , maar vormt ook het mitochondriale binnenmembraan in de buisvormige cristae 6 , </ Sup> 7 . Studies van supercomplexe assemblage tijdens hartontwikkeling in muisembryo's tonen aan dat de opwekking van Cx-I-bevattende supercomplexen in het hart begint op ongeveer embryonale dag 13,5 8 . Anderen hebben aangetoond dat de hoeveelheid Cx-I-bevattende supercomplexen afneemt in het hart door aging of ischemie / reperfusie verwondingen 9 , 10 of kan een rol spelen bij de progressie van neurodegeneratieve ziekten 11 .

Dit protocol beschrijft methoden voor native gel PAGE die kunnen worden gebruikt om de assemblage en activiteit van de ETC complexen en supercomplexen te onderzoeken. Het geschatte molecuulgewicht van mitochondriale supercomplexen kan worden beoordeeld door het scheiden van de eiwitcomplexen in CN- of BN-polyacrylamidegelen. CN PAGE staat ook toe voor het visualiseren van de enzymatische activiteit van alle mitochondriale complexen direct in de gel (in-gel assays;IGA) 12 . Dit werk demonstreert de activiteit van de respirasomen door het vermogen van Cx-I om NADH door IGA te oxideren en de aanwezigheid van synthasomen te wijzen door de ATP-hydrolyserende activiteit van Cx-V door IGA. De meervoudige complexen en supercomplexen die Cx-I en Cx-V bevatten, kunnen ook worden aangetoond door de eiwitten over te brengen op nitrocellulosemembranen en immunoblotting uit te voeren. Het voordeel van deze aanpak is dat BN of CN PAGE in het algemeen scheidt eiwitcomplexen op basis van hun fysiologische grootte en samenstelling; De overdracht naar een membraan behoudt dit patroon van banden. Analyse van eiwitcomplexen in een BN of CN PAGE kan ook worden uitgevoerd met behulp van 2D-PAGE (zie Fiala et al. 13 voor een demonstratie) of door middel van sucrose-dichtheidcentrifugatie 14 , 15 . Om een ​​specifieke band verder te analyseren kan het worden uitgesneden uit de BN PAGE, en de eiwitten uit dit eiwitcomplex kunnen purifie zijnD door ze te electroeluteren onder natieve omstandigheden. Inheemse elektroelutie kan binnen enkele uren uitgevoerd worden, wat een significant verschil zou kunnen maken voor de passieve diffusie (zoals gebruikt in Referentie 16) van eiwitten van een gel in de omliggende buffer.

Samengevat beschrijven deze werkwijzen verschillende benaderingen die het mogelijk maken de verdere karakterisering van supermoleculen met een hoge molecuulgewicht van mitochondriale membranen mogelijk te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van harten van C57BL / 6N muizen (wild type). Muizen werden verdoofd met CO 2 vóór cervicale dislocatie, en alle procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de afdeling Laboratorium diergeneeskunde aan de Universiteit van Rochester en in overeenstemming met de nationale wetgeving, federaal statuut en NIH-beleid. Het protocol werd goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van de Universiteit van Rochester (University Committee on Animal Resources).

1. CN en BN PAGE

OPMERKING: Alle apparatuur die wordt gebruikt voor BN en CN PAGE moet vrij zijn van wasmiddel. Om dit te waarborgen, moet u alle apparatuur wassen met 0,1 M zoutzuur, gevolgd door het spoelen met gedeïoniseerd H 2 O.

  1. Voorbereiding
    1. Anodebuffer bestaande uit 25 mM imidazool, pH 7,0, bij 4 ° C bereiden; Opslaan bij 4 ° C.
    2. Bereid kathode buffer voor CN of BN PAGE.
      1. Voor CN PAGE gebruik 7,5 mM imidazool en 50 mM tricine; Voeg 0,5 g natriumdeoxycholaat en 0,2 g laurylmaltoside per liter buffer toe. Stel de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C en sla bij 4 ° C op.
      2. Voor BN PAGE gebruik 7,5 mM imidazool en 50 mM tricine en pas de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C. Bewaren bij 4 ° C.
      3. Voor lichtblauwe BN kathode buffer gebruik 7,5 mM imidazool en 50 mM tricine. Stel de pH op 7,0 bij 4 ° C en voeg 20 mg Coomassie per liter buffer toe. Bewaren bij 4 ° C.
    3. Bereid extractiebuffer (EB) op met 50 mM NaCl, 50 mM imidazool, 2 mM aminocaprozuur en 1 mM EDTA. Stel de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C en sla bij 4 ° C op.
    4. Bereid 3x gelbuffer (gebruikt voor BN en CN gels) met 75 mM imidazool en 1,5 M aminocaprozuur. Stel de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C en sla bij 4 ° C op.
    5. Bereid een laadbuffer (LB) van 0,01 g Ponceau S, 5 g glycerol en 5 ml H 2 O op. Opslaan bij kamertemperatuur.
    6. Bereid Coomassie blauw door 50 mg Coomassie toe te voegen aan 1 ml 500 mM 6-aminohexaanzuur. Stel de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C en sla bij 4 ° C op.
    7. Bereid 20 mM en 200 mM laurylmaltoside in H20. Maak porties van 200 μl en houd ze bevroren. Doe het wasmiddel voor gebruik.
3% tot 8% (mini) 4% tot 10% (maxi)
0,5 gels (licht) 0,5 gels (zwaar) 0,5 gels (licht) 0,5 gels (zwaar)
AAB (mL) 0.42 1.3 2.5 7.7
CN / BN buffer (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H20 (mL) 2.7 1.4 14 6.3
Glycerol (g) 0 0.47 0 2.5
Volume (mL) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabel 1: Hoeveelheden Ingrediënten nodig om 1 Mini- of Maxi-PAGE te gieten. De in deze tabel gebruikte volumes worden berekend voor 1 mini- of 1 maxi-gel, 1,5 mm dik. Het volume van AAB is gebaseerd op een 40% voorraadoplossing. Licht en zwaar verwijzen naar de concentraatIonen van AAB. APS en TEMED worden toegevoegd nadat elke kolom van de gradiëntmenger is gevuld met AAB-oplossing.

  1. Gieten en rennen
    OPMERKING: Gebruik 3-8% of 4-10% acrylamide / bisacrylamide (AAB) gradiënt voor respectievelijk CN- of BN-gel. Tabel 1 geeft een samenvatting van de hoeveelheden buffer, AAB, H20, glycerol, ammoniumpersulfaat (APS) en tetramethylethylendiamine (TEMED) gebruikt voor een mini-gel (85 mm breed x 73 mm hoog x 1,5 mm dik) of maxi-gel (160 Mm breed x 200 mm hoog x 1,5 mm dik). Montages van glasplaten met CN of BN-gels kunnen in een zak worden gekoeld met een paar ml 1x gelbuffer of verpakt in papieren handdoek bevochtigd met 1x gelbuffer voor opslag. De gels zijn voor maximaal een week stabiel.
    1. Om de gel te gieten, plaats de verloopmenger op een verhoogde roerplaat om ervoor te zorgen dat de gel door de zwaartekracht stroomt in de bereide gelkamer.
    2. Vul de uitstroomkamer van de gradiëntmenger met 4,77 / 25 ml (Mini / maxi) van de zware oplossing (met een hogere concentratie AAB).
    3. Open de stophaanverbinding tussen de zware en lichte kamer voorzichtig en laat een druppel oplossing doorgaan naar de andere kant.
      OPMERKING: dit duw luchtbellen uit de verbindingsbuis en stophaan, die de stroom tussen de twee kamers voorkomt. Dit kan niet gebeuren als beide kanten al zijn ingevuld, omdat de gelijke druk de bel voorkomt.
    4. Vul de andere kamer van de gradiëntmenger met 4,72 / 25 ml (mini / maxi) van de lichte oplossing.
    5. Plaats een roerbalk in de uitloopkamer met de zware oplossing en begin met roeren. Gebruik een roer snelheid die geen bubbels veroorzaakt.
    6. Voeg snel APS en TEMED toe aan elke kamer om polymerisatie te starten.
    7. Open de verbinding tussen de twee kamers van de gradientmixer en laat het mengsel enkele seconden duren voordat u de uitloopruimte opent om de gel te gieten.
      OPMERKING: Gravity wiLl beide kamers gelijkmatig afvoeren en het mengen van het licht in de zware oplossing vermindert de acrylamidedichtheid langzaam van de bodem naar de bovenkant van de gel. Gebruik de gehele inhoud die in de verloopmixer staat om de gel te gieten.
      1. Aan het einde, zet de kam met de putjes zorgvuldig in de gel om de bellen en het mengen van de lagen te vermijden.
    8. Was de gradiëntmenger onmiddellijk met ethanol om eventuele gel te spoelen. Spoel met water en giet de tweede gel. Laat de gels polymeriseren (meestal minder dan 20 minuten is nodig voor mini-gels).
    9. Om de gels te rennen, monteer ze in de elektrode montageklem en vul de midden- of bovenkamer met CN of lichtblauwe BN kathode buffer. Wacht een paar minuten om te controleren of er lekken zijn voordat u anodebuffer toevoegt aan de buitenste / onderste kamer.
      1. Haal de putjes voorzichtig uit en doe de putjes met kathodebuffer af met een spuit of pipet.
      2. Breng de gels in een koude kamer (4 ° C) of compleet in ijs.
        1. Voor CN mini-PAGE, gebruik 100 V voor het eerste uur en 200 V tot het einde, meestal nog een 1-1,5 uur. Alternatief, voer de CN mini-PAGE bij 30-40 V overnacht.
          OPMERKING: De focus ligt hier op eiwitten met een hoge molecuulgewicht, zodat eiwitcomplexen met een molecuulgewicht van minder dan 140 kDa uit de gel zullen lopen. Kortere looptijden voor elektroforese kunnen worden gebruikt om complexen met een laag molecuulgewicht te behouden.
        2. Voor BN maxi-PAGE, gebruik 100 V en laat de gels overnacht (ongeveer 18 uur).
          OPMERKING: De stroom is zeer laag (<15 mA), dus een stroomvoorziening die aan deze voorwaarden kan voldoen is nodig. Op dit punt kunnen de gels worden gebruikt voor IGA of immunoblotting. In sommige gevallen kunnen banden of rijstroken uit de gels worden gesneden met behulp van een scheermesje op een glasplaat voor elektrogeluchting.
  2. Voorbeeld bereiding
    OPMERKING: Membraangebonden mitochondriale supercomplexen moeten uit de stam worden geëxtraheerdE innerlijke mitochondriale membraan. Om mitochondriale supercomplexen te behouden, gebruik of vers geïsoleerd mitochondria of monsters die slechts één keer bevroren en ontdooid zijn. De onderstaande berekeningen / volumes worden gegeven voor mini-gels (de put van een 10-brons kam in een gel 1,5 mm dikke tot 35-40 μL) en maxi-gels (de put van een 15-brons kam houdt in tot 200 μl). Daarnaast dient u een aliquot van elk monster (gewoonlijk 10 μL) op te slaan op een denaturerende SDS-gel voor het detecteren van het spanning-afhankelijke anionkanaal (VDAC) als laadcontrole.
    1. Plaats een geschikte hoeveelheid (bijvoorbeeld 10-50 μg eiwit voor mini-gels en 50 - 200 μg voor maxi-gels) van geïsoleerd mitochondria of weefselhomogenaat in microtubes en centrifuge bij 17.000 xg gedurende 10-15 minuten bij 4 ° C.
      OPMERKING: Deze stap verwijdert een deel van de oplosbare mitochondriale matrix en / of cytosolische eiwitten.
    2. Aspireren en weggooi de supernatant en voeg extractiebuffer toe aan de gewenste hoeveelheidOp de gel laden. Resusteer het sediment op ijs zachtjes. Voeg indien gewenst een algemene proteaseremmersmix op dit punt toe.
      OPMERKING: Op basis van de hier gebruikte apparatuur werd 30 μl gebruikt voor een mini-gel en 100 μl voor een maxi-gel, waardoor de eiwit / buffer verhouding tot niet meer dan 2 μg eiwit tot 1 μl buffer werd beperkt.
    3. Voeg detergent toe ( bv. 2 μg laurylmaltoside / 1 μg eiwit, zie de representatieve resultaten en discussie voor meer informatie).
      OPMERKING: Lauryl maltoside wordt doorgaans gebruikt, maar digitonin kan ook gebruikt worden.
    4. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Meng het aan het begin en soms af tijdens het incuberen door het tritureren en / of roeren van de buis voorzichtig te mengen.
    5. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om eventuele membraan- en weefselfragmenten te verwijderen.
    6. Breng de supernatant over naar een nieuwe buis. Voor CN-monsters voeg 1 μL LB toe voor elke 10 μL monstervolume; Het totale volume van het monster moet app zijnOngeveer 40 μl voor een mini-gel en 130 μl voor een maxi-gel. Voor BN-monsters, voeg Coomassie toe aan de monsters, zodat de verhouding kleurstof tot detergent 1: 4 (w / w) is.
    7. Laad 30 en 120 μl van de monsters in respectievelijk de putjes van de mini- of maxi-gel. Gebruik de overige 10 μL van elk monster voor de denaturerende SDS gel om VDAC te detecteren als een laadbeheersing.
    8. Om de molecuulgewichtsmarkers op te stellen, los 1 injectieflacon met een kalibratiemengsel met een hoge molecuulgewicht op (zie de tabel van materialen voor meer informatie) in 60 μl BN / CN gelbuffer en voeg 120 μl H20 en 20 μl POND. Laad 15 μL per baan.
    9. Run de gels zoals beschreven in stap 1.2.9.2.

2. In-gel analyses voor Cx-I en Cx-V

OPMERKING: De analyses worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Neem foto's, scans of afbeeldingen van de ontwikkelende bands voor documentatie. (Belangrijk) Proteïnen kunnen niet worden overgedragen ontO nitrocellulose membranen na het voltooien van een IGA.

  1. Cx-I-analyse
    1. Voorbereiding.
      1. Bereid een assaybuffer van 5 mM Tris in H20 met een pH van 7,4; bewaar op kamertemperatuur.
      2. Los 10 mg NADH op in 1 ml assaybuffer. Bewaar in porties van 100 μL bij -20 ° C tot gebruik; Vermijden bevriezen en ontdooien.
      3. Weeg 25 mg Nitroblue tetrazolium in een microtube.
      4. Bereid het fixatief door 5 ml azijnzuur in 95 ml H20 te verdunnen; bewaar op kamertemperatuur.
    2. Het uitvoeren van de test.
      1. Combineer 10 ml assaybuffer met 25 mg Nitroblue tetrazolium (uiteindelijke concentratie: 2,5 mg / ml) en 100 μl 10 mg / ml NADH (0,1 mg / ml). Voeg dit toe aan de gehele gel, een baan of een gebied van belang, uitgesneden uit een CN gel.
        OPMERKING: dit kan gebeuren in een duidelijke plastic of glazen houder. Houd er rekening mee dat deze test niet kan worden uitgevoerd na BN PAGE.
      2. Volg de ontwikkeling van blauwe banden na zachte agitatie (rocker) voor> 3 min.
      3. Bevestig de gel in 10 - 20 ml azijnzuuroplossing of was in 5 mM Tris, pH 7,4 om de reactie te stoppen. Neem foto's voor documentatie (zie de Tabel van Materialen).
  2. Cx-V-analyse
    OPMERKING: De Cx-V-analyse moet worden uitgevoerd met behulp van dubbele CN- of BN-gels, waar één geïncubeerd wordt met 5 μg / ml oligomycine (een Cx-V-remmer) om Cx-V-onafhankelijke activiteit te demonstreren.
    1. Voorbereiding.
      1. Bereid een assaybuffer met 35 mM Tris en 270 mM glycine op; Stel de pH op bij 8,3 bij kamertemperatuur. Bewaar de buffer bevroren in 50 ml alikvoten, maar controleer de pH na bevriezen en ontdooien.
      2. Bereid 1 M MgS04 in H20; Bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
      3. Weeg 27,28 mg Pb (NO3) 2 in een microtube.
      4. Weeg 60 mg ATP in een microtube.
      5. Oplossen 1 mg oLigomycine in 1 ml ethanol. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
      6. Bereid een fixatief door 50 ml methanol met 50 ml H20 te mengen; bewaar op kamertemperatuur.
    2. Het uitvoeren van de test.
      1. Incubeer een gel, een baan of een gebied van belang van een BN of CN-gel gedurende 2 uur met zachte agitatie (tuimelaar) in 10-20 ml assaybuffer ± 5 μg / ml oligomycine (50-100 μl 1 mg / ML in ethanol) bij kamertemperatuur.
      2. Na incubatie, vervang de buffer met 14 ml verse analysebuffer en voeg 190 μL 1 M MgSO4 (14 mM), 27,28 mg Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg ATP 8 mM) en 75 ul oligomycine (waar nodig).
      3. Incubeer met zachte agitatie (rocker) en let op een wit neerslag, aangezien banden op oligomycine behandelde gels niet-Cx-V-afhankelijke banden zullen geven.
        OPMERKING: Het uiterlijk van het neerslag kan enkele uren duren.
      4. Bevestig de gel in methanol-Based fixative (bijvoorbeeld 50% methanol), omdat zure oplossingen het lood neerslag oplossen. Fotografeer de resultaten.
        OPMERKING: Het lood neerslag doet geen inbreuk op de Coomassie-kleuring van de gels.

3. Proteïneoverdracht naar Nitrocellulose of Polyvinylideendifluoride (PVDF) Membranen

  1. Bereid een transferbuffer van 25 mM Tris en 200 mM glycine op. Pas de pH op op 8.3 en voeg 0,0005 g / L SDS en 200 ml / L methanol toe. Bewaar op kamertemperatuur.
    1. Snijd een nitrocellulose- of PVDF-membraan (poriënmaat: 0,45 μm) met een scheermesje of een schaar tot een iets groter formaat dan die van de gel.
      OPMERKING: Met nitrocellulose membranen kunnen Ponceau S-kleuring worden gebruikt om eiwitbelasting te beoordelen, terwijl PVDF-membranen meer scherp gedefinieerde banden opleveren.
  2. Protocol.
    1. Zacht het nitrocellulosemembraan, het filterpapier en de sponzen voor aTenminste 10 minuten in transfer buffer. Plaats het PVDF membraan in 100% methanol gedurende 15 s of volgens de aanbeveling van de fabrikant alvorens het in de transferbuffer te plaatsen. Plaats de open cassette van de transfer kit in een platte kom met transfer buffer.
    2. Plaats de spons en 1-2 lagen filterpapier op de achterkant van de cassette. Verwijder de bellen.
    3. Plaats de gel op het filterpapier. Duid de oriëntatie van de gel aan door een hoek van de gel en / of het membraan te knippen.
    4. Plaats het membraan bovenop de gel. Verwijder alle bellen.
    5. Plaats filterpapier en een spons op de membraan. Verwijder alle bubbels in deze sandwich.
    6. Sluit de cassette en plaats deze in de cassettehouder van de transfer kit.
    7. Breng de eiwitten bij 25 V gedurende ongeveer 12-18 uur.

4. Immunoblotting

  1. Voorbereiding.
    1. Bereid een Ponceau-vlek (500 ml) door 25 ml aan te brengenVan azijnzuur en 0,5 g Ponceau S tot 475 ml H20; Opslaan bij kamertemperatuur (kan hergebruikt worden).
    2. Bereid Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base en 2,7 mM KCl. Stel de pH op op 8,0 en houd deze bij kamertemperatuur op.
    3. Bereid TBS-tween (TBST) door 0,5 ml / L Tween 20 aan TBS toe te voegen; bewaar op kamertemperatuur.
    4. Bereid melk vaste stoffen / TBST door 5 g melk vaste stoffen in 100 ml TBST op te lossen. Bewaar bij 4 ° C en gebruik binnen 3 dagen.
    5. Bereid BSA / TBST door 3 g boviene serumalbumine (BSA, fractie V) in 100 ml TBST op te lossen. Bewaar bij 4 ° C en gebruik binnen 3 dagen.
  2. Protocol.
    1. Plaats de membraan in de Ponceau S oplossing zodra de overdracht klaar is om alle overgedragen eiwitten te visualiseren. Benoem de positie van de merkers op het membraan met een potlood en documenteer het Ponceau-S-gekleurde membraan door foto of scan.
    2. Was de membraan 3 keer gedurende 10 minuten per wiDe TBS onder zachte agitatie.
    3. Blok de membraan met melk vaste stoffen / TBST gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur of overnacht in een koude kamer met zachte roering.
    4. Was het membraan gedurende 10 minuten met TBST onder zachte agitatie.
    5. Incubeer met het primaire antilichaam 's nachts in de koude kamer onder zachte roering. Verdun het antilichaam ( bijv. 1: 1000 voor anti-ATP5A en -NDUFB6) in BSA / TBST.
      OPMERKING: De meeste antilichamen geven een beter signaal op membranen uit inheemse gels wanneer ze gedurende de nacht worden geïncubeerd.
    6. Was het membraan gedurende 10 minuten met TBST onder zachte agitatie.
    7. Incubeer met secundair antilichaam gedurende tenminste 60 minuten bij kamertemperatuur zonder zachte agitatie. Verdun het antilichaam (1: 5000 tot 1: 50.000) in melk vaste stoffen / TBST.
    8. Was het membraan 3 keer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met TBST zonder zachte agitatie.
    9. Bereid tijdens het laatste was het verbeterde chemoluminescentie (ECL) substraat volgens de instructies van de manufacturer.
    10. Incubeer het membraan met ECL-substraat volgens gebruiksaanwijzingen van de fabrikant.
    11. Ontdek het signaal op de film met gebruik van instructies van de fabrikant van het ECL-substraat.

5. Electroelution

  1. Voorbereiding.
    1. Bereid een elutiebuffer van 25 mM tricine, 3,75 mM imidazool (pH 7,0 bij 4 ° C) en 5 mM 6-aminohexaanzuur.
      OPMERKING: Draag handschoenen te allen tijde tijdens het hanteren van de elektro- en membraankapjes om contaminatie met externe eiwitten te voorkomen.
  2. Op de dag voordat u de elektroeluter gebruikt voor native electroelution, voer dan het volgende uit:
    1. Week de membraankappen (cut-off: 3,5 kDa) in elutiebuffer gedurende 1 uur bij 60 ° C. Breng de kappen over naar verse elueringsbuffer en week ze gedurende 12 uur of langer in de koelkast.
      OPMERKING: een afsnijdend molecuulgewicht van 3,5 kDa voorkomt het verlies van kleine pRoteinen die gemakkelijk kunnen dissociëren van het eiwitcomplex van belang.
    2. Was de elektroeluter module, glazen buizen, tank en deksel grondig met ethanol. Spoel met water en laat de apparatuur drogen.
  3. Op de dag van inheemse elektroeluering, doe het volgende.
    1. Plaats een frit in de bodem (matte) van elke glazen buis die u wilt gebruiken. Plaats indien nodig de glazen buis in elueringsbuffer en duw de fres van binnen naar onderkant van de buis.
    2. Duw de glazen buis met de frit in de module van de elektroleuter. Vet de grommet met elutiebuffer en schuif de glazen buis op zijn plaats. Zorg ervoor dat de toppen van de glazen buizen gelijk zijn aan de grommet.
    3. Sluit de lege grommets met stopjes.
    4. Plaats een natte membraan dop onderaan de siliconen adapter en vul de adapter met elutie buffer. Pijp de buffer langzaam in de adapter omhoog en omlaag om luchtbellen rond het dialysemembraan te verwijderen.
    5. Schuif de buffer gevulde adapter op de bodem van de glazen buis. Verwijder alle bellen die op de frit in de glazen buis verschijnen.
    6. Vul elke glazen buis met elueringsbuffer.
    7. Plaats de uitgesneden banden van de BN PAGE in de glazen buizen (zie stap 1.2.9.3). Knip grote stukken in kleinere stukken. Zorg ervoor dat de vulhoogte binnen de glazen buis ongeveer 1 cm is.
    8. Plaats de gehele module in de tank.
    9. Voeg ongeveer 600 ml koude elueringsbuffer toe aan de tank. Zorg ervoor dat de siliconadapterkappen in de buffer zijn om bellen in het dialysemembraan te voorkomen.
    10. Plaats een roerbalk onderaan de tank.
      OPMERKING: Met roeren wordt voorkomen dat bellen aan de onderkant van het dialysemembraan vallen.
    11. Verwijder de eiwitten gedurende 4 uur bij 350 V in een koude kamer.
    12. Nadat de elutie is voltooid, verwijder de elektroeluter module uit de buffertank en plaats deze in een gootsteen of een kom.
    13. Als er een stop werd gebruikt, verwijder het om te dragenIn de bovenste bufferkamer. Anders, gebruik een grote pipet om de buffer te verwijderen.
    14. Verwijder de buffer uit elke glazen buis en weggooi. Zorg ervoor dat de siliconenadapter op zijn plaats blijft en dat de vloeistof onder de frit niet verstoord of geschud wordt.
    15. Verwijder de siliconenadapter zorgvuldig, samen met de membraankap uit de bodem van de glazen buis. Pipet de inhoud (ongeveer 400 μL) van de siliconenkap in een microtube. Met een andere 200 μl elutiebuffer spoel de siliconenkap af en voeg deze aan de microtube. Herhaal voor alle glazen buizen.
    16. Aangezien de membraankappen hergebruikt kunnen worden, behoudt u de membraankappen door ze in elutiebuffer te plaatsen die 0,5 mg / ml natriumazide bevat. Koel ze.
      OPMERKING: Het eluaat heeft een lage eiwitconcentratie en kan geconcentreerd worden met behulp van een centrifugaalfilterapparatuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om mitochondriale supercomplexen te visualiseren, werden vers geïsoleerde mitochondria van muizen gebruikt 17 , 18 . Mitochondriale supercomplexen zijn gevoelig voor herhaalde cycli van bevriezen en ontdooien, wat leidt tot hun desintegratie, hoewel dit voor sommige onderzoekers tolerant kan zijn. Indien bevriezing noodzakelijk is voor opslag, om de beste resultaten te waarborgen, mogen de monsters niet meer dan één cyclus van be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een functionele ETC is nodig voor mitochondriale ATP generatie. De complexen van de ETC kunnen twee soorten supercomplexen vormen: de respirasomen (Cx-I, -III en -IV) 1 en de synthasomen (Cx-V) 2 . De montage van elk complex is nodig voor een intacte ETC, terwijl de organisatie van de ETC in supercomplexen de algemene ETC-efficiëntie 5 , 22 verbetert. Hoe deze supercomplexen elkaar verzamelen en demonteren, worden ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] en het Strong Children Research Center aan de Universiteit van Rochester.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Protean II mini-gel chamberBiorad1658004Complete set om mini-gel elektroforese uit te voeren
Protean XL maxi-gelBiorad1653189Complete set om maxi-gel elektroforese uit te voeren
Gradient maker, Hoefer SG15VWR95044-704Mini-gel gradienten gieten
Gradient maker, maxi-gelVWRGM-100Maxi-gel gradienten gieten
Transfer kitBiorad1703930Complete set voor nat transfer van eiwitten naar membranen
Electroeluter model 422Biorad1652976Elektro-elutie van eiwitten van native of SDS PAGES
Glass platesBiorad1653308Korte platen
Glass platesBiorad1653312Spacer platen
Glass platesBiorad1651823Binnenplaten
Glass platesBiorad1651824Buitende platen
Power supplyBiorad1645070Voeding geschikt voor native elektroforese
ECL-Western Thermo Scientific32209Chemoluminiscent substraat
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Verbeterd chemoluminiscend substraat
Film/autoradiography filmGE Health care28906845Documentatie van Western blots
Film processor CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNAFoto's nemen om gels, membranen en blots te documenteren.
Canon Power Shot 640 Camera hood CanonAfscherming van de camera voor foto's die op een lichttafel worden gemaakt
Acrylamide/bisacrylamideBiorad161014840% voorgemengde oplossing
GlycineSigmaG7403
SDS (sodium dodecyl sulfate)Invitrogen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Buffer
TricineSigmaT0377
Sodium deoxychelateSigmaD66750Detergens
EDTASigmaE5134
SucroseSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Buffer
ImidazoleSigmaI15513Buffer
Lauryl maltosideSigmaD4641Detergens
Coomassie G250Biorad161-0406
Aminohexanoic acidSigmaO7260
Native  molecular weight kitGE Health care 17-0445-01Calibratiekit voor hoge molecuulgewichten voor native elektroforese.
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP  SigmaA2383
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomycinSigmaO4876
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ponceau SSigmaP3504
anti-ATP5AAbcamab14748antilichaam tegen ATP synthase subeenheid ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244antilichaam tegen Cx-1 subeenheid NDUFB6
anti-VDACCalbiochem529534antilichaam tegen VDAC
ECL HRP linked antibodyGE Health CareNA931Vsecundair antilichaam tegen ATP5A, NDUFB6 en VDAC
Blocking reagentBiorad170-6404
BSA
sodium chlorideSigmaS9888
potassium chlorideSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Silver staining KitInvitrogenLC6070

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330(2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondri le supercomplexenBlue Native PAGEimmunoblottingassemblage van prote necomplexenmitochondri le biologieisolatie van mitochondri n

Gerelateerde artikelen