DiI perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in Ambystoma Mexicanes

Samenvatting

Met behulp van een lipofiele l, 3'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleuringstechniek, kan Ambystoma mexicanum vasculaire perfusie ondergaan om de vasculatuur gemakkelijk te visualiseren.

Samenvatting

Perfusionstechnieken zijn eeuwenlang gebruikt om de circulatie van weefsels te visualiseren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is een soort salamander die is uitgekomen als een essentieel model voor regeneratie studies. Er is weinig bekend over hoe revascularisatie zich voordoet in de context van regeneratie bij deze dieren. Hier rapporteren wij een eenvoudige methode voor visualisatie van de vasculatuur in axolotl via perfusie van 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI). DiI is een lipofiele carbocyanine kleurstof die onmiddellijk in het plasmamembraan van endotheliale cellen inslaat. Perfusie wordt gedaan met behulp van een peristaltische pomp, zodat DiI de circulatie door de aorta binnentreedt. Tijdens perfusie vloeit de kleur door de bloedvaten van de axolotl en voegt zich in contact met de lipide bilayer van vasculaire endotheelcellen. De perfusieprocedure duurt ongeveer een uur voor een acht-inch axolotl. Onmiddellijk na perfusie wiTh DiI, kan de axolotl met een confocale fluorescerende microscoop worden weergegeven. De DiI licht licht in het rood-oranje bereik uit wanneer het opgewekt wordt met een groen fluorescerend filter. Deze DiI perfusie procedure kan gebruikt worden om de vasculaire structuur van axolotl te visualiseren of patronen van revascularisatie in regenererende weefsels te demonstreren.

Inleiding

Visualisatie van vasculatuur speelt een belangrijke rol bij het begrijpen van de structuur en functie van organismen in vele soorten. Vanaf de 16e eeuw met Leonardo da Vinci zijn modellen en grafische voorstellingen van de circulatie ¹ bestudeerd. Met behulp van wassen en rubberen matrijzen werden weefsels geperfuseerd om driedimensionale modellen van de vaatwortel te creëren, die de studie van organogenese en pathogenese ^{1 , 2} toonden. Harsen en wassen werden gekleurd met kleurstoffen zoals India Ink of Carmine Red om hun eenvoudige visualisatie ^{1 , 2 mogelijk te maken} . Deze technieken veroorzaken echter veel problemen omdat hun hoge viscositeiten volledige perfusie van het weefsel van belang ¹ verhinderden. Toen het veld verfijnder werd, kwam het gebruik van confocale en elektronenmicroscopen in het spel, waardoor de perfusie techniek Ues weg van gietvormen en naar vloeibare perfusies van de vaatwasser, waarvan sommige toegestaan ​​zijn voor de perfusie en beeldvorming van bloedvaten zonder het aanvankelijke weefsel ³ te vernietigen. DiI, een fluorescerende carbocyanine kleurstof, is een dergelijke vlek die de perfusie van dieren mogelijk maakt zonder schade aan het vaatweefsel.

Carbocyanine kleurstoffen zijn lipofiele kleurstoffen die in contact komen met celmembranen. Deze kleurstoffen zorgen voor makkelijke en onmiddellijke kleuring van vasculaire endotheelcellen, die vervolgens onder een fluorescerende confocale microscoop kunnen worden bekeken. DiI beweegt via laterale diffusie in het lipidemembraan van cellen, zoals blijkt uit de etikettering en opsporing van neuronen ⁴ . Chemisch geven de twee alkylketens van DiI de hoge affiniteit voor celmembranen, terwijl twee geconjugeerde ringen van een fluorochroom die verantwoordelijk zijn voor het uitzenden van een rode golflengte wanneer het opgewekt wordt door groene fluorescerende lichtfilters> 4. DiI is in veel capaciteiten gebruikt, met inbegrip van succesvolle etikettering van het plasmamembraan en zowel anterograde als retrograde etikettering in neuronen ^{5 , 6} . DiI is eerder gebruikt in perfusieprotocollen terwijl het visualiseren van de vasculatuur van muizen ⁷ .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) zijn salamanders die uitsluitend in brakke meren in de buurt van Mexico City, Mexico leven. Deze dieren zijn een belangrijk model geworden voor het begrijpen van regeneratieve processen, aangezien zij volledige ledematen, staart (inclusief zenuwsnoer), delen van het hart en andere inwendige organen, en delen van het oog als volwassenen ^{8 , 9} kunnen regenereren. Bovendien, met de recente toepassing van genetische hulpmiddelen in axolotls, is nu ongekend inzicht in de moleculen en cellen die deze processen runnen ⁸ mogelijk. De succesvolle regeneRantsoen van een hele ledemaat vereist een uitgebreid revascularisatieproces, dat een belangrijke rol kan spelen in regeneratie, buiten de traditionele functies van bloedvaten bij het leveren van zuurstof en voedingsstoffen. Het begrijpen van revascularisatie in de context van weefselregeneratie is imperatief. Axolotl bloedvaten zijn eerder met India Ink in beeld gebracht, en hoewel de resultaten intrigerend zijn, is dit proces niet in de daaropvolgende decennia ¹⁰ herzien. Wij trachten een DiI perfusie protocol aan te passen dat is ontwikkeld voor gebruik in zoogdieren om een ​​volledige perfusie en visualisatie van de axolotl vasculatuur ^{7 mogelijk te maken} . Dit protocol beschrijft de stappen die zijn genomen om succesvol te perfectioneren en vervolgens de axolotl circulatie te visualiseren met een DiI-kleuringstechniek. Deze procedure zorgt voor een nauwkeurige visualisatie van octrooibloedschepen in homeostatische weefsels, evenals in regenererende weefsels, en biedt een nieuwe methode voor visualizatioN en analyse van het revascularisatieproces in de axolotl.

Protocol

Alle axolotl-experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het Institutional Animal Care and Use Committee van Brigham en Women's Hospital (BWH).

1. Stel Perfusion Experiment op

1. Plaats een volwassene axolotl in een plastic container, gevuld met 0,1% tricaine oplossing (MS222) gedurende 15-20 minuten of tot het volledig verdoofd is. Zorg ervoor dat de container voldoende tricineoplossing is, zodat de axolotl volledig ondergedompeld is.
   Opmerking: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierlijke zorg. Bij BWH wordt een axolotl als volledig verdoofd beschouwd als het een voetnijp test mislukt, wat betekent dat er geen reflexieve beweging is wanneer de voet zachtjes wordt geperst.
   Let op: hoewel tricine een verdoving is die specifiek wordt gebruikt voor aquatische organismen, moet direct contact met de tricineoplossing voorkomen worden.
2. Stel het axolotl perfusie station op.
   1. Plaats deAbsorberend pad op een vlakke, vlakke oppervlakte met de absorberende kant naar boven gericht.
   2. Knip een gat in het polystyreen schuim frame dat de juiste grootte en vorm voor de verdoofde axolotl ligt in de rugliggende positie. Plaats het frame op het absorberende pad.
      Opmerking: Sommige extra papieren handdoeken kunnen direct onder het frame geplaatst worden voor extra absorptie.
   3. Laad de peristaltische pomp met de perfusiebuis. Zet de pomp aan op een stromingssnelheid van 0,7 ml / min, met de klok mee naar beneden.
   4. Maak de verdunningsoplossing met 0,7x PBS en 5% glucose in een 1: 4 mengsel.
   5. Meng 10 ml verdunningsoplossing met 200 μl van de DiI-voorraadoplossing in een 50 ml conische buis. Cap en meng door inversie. Bedek deze buis met aluminiumfolie om de werkoplossing tegen blootstelling aan licht te beschermen.
      Opmerking: Volumes moeten proportioneel veranderd worden volgens de grootte van de axolotl. Deze waarden zijn voor een axolotl van ongeveer 15 cm (snout-naar-tail lengte). EENNimalen van deze grootte hebben mogelijk geen volledige seksuele volwassenheid bereikt, zodat dierlijk geslacht op dit moment niet kan worden bepaald.
   6. Vul een 50 ml conische buis met 0,7x PBS.
      Opmerking: PBS wordt gebruikt om de lus- en axolotl-exsanguinatie te primeren.
   7. Bevestig de 27-gauge vlinder naald aan het einde van de perfusie buis. Vouw de vlindervleugels op elkaar en plaats de klemstand.
   8. Plaats het vrije uiteinde van de perfusiebuis in de 50 ml conische buis gevuld met 0,7x PBS en voer de perfusiepomp door totdat de volledige buis met oplossing is gevuld. Pauzeer de pomp zodra de hele buis gevuld is met PBS.
      Opmerking: Zorg ervoor dat het buis te allen tijde vrij is van luchtbellen, omdat dit luchtembolie in de axolotl veroorzaakt en volledige perfusie voorkomt.
   9. Plaats een papieren handdoek in de axolotl-vormige vorm in het polystyreen schuim frame. Gebruik een transferpipette, doek de handdoek met de tricineoplossing.
      Opmerking: Knip een klein vierkant in het midden van het papierEl om de afvoer van vloeistoffen tijdens de perfusieprocedure mogelijk te maken.
   10. Plaats de verdunde axolotl op de papierdoek in het polystyreen schuim frame.

2. Het openen van de Axolotl-borst

1. Gebruik chirurgische tang om de huid langs de centrale as van de borst van de axolot te knijpen, net onder de schouderslijn. Optrekken.
2. Gebruik een scalpel om een ​​kleine snede te maken waar de huid is getrokken.
3. Verwijder een vierkante patch van de huid over de borst om twee kraakbeenplaten te onthullen.
   1. Verwijder de huid om een ​​raam over de thoracale holte te openen die groot genoeg is om het hart duidelijk te zien en ongeveer 5 mm van de aorta af te trekken van het hart.
4. Zet het bindweefsel zorgvuldig door met behulp van pincet of de gesloten schaar, om te voorkomen dat alle belangrijke bloedvaten worden gesneden.
5. Breng elke kraakplaat afzonderlijk met behulp van de tang en accijnst ze wMet de chirurgische schaar.
6. Knip het pericardium met de tang vast, trek het op en steek het met behulp van de chirurgische schaar; Deze incisie moet net zo diep genoeg zijn om het zeer dunne pericardium te puncturen en moet groot genoeg zijn om het pericardium te verwijderen. Pas op om het hart niet te snijden.
7. Verwijder het pericardium delicaat om het hart en de aorta bloot te leggen.
   Opmerking: Gebruik een transferpipet om de borstholte en de kiemen periodiek met de tricineoplossing te spoelen om het gebied helder te houden en de axolotl verdoofd te houden.

3. Perfusie van de Axolotl

1. Plaats de klemstang met de geladen vlindernaald naast het polystyreen schuimframe, zodat de arm van de klem gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om de naald in de axolotl aorta te plaatsen. Steek de punt van de naald in de richting van het rostrale aspect van het dier tijdens het inbrengen en houd de naald evenwijdig aan de aorta om te voorkomen dat het door de opPositieve kant.
2. Zet de peristaltische pomp aan. 0,7x PBS moet door de buis doorgaan.
3. Steek de naald in de aorta.
   1. Schuif de tang onder de aortische boog en trek licht omhoog om gemakkelijk toegang te krijgen.
   2. Manoeuvreer de naaldklem combinatie zodanig dat de naald langs de lengte van de aorta loopt, naar boven gericht. Plaats de naald terwijl u de tang gebruikt voor ondersteuning achter de aorta.
      Opmerking: De naald moet diep genoeg in de aorta worden ingebracht om ervoor te zorgen dat het niet tijdens perfusie zal glijden. Dit kan ongeveer 5 mm zijn voor een 15 cm axolotl. Zorg ervoor dat de naald perfect in lijn is met de aorta om volledige vulling van het vaartuig te vermijden. Door-en-door-puncturen kunnen massale bloeding veroorzaken en de succesvolumes van perfusie verminderen. Succesvolle invoeging kan worden bevestigd door zichtbare vergroting van de atria van het hart.
4. Snijd een atrium snel met de sciSsors en laat bloed afvoeren.
   1. Spoel met tricineoplossing om bloedophoping en stollingsvorming in de borstholte te voorkomen.
5. Perfuseer de axolotl met ongeveer 20-30 ml PBS. Het dier moet van lichtroze naar kleur veranderen in een succesvolle perfusie.
6. Pauze de peristaltische pomp en beweeg het vrije uiteinde van de buis in de 15 ml buis DiI-oplossing. Start de pomp opnieuw op, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de buis ontstaan.
7. Perfuse de axolotl met de volledige werkvoorraad van DiI.
   Opmerking: in een succesvolle perfusie, de axolotl met veranderende kleur naar de heldere roze van de DiI. Dit zal het meest opvallend zijn in de kieuwen.
8. Pauze de pomp na de perfusie met DiI is compleet en plaats het vrije uiteinde van de buis in 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing om het weefsel vast te maken. Start de pomp opnieuw en vul tenminste 10 ml PFA aan.
   Let op: PFA is giftig en moet worden behandeld en afgezondenGepast van Handschoenen en veiligheidsbril dienen te worden gedragen, en oplossingen moeten in een dampkoker worden aangebracht. Perfusie van de axolotl met PFA om het weefsel te repareren resulteert in de dood van het dier.

4. Beëindiging van de perfusie- en visualisatievoorbereiding

1. Stop de peristaltische pomp en verwijder de naald uit de axolotl aorta.
2. Plaats de axolotl op een plastic plaat.
   Opmerking: Het gebruik van de helft van een grote Petri-schotel werkt goed en maakt het mogelijk om een ​​kleine hoeveelheid Tricaine of PBS op de axolotl te gieten om zijn huid nat te houden en de visualisatie kwaliteit te verbeteren.
3. Verwijder alle gebruikte materialen in de betreffende afvalbakken. Schoon chirurgische gereedschappen met 70% ethanol, desinfecteren met behulp van een glaspiraal sterilisator tussen dieren en steriliseren door autoclaving volgens de procedure. Spoel de buizen met de PBS-oplossing en laat ze vervolgens afvoeren, drogen en opslaan voor verdere gebruik.

5. Visualisatie van de Perfused Axolotl

1. Plaats de axolotl onder een fluorescerende confocale microscoop.
2. Schakel de lichten uit, omdat visualisatie van de DiI-gekleurde schepen door licht wordt belemmerd.
3. Gebruik een groene fluorescentie-emissiefilterkubus ( bijv. ET-CY3) met de confocale microscoop om de vasculatuur van de axolotl te visualiseren. Gebruik excitatie licht van golflengte 545 nm.
   Opmerking: Om een ​​beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen, kunnen de volgende parameters worden gebruikt: blootstelling voor 1,1 s, winst van 1x, verzadiging van 1,0, vergroting van 2X.

Resultaten

Met DiI-kleuring kan de vasculatuur van de axolotl gemakkelijk worden visualiseerd. Bloedvaten van dieren geperfuseerd met de lipofiele kleurstof zijn direct zichtbaar onder een fluorescerende confocale microscoop. Figuur 1 .1-1.5 is een schematische weergave van het perfusieprotocol. Na perfusie met de helderroze kleurstof zal een succesvol geperforeerde axolotl roze verschijnen. Met behulp van een groen fluorescerend filter op een co...

Discussie

Visualisatie van de vasculatuur van de axolotl kan succesvol worden bereikt via perfusie met de lipofiele carbocyanine kleurstof, DiI. In deze studie beschrijven we een nieuw protocol voor de perfusie van de axolotl met DiI met behulp van een peristaltische pomp. We tonen ook de latere visualisatie van de axolotl vasculatuur met behulp van een fluorescerende confocale microscoop. Dit protocol was een aanpassing van het knaagdier DiI perfusieprotocol gezien in Li et al. ⁷ , maar grote ver...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Peristaltic Pump	Marshall Scientific	RD-RP1
Perfusie slang	Excelon Lab & Vacuum Tubing	436901705	maat S1A
27g vlindernaald	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Gedestilleerd water
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glucose	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495
Ethanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Chirurgische pincetten	Medline	MDG0748741
Polystyreen schuim frame			elke polystyreen schuim vierkant met een axolotl-vormige  uitgesneden
Chirurgische schaar	Medline	DYND04025
Scalpel	Medline	MDS15210
Absorbeerbare onderlaag	Avacare Medical	PKUFSx
Papieren handdoeken
Standaard wegwerpoverdrachtspijp	Fisherbrand	50216954
Klemstandaard	Adafruit	291
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine poeder
Volwassen axolotl
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Kunststof tanks			Variërende maat geschikt voor de axolotl
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Microscoop	Leica	M165 FC
ET-CY3 Fluorescerende Filter	Leica	M205FA/M165FC
MS-222