Bereiding van plasmamembraanvezels uit botmarges Mesenchymale stamcellen voor potentiële cytoplasmvervangende therapie

Samenvatting

Leeftijdgerelateerde aandoeningen zijn geassocieerd met meerdere defecten in componenten van het cytoplasma. Hier presenteren we een protocol om plasmamembraan vesicles uit mesmermale stamcellen van beenmerg te bereiden. Deze techniek kan potentieel gebruikt worden als middel voor het vervangen van cytoplasma ter verbetering van de leeftijd-geassocieerde fenotypen.

Samenvatting

We hebben eerder gerapporteerd over de opwekking van plasmembraan vesicles (PMV's) via de mechanische extrusie van zoogdiercellen. De fusie van PMV's met mitochondriale deficiënte Rho0-cellen herstelde mitotische activiteit onder normale kweekomstandigheden. Atherosclerose, type 2 diabetes, de ziekte van Alzheimer en kanker zijn leeftijdgerelateerde aandoeningen die gerapporteerd zijn geassocieerd te zijn met meerdere mechanische en functionele defecten in de cytosol en organellen van een verscheidenheid van celtypen. Beenmerg-mesenchymale stamcellen (BMSC's) vertegenwoordigen een unieke celpopulatie uit het beenmerg dat zelfvernieuwende mogelijkheden bezit, terwijl ze hun multipotency behouden. De toevoeging van senescenscellen met jong cytoplasma van autologe BMSC's via de fusie van PMV's, biedt een veelbelovende aanpak om verouderde of zelfs omgekeerde leeftijd-geassocieerde fenotypes te verbeteren. Dit protocol beschrijft hoe u PMV's van BMSC's kunt voorbereiden via extrusie via een polycarbonaatmembraan met 31; m poriën, het bestaan ​​van mitochondria bepalen en het behoud van membraanpotentieel binnen PMV's onderzoeken met behulp van een confocale microscoop, concentreer PMV's door centrifugeren, en voer de in vivo injectie van PMV's uit in de gastrocnemiusspier van muizen.

Inleiding

Er is een enorme hoeveelheid inspanning gewijd aan het vaststellen van benaderingen voor gen-, enzym- en celvervangende therapieën. Dit heeft geleid tot grote doorbraken en zelfs klinische toepassingen ^{1 , 2 , 3} . Onlangs is een controversiële mitochondria vervangende therapie gebaseerd op nucleus transfer technologie toegepast op in vitro bevruchting voor vrouwen van oude leeftijd of met een dodelijke mitochondriale DNA mutatie ⁴ . Defecten gevonden in leeftijdgerelateerde ziekten, waaronder atherosclerose, type 2 diabetes, de ziekte van Alzheimer en kanker zijn meestal veelzijdig. Er is gedocumenteerd dat de accumulatie van lipidedruppels; De afzetting van amyloïd eiwit; Het vasthouden van ontvouwen eiwitten in het endoplasmatische reticulum; En defect proteasoom, autofagosoom en mitochondriën dragen bij tot de ontwikkeling of verergering van deze ziekten"Xref"> 5 ^{, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Momenteel is er geen beschikbaar mechanisme dat gericht is op directe remediëring van storingen in de cytosol en organellen, die senescentie en veroudering van fenotypes veroorzaakt.

We hebben eerder gemeld over de opwekking van plasmamembraanvezels (PMV's) via de mechanische extrusie van zoogdiercellen ¹² . Met uitzondering van de kern werden componenten in het membraan of cytosol, inclusief eiwitten en RNA, evenals de organellen, zoals mitochondria, gevonden in PMV's. In wezen kan een PMV worden beschouwd als een miniatuur enucleated cel. Nog belangrijker, de fusie van PMV's met mitochondria-deficiënte Rho0-cellen herstelde mitotische activiteit onder normale kweekomstandigheden. Dit is het eerste rapport over establiEen potentieel efficiënte benadering voor cytoplasmavervangende therapie mogelijk maken.

Beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSC's) zijn multipotente stamvader cellen die routinematig worden gegenereerd uit het beenmerg en worden gemakkelijk uitgebouwd in cultuur. Embryonale stamcelmarkers Oct4, Nanog en SOX2 zijn op lage niveaus in MSCs ¹³ gedetecteerd. Telomerase activiteit is ook meetbaar. Daarnaast maken de afwezigheid van co-stimulerende moleculen en humane leukocytenantigeen (HLA) klasse II-moleculen, evenals lage HLA klasse I-expressie op MSC's, de ideale cellen voor allogene of "off-the-shelf" gebruik in Zowel regeneratieve medicijnen als immunomodulerende toepassingen ¹⁴ .

Hier beschrijven we hoe u PMV's van muis BMSC's kunt voorbereiden via extrusie via een polycarbonaatmembraan met 3 μm poriën, bepalen het bestaan ​​van mitochondria en controleer het onderhoud van membraanpotentiaal in PMV's met behulp van confocatieAl microscopie, bereide geconcentreerde maar niet geaggregeerde PMV's door centrifugeren, en voer de in vivo injectie van PMV's uit in de gastrocnemius spier van muizen.

Protocol

8 tot 12 weken oude BALB / c-muizen werden gekocht van het Experimentele Dierentrum van Shanghai (Shanghai, China) en opgewekt in een specifiek pathogeenvrij en voorzien van airconditioning voorziene dierenfaciliteit. Dierzorg en experimentele procedures waren in overeenstemming met de richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van laboratoriumdieren opgericht door de Shantou University.

1. Montage van de apparaat

1. Om de steriliteit te waarborgen, schakel het UV-licht van een weefselkweekkap voor 30 minuten voor gebruik in.
2. Schroef een weggooibare 25 mm filtereenheid af en dompel de kap en bodem van het apparaat in een 200 ml glazen beker gevuld met 75% ethanol gedurende 30 minuten. Het apparaat is gemaakt van polypropyleen van medische kwaliteit.
3. Haal de dop en de onderkant van het apparaat op met behulp van een pincet, schud de resterende ethanol met de hand af en laat de onderdelen gedurende 10 minuten in de kap laten drogen.
4. Vet een 19 mm polycarbonaatmembraan in PBS en plaats het zorgvuldig op de onderste matrix van de botM van het apparaat. De polymere film heeft een gladde, vlakke oppervlak en track-geëtst 3 μm poriën.
5. Monteer het apparaat opnieuw door de kap stevig tegen de bodem te schroeven. Zorg ervoor dat het membraan niet uit het midden verdwijnt.
6. Verwijder de naald van een 1 ml insulinspuit en teken 1 ml PBS. Bevestig de spuit aan de filterunit en druk dan PBS via het apparaat om het apparaat te nat te maken en om te testen of er sprake is van lekkage.

2. Generatie van plasmamembraanvezels (PMV's)

1. Vestig een BMSC-cultuur, zoals gerapporteerd door Nemeth et al. ¹⁵ , in DMEM cultuurmedium dat 15% FBS en 1% penicilline / streptomycine bevat. Cultiveer de cellen in een 6-putjesplaat in een bevochtigde incubator die 5% CO ₂ bij 37 ° C bevat.
2. Om de cellen te vermenigvuldigen, verwijder het kweekmedium en spoel de put met 0,5 ml calciumvrije PBS af.
3. Voeg 0,5 ml 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer de cellen bij 37 ° CGedurende 3 minuten Trek het bord een paar keer tegen de palm van de hand om het losmaken van de cel te vergemakkelijken. Stop de spijsvertering door 1 ml kweekmedium toe te voegen.
4. Verzamel de cellen in een 15 ml conische buis en draai gedurende 2 minuten bij 200 xg in een bank centrifuge. Resusteer de cellen in 4 ml kweekmedium en verdeel de cellen in twee putjes van een 6-putjesplaat.
   OPMERKING: Cellen bereiken meestal samenloop op ongeveer 24 uur.
5. Om PMV's te genereren, oogst de cellen uit één putje (ongeveer 5 x 10 ⁵ cellen) van een 6-putjes plaat door middel van trypsine vertering en monodisperse de cellen in 0,5 ml cultuurmedium.
6. Laad de cellen in de insulenspuit, bevestig deze aan de filterunit en druk de plunjer snel om de cellen door de filter te knijpen. Verwijder het geëxtrudeerde medium omdat er slechts een paar PMV's erin moeten zijn.
7. Plaats een extra 0,5 ml medium in de spuit en druk het snel door het filter. Verzamelde het medium van de tweede extrusie, die bevattenS PMV's van verschillende grootte.
8. Loop 150 μL van het verzamelde medium in een 35 mm glazen bodemschotel en laat de PMV's ongeveer 10 minuten op de bodem zakken. Onderzoek de PMV's onder een omgekeerde fase contrastmicroscoop uitgerust met een CCD camera met behulp van de 20X objectieflens.

3. Onderzoek van de inhoud binnen de PMV's met behulp van Confocal Microscopy

1. Om transfectie uit te voeren in de BMSC's verdund 2 μg supercoiled plasmide DNA en 6 μl kationisch transfectie reagens ( bv. PolyJet) in 50 μl serumvrije DMEM. Vortex om goed te mengen en draai kort om alle vloeistof van de zijkanten van de buis te verzamelen.
2. Voeg de verdunde oplossing (vanaf stap 3.1) druppelsgewijs toe in verdunde DNA-oplossing, vortex sterk gedurende 1 minuut, draai kort en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
3. Vervang het oude medium op de BMSC's, die zacht zijn met ongeveer 30% samenvloeiing overnacht, met 2 ml vers cultureel medium en voeg DN toeEen transfectie mengsel druppelsgewijs.
4. Vervang met 2 ml fris medium na 12 uur transfection.
5. Om cytoplasmatisch gelokaliseerde eiwitten te traceren, transfecteren de cellen met het plasmide dat een EGFP-expressiecassette (pEGFP-N1) bevat, zoals hierboven beschreven. Oogst de cellen door trypsine digestie 48 uur na transfectie voor PMV generatie, zoals hierboven beschreven.
6. Om de mitochondria te traceren, vlek de cellen met mitochondriale kleurstof (1 μM, MitoTracker) in 30 minuten bij 37 ° C in vers cultureel medium.
7. Om het membraanpotentieel van de mitochondria te detecteren, vlek de cellen met de cyanine-kleurstof JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetrachloor-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyaninejodide) (10 μg / Ml) gedurende 30 minuten bij 37 ° C in vers cultureel medium.
   1. Was de cellen drie keer met 0,5 ml PBS en geef vervolgens de cellen op met behulp van trypsine-vertering voor PMV-generatie, zoals hierboven beschreven.
   2. Laad 150 μL van de verzamelde medIum in een 35 mm glazen bodemschotel en laat de PMV's ongeveer 10 minuten op de bodem komen. Onderzoek de PMV's onder een confocale microscoop met behulp van de 100x olie objectieflens.
8. Om EGFP of mitochondriale kleurstof te detecteren, zet de 488 nm laser aan en verzamel het signaal bij 505-530 nm. Om JC-1 op te sporen, zet de 488 nm en 543 nm lasers aan en verzamel signalen bij 505-530 nm en 560-615 nm. Stel de pinhole waarde in op ongeveer 1,4.

4. Bereiding van geconcentreerde PMV's door centrifugeren

1. Oog de cellen door trypsine digestie op en maak PMV's, zoals hierboven beschreven, in 0,5 ml cultuurmedium.
2. Spin de PMV's op 1200 xg in een centrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer de supernatant zorgvuldig en rem de pellet opnieuw in 100 μl kweekmedium met zachte werveling.
3. Laad 50 μL PMV's in een 35 mm glasbodembak en laat ze ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur afzetten. Onderzoek de PMV'sOnder een confocale microscoop met behulp van de 40x-objectieflens.
4. Voeg de reeks verdunde polyethylenimine (PEI) oplossing toe aan de BMSC-cultuur gedurende 1 uur en controleer op tekenen van cytotoxiciteit.
   OPMERKING: hier werd de PEI bij 2 μg / ml gekozen omdat er geen tekenen van toxiciteit in BMSC's werden gedetecteerd.
5. Oog de cellen door trypsine digestie en voeg PEI bij 2 μg / ml gedurende 1 uur toe om het celmembraan op te laden als een middel om aggregatie te voorkomen. Generate PMVs, zoals hierboven beschreven, in 0,5 ml cultuurmedium. Concentreer de PMV's en controleer ze onder een confocale microscoop, zoals hierboven beschreven.

5. Injectie van PMV's in de Gastrocnemius Spier

1. Om het membraan te vlek, voegt u CM-DiI (chloormethyldialkyl-indocarbocyanine) (10 μM) kleurstof in 1 ml vers cultureel medium toe aan de BMSC's gedurende 30 minuten.
2. Oog de cellen (ongeveer 5 x 10 ⁵ ) door middel van trypsine digestie en haal ze opnieuw op in 0,5 ml cultuurmedium. Voeg PEI (2 μg / ml) toe voor 1h. Genereer en concentreer de PMV's in 100 μl kweekmedium, zoals hierboven beschreven.
3. Anaesthetiseer een BALB / c muis door na 10 uur na het innemen van natriumbarbital (10 mg / kg) te injecteren.
4. Maak de buitenkant van de gastrocnemius spier schoon met 75% ethanol. Langzaam injecteer de PMV's (100 μL) in de gastrocnemius spier met behulp van een 30 G insuline spuit.
5. Na de toediening van de verdoving, plaats een nat gaas over de ogen gedurende de duur van het experiment en verwarm de muis met een gloeilamp totdat het wakker wordt. Huis de muis alleen in een individuele ventilatiekooi.
6. Om de gastrocnemius spier 12 uur na de operatie te oogsten, vermoord de muis door cervicale ontwrichting.
7. Sprinkel 75% ethanol over de gastrocnemius spier, open de huid met een schaar en snijd de hele gastrocnemius spier aan beide uiteinden af.
8. Spoel de spier met PBS en onderzocht het onder een fluorescentiemicroscoop met behulp van de 20X objectieflens.
9. Trim de spier met eenScherp scheermesje om de delen te verwijderen zonder fluorescentie. Snijd de delen met sterke rode fluorescentie in ongeveer 9 mm ³ kubussen.
10. Bevestig elke kubus in het optimale snijtemperatuurmedium (OCT), doe het in vloeibare stikstof gedurende 5 minuten, en houd deze in een -20 ° C vriezer tot gebruik.
11. Snijd de bevroren secties in stukken 20 μm dik met behulp van een cryostaat en plak elke sectie op een glazen glijbaan. Spoel de sectie een keer met PBS.
12. Teken een cirkel rond het gedeelte met een vlek cirkel pen en voeg 100 μL DAPI (1 μg / ml) toe. Aspiratie van de DAPI-oplossing na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur in het donker en wassen driemaal met PBS.
13. Druppel montageolie over het monster, bedek het met een glazen glijmiddel en sluit de glijband met nagellak. Onderzoek de sectie onder een confocale microscoop met behulp van de 100x-olie objectieflens.
14. Om CM-DiI op te sporen, zet u de 543 nm laser aan en verzamel het signaal bij 560-615 nm. Om DAPI op te sporen, zet u de 405 aanNm laser en verzamel signaal bij 420-480 nm. Stel de pinhole waarde op ongeveer 1,4.

Resultaten

De sleutel tot een succesvolle voorbereiding van PMV's hangt sterk af van de juiste samenstelling van de filtereenheid ( Figuur 1 ), die kan worden getest door 1 ml PBS door het membraan te duwen. Als lekkage optreedt, moet u de filterunit opnieuw monteren en opnieuw testen. Het lek kan echter alleen betrouwbaar worden getest wanneer cellen door het membraan worden geduwd. Als er slechts een paar PMV's worden gedetecteerd onder een regelmatige microscoop met behu...

Discussie

Cytoplasmvervangingstherapie zoals voorgesteld in dit manuscript heeft unieke voordelen ten opzichte van andere gerapporteerde benaderingen zoals gen-, moleculaire- en celtherapie. PMV's gegenereerd uit BMSC's bevatten niet alleen de producten van stamcelgenen, maar ook intacte cellulaire organellen, die essentieel zijn om de verouderingsverschijnselen geassocieerd met veroudering te verhelpen. Wanneer jong cytoplasma wordt geleverd aan verouderde cellen, kunnen de slecht functionerende mechanismen een korte opluchting k...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
IsoporeTM-membranes	Millipore	TSTP04700	3 mm pore
Wegwerp filterunit	Xinya, Shanghai, China	25 mm	Medische kwaliteit polypropyleen
Insulinspuit	BD	328446	1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	Molecular Probes	M7514	Green FM, 1 μM
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75.000
Fluorescentiemicroscoop	Nikon	Eclipse TE 2000	Met CCD-camera
Confocol-microscoop	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	Voor celtransfectie