Method Article

Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We rapporteren twee celsynchronisatieprotocollen die een context bieden voor het bestuderen van gebeurtenissen die verband houden met specifieke fasen van de celcyclus. We tonen aan dat deze aanpak nuttig is voor het analyseren van de regulering van specifieke genen in een ongeblokkeerde celcyclus of bij blootstelling aan agens die de celcyclus beïnvloeden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het genuitdrukkingsprogramma van de celcyclus is een kritische stap voor het begrijpen van celcyclusafhankelijke processen en hun rol in ziekten zoals kanker. Celcyclus-gereguleerde genexpressie analyse hangt van celsynchronisatie in specifieke fasen af. Hier beschrijven we een methode die gebruik maakt van twee complementaire synchronisatieprotocollen die vaak gebruikt worden voor het bestuderen van periodieke variatie van genuitdrukking tijdens de celcyclus. Beide procedures zijn gebaseerd op het voorbijgaande blokkeren van de celcyclus in een bepaald punt. Het synchronisatieprotocol door hydroxyurea (HU) -behandeling leidt tot cellulaire arrestatie in de late G1 / early S-fase, en vrijlating van HU-gemedieerde arrestatie zorgt ervoor dat een cellulaire populatie uniform door S en G2 / M vordert. Het synchronisatieprotocol door thymidine en nocodazol (Thy-Noc) behandeling blokkeert cellen in de vroege mitose, en vrijlating uit Thy-Noc gemedieerde arrestatie levert een gesynchroniseerde cellulaire populatie geschikt voor G1 fase en S fase-enProbeer studies. Toepassing van beide procedures vereist het controleren van de celcyclusverdelingsprofielen, die typisch worden uitgevoerd na propidiumjodide (PI) kleuring van de cellen en flowcytometrie gemedieerde analyse van DNA-inhoud. We laten zien dat het gecombineerde gebruik van twee synchronisatieprotocollen een robuuste aanpak is om de transcriptieprofielen van genen die in de celcyclus anders gereguleerd zijn, duidelijk te bepalen ( dwz E2F1 en E2F7) en dus beter inzicht te krijgen in hun rol in celcyclus processen. Verder tonen wij aan dat deze aanpak nuttig is voor het bestuderen van mechanismen die gebaseerd zijn op geneesmiddelen gebaseerde therapieën ( dwz mitomycine C, een anticancer agent), omdat het het mogelijk maakt genen die reageren op het genotoxische middel te discrimineren van diegenen die alleen door celcyclusverstoringen worden beïnvloed Opgelegd door de agent.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overgang door alle fasen van de celcyclus wordt gekoppeld aan een strak gereguleerd genuitdrukkingsprogramma. Deze gecoördineerde "aan en uit" van gentranscriptie gedurende de celcyclus wordt geacht onder controle te zijn van complexe transcriptie regulerende systemen, die niet alleen de timing reguleren, maar ook de niveaus van genuitdrukking. Deregulatie van belangrijke celcycluscomponenten is bekend om bij te dragen tot de ontwikkeling van verschillende aandoeningen en is een goed gevestigd kenmerk van tumorigenese 1 , 2 . Genoom-brede transcriptomische analyses uitgevoerd in gist- en zoogdiercellen hebben aangetoond dat een groot aantal genen periodieke genuitdrukkingspatronen in de celcyclus vertoont, wat aangeeft dat transcriptieve fluctuaties tijdens de celcyclus een afspiegeling vormen van de tijdelijke vereiste van een gegeven genproduct In een precieze fase 3 , 4 , 5 .

Een belangrijke taak in de studie van celcyclusreguleerde genuitdrukking is de synchronisatie van cellen in specifieke celcyclusfasen. Cellsynchronisatie helpt de associatie van een genuitdrukkingspatroon te interpreteren met een bepaalde cyclusfaseovergang, en het heeft geleid tot een beter inzicht in de regulering en functie van talrijke genen. Cellsynchronisatie is ook belangrijk voor het bestuderen van het werkingsmechanisme van anticancermiddelen, omdat chemotherapeutische middelen bekend zijn om zowel de genuitdrukking als de celcycluskinetiek 6 , 7 te beïnvloeden. Niettemin is het vaak moeilijk om te bepalen of genuitdrukkingsverschillen die voortvloeien uit de behandeling met deze middelen een directe reactie op de behandeling zijn of gewoon het gevolg zijn van veranderingen in celcyclusprofielen. Om te onderscheiden tussen deze mogelijkheden, moet genuitdrukking worden geanalyseerd in cellen die s zijn geweestGechronchroniseerd voorafgaand aan toevoeging van het chemotherapeutische geneesmiddel.

Met uitzondering van enkele primaire cellen, zoals vers geïsoleerde lymfoïde cellen, die een homogene celpopulatie vormen die gesynchroniseerd zijn in G08, groeien in vitro gevestigde cellijnen asynchroon in cultuur. Onder regelmatige groeivoorwaarden worden deze asynchrone cyclische cellen gevonden in alle fasen van de celcyclus, maar bij voorkeur in G1 9 . Daarom biedt deze context geen optimaal scenario voor functionele of genexpressieanalyses in een specifieke celcyclusfase (bijvoorbeeld G1, S, enz.). Niet-getransformeerde immortalized cellijnen ( bijv. Fibroblasten) kunnen worden gesynchroniseerd met zogenaamde fysiologische methoden 10 . Deze methoden zijn gebaseerd op de bewaarde primaire celkenmerken van niet-getransformeerde cellen, zoals celcontact remming en afhankelijkheid van de groeifactor om verder te gaan fietsen. VerwijderingVan serum in combinatie met contactinhibitie maakt niet-getransformeerde cellen gearresteerd bij G0 / G1. Echter, de gesynchroniseerde celcyclusinvoer en de progressie vereisen vaak subcultuur, die ook kunstmatige loslating van de cellen inhoudt en opnieuw opbouwt 10 . Belangrijker nog, deze methode is niet geschikt voor synchronisatie van getransformeerde cellijnen, de overgrote meerderheid van gevestigde cellijnen die momenteel in gebruik zijn, gekenmerkt door het ontbreken van celcontact gemedieerde groei remming of respons op groeifactor onttrekking. Zo is het duidelijk dat alternatieve methoden nodig zijn voor efficiënte celsynchronisatie in specifieke fasen van de celcyclus. In het algemeen zijn de meest gebruikte synchronisatiemethoden gebaseerd op transiënte chemische of farmacologische remming van een bepaald punt van de celcyclus, typisch DNA synthese of mitotische spindelvorming. Inhibitie van DNA-synthese synchroniseert cellen door ze in de late G1 of vroege S-fase te arresteren. Dit kan achi zijnDoor middel van toevoeging van verbindingen zoals mimosine, een inhibitor van nucleotidebiosynthese 11 , 12 , aphidicoline, een inhibitor van DNA-polymerasen 13 , 14 , hydroxyureum, een inhibitor van ribonucleotide reductase 15 , 16 of door overmaat hoeveelheden thymidine 17 , 18 . Aan de andere kant kunnen remmers van microtubule-polymerisatie, zoals colchicine of nocodazol, de mitotische spindelvorming blokkeren, wat leidt tot cellynchronisatie in de vroege M-fase 19 , 20 , 21 .

In dit werk beschrijven wij een methode waarbij twee complementaire synchronisatieprotocollen zijn gebaseerd op transiënte chemische remming voor het bestuderen van de expressie van celcyclusreguleerde genen bij het mRNAniveau. Deze methode is essentieel voor het bepalen van de rol van celcyclusgenen in specifieke celcyclusprocessen. Bovendien biedt het een algemeen kader voor het bestuderen van de impact van anticancerbehandelingen om nauwkeurig medicijnresponsieve genen te detecteren en misinterpretaties af te leiden die zijn afgeleid van verstoringen in de celcyclusprogressie die door deze medicijnen wordt gegenereerd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cellulaire synchronisatie, vrijlating en bewaking van de celcyclusprogressie

  1. Thymidine- en nocodazol-gebaseerde (Thy-Noc) synchronisatie en afgifte van U2OS-cellen uit Mitosis
    1. Bereid het vereiste celcultuurmedium op. U2OS-cellen worden routinematig gegroeid in DMEM-Glutamine-medium aangevuld met 10% (vol / vol) FBS (optioneel: 1% penicilline / streptomycine). Voer alle medium voorbereiding en manipulatie onder steriele omstandigheden en opgewarmd aangevuld medium (vanaf nu wel aangeduid als "compleet medium") tot 37 ° C voor gebruik.
    2. Zaad 2 x 10 6 U2OS cellen per 100 mm schotel in 10 ml compleet kweekmedium. Om het aantal benodigde gerechten te berekenen, rekening houdend met het feit dat elke 100 mm schotel meestal genoeg mitotische cellen biedt om ongeveer 5 putjes van een 6-putjesplaat (0,2 - 0,25 x 10 6 cellen / putje) te platen (zie figuur 1B ). Twee putten per geselecteerd tijdstip zijn requirEd in het experiment (1 putje voor RNA-extractie en 1 putje voor celcyclusmonitoring). Bovendien kan een derde put verzameld worden per tijdspunt voor eiwitanalyse.
      OPMERKING: Plate cellen in de avond (rond 7 uur), zodat volgende stappen kunnen worden uitgevoerd tijdens de werkuren de volgende dagen. Inclusief 2 aanvullende putten van asynchroongroeiende cellen om FACS analyse compensatie instellingen te definiëren.
    3. Laat de cellen bevestigen door 100 mm gerechten bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO 2 gedurende 24 uur te incuberen.
    4. Voor het thymidine blok bereidt u een 200 mM thymidine voorraadoplossing door 145,2 mg thymidine poeder in 3 ml H20 (of equivalente hoeveelheden) op te lossen en de oplossing door filtratie te steriliseren door een 0,2 μm poriegrootte filter. Lichte opwarming kan helpen om thymidine op te lossen. Voeg 100 μl van de vers bereide 200 mM voorraad aan elke 100 mm kweekschotel (eindconcentratie 2 mM). Incubeer cellen met thymidine gedurende 20 uur bij 3776; C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
      OPMERKING: Behandel de cellen in de avond (rond 7 uur), om de volgende dag de tijd te hebben om zowel de thymidine vrijgave als de nocodazol te blokkeren.
    5. Om vrij te maken van het thymidine blok, verwijder het thymidine bevattende groeimedium in de middag de volgende dag (3 uur); Wascellen tweemaal met voorverwarmde 1x PBS en voeg 10 ml volledig medium toe aan elke 100 mm schotel. Incubeer cellen gedurende 5 uur bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
    6. Voeg voor mitotische celarrest nocodazol toe tot een eindconcentratie van 50 ng / ml (8 uur). Bereid een voorraadoplossing door het oplossen van nocodazolpoeder in DMSO ( bijv. 5 mg / ml) en opberg-bevroren bij -20 ° C. Incubeer cellen met nocodazol gedurende 10-11 uur bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
    7. Vrijkomen van nocodazol-gemedieerde arrestatie in vroege M-fase (mitotische shake-off) en verzameling van monsters op verschillende tijdstippenNts (vanaf 6-7 uur).
      1. Maak afgeronde (mitotische) cellen los door elke plaat te schudden en zorgvuldig pipetiseren van nocodazol-bevattend groeimedium. Verzamel medium met losstaande cellen van elke 100 mm plaat in 50 ml steriele buizen, centrifuge (300 xg, 5 min, kamertemperatuur (RT)) en wascellen twee keer door 1x PBS toe te voegen, gevolgd door centrifugeren. Het gebruik van koude PBS of PBS plus nocodazol wordt aanbevolen om mitotische slippen te vermijden (zie discussie sectie).
      2. Resuspende mitotische cellen verzameld uit elke 100 mm plaat in 10 ml volledig medium. Bespaar 2 ml voor RNA-extractie en 2 ml voor FACS-analyse voor het 0 h tijdspunt (ongeveer 0,2-0,25 x 10 6 cellen per monster).
      3. Herplaatst de resterende mitotische cellen voor de volgende tijdspunten in platen met 6 putjes (2 ml / putje, 0,2-0,25 x 10 6 cellen / putje).
        OPMERKING: Onthoud dat 2 putten nodig zijn per geselecteerd tijdspunt (1 voor RNA en 1 voor FACS analyse).
    8. Verzamel monsters op selGeëtiketteerde tijdspunten. Elke 1,5 tot 3 uur wordt aanbevolen om een ​​adequaat profiel van de celcyclusprogressie te verkrijgen.
      1. Voor RNA-extractie, verwijder medium, spoel goed af met 2 ml pre-warm 1x PBS en voeg 1 ml geschikt RNA-isolatiereagens ( bijv. TRIzol) in de put (voer deze laatste stap in een veiligheidskast voor chemicaliën). Pipet omhoog en omlaag om loslaten en lijscellen over te brengen, cellysaat over te brengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis, incubatie 5 minuten bij kamertemperatuur en bewaarbuis bij -80 ° C tot verder gebruik.
      2. Voor FACS analyse, spoel goed met 2 ml pre-warm 1x PBS, voeg de voorverwarmde Trypsin-EDTA oplossing (0,3 ml / putje) toe om de cellen los te maken, blokkeer Trypsin-EDTA door 1 ml volledig medium op te nemen en elk monster in een aparte 15 ml buis.
        1. Centrifuge cellen (300 xg, 5 min, RT), bespaar cellulair pellet en verwerp supernatant. Om cellen op te lossen, cellen opnieuw in 1 ml gekoelde 70% (v / v) ethanol in 1x PBS door zachtjes vortexerende buizen te plaatsen en op ijs voor app plaatsenOngeveer 15 minuten voor het opslaan bij 4 ° C of om te kleuren voor verdere analyse door FACS (beschreven in stappen 1.4 - 1.5).
  2. HU-gebaseerde synchronisatie en vrijgave van U2OS-cellen uit G1 / S-grens
    1. Bereid volledig celcultuurmedium op zoals beschreven in stap 1.1.
    2. Zaai 0,25 x 106 U2OS cellen per putje in 6 putjes platen (2 ml compleet kweekmedium per putje). Voor het berekenen van het aantal bronnen dat nodig is voor het experiment, moet u er rekening mee houden dat 2 putten nodig zijn per geselecteerd tijdspunt (1 goed voor RNA-extractie en 1 putje voor celcyclusmonitoring) en dat 2 additionele putjes van asynchroongroeiende cellen zijn Nodig om FACS analyse compensatie instellingen te definiëren.
    3. Laat cellen bevestigen door 6-putjes platen overnacht (O / N) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO 2 te incuberen.
    4. Verwijder het volledige medium uit de putjes de volgende ochtend en voeg 2 ml toeVan voorverwarmd FBS-vrij DMEM-Glutamine medium per putje. Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
      OPMERKING: Voer deze stap uit in alle bronnen behalve 2 (die zijn opgeslagen om FACS-instellingen te definiëren). Serum-terugtrekkingsstap kan worden weggelaten als efficiënte synchronisatie wordt bereikt door simpelweg incubatie van cellen met HU.
    5. G1 / S celcyclus arrestatie met HU.
      1. Bereid verse HU voorraadoplossing (500 mM) voor elk gebruik. Voeg 2 ml H 2 O tot 76.06 mg HU poeder toe en meng tot het grondig opgelost is. Steriliseer de oplossing door filtratie door een 0,2 μm poriëngrootte filter. Meng 50 ml volledig medium met 400 μL filtersteriliseerde HU-voorraadoplossing voor een uiteindelijke HU-concentratie van 4 mM.
      2. Verwijder medium uit alle putjes, behalve van de 2 putjes die nodig zijn voor het bepalen van FACS-instellingen en vervang met een vers bereid 4 mM HU-compleet medium (2 ml / putje).
      3. Incubeer cellen gedurende 24 uur inHU-bevattend medium bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
    6. Vrijlating van cellen van HU-gemedieerde arrestatie. HU-bevattend medium verwijderen uit putjes en spoelt de putjes tweemaal met voorverwarmde 1x PBS (2 ml per keer). Voeg 2 ml volledig medium per put toe. Verzamel 2 monsters voor het 0 h tijdspunt (1 voor RNA-extractie en 1 voor celcyclus arrestatie verificatie door FACS), evenals 2 monsters opgeslagen voor FACS instellingen. Plaats resterende putjes in de incubator.
    7. Verzamel monsters elke 1,5 tot 3 uur om een ​​adequate verdeling van de celcyclusprogressie te verkrijgen. Op elk tijdstip uitvoeren monsterverwerking (voor RNA-extractie en voor FACS-analyse) zoals beschreven in 1.1.8.1-1.1.8.2.
  3. Behandeling met DNA beschadigende middelen
    OPMERKING: Wanneer het doel is om het effect van een verbinding (bijvoorbeeld DNA-schadelijke stoffen) in celcyclusgebeurtenissen te verklaren, kan elk van de eerder beschreven synchronisatiemethoden wordenGecombineerd met de behandeling van cellen met het genotoxische middel. Om de synchronisatiemethode te selecteren, is het belangrijk om de fase van de celcyclus te overwegen die we zouden willen analyseren. In het algemeen kan Thy-Noc-procedure geschikt zijn om het effect van een verbinding in G1-fase of S-fase-invoer te onderzoeken, terwijl HU-gemedieerde synchronisatie meer geschikt kan zijn om de impact in S tot G2 fases of in de toegang tot mitose te bestuderen.
    1. Analyse van het effect van genotoxische middelen in fase G1 of S fase
      1. Synchroniseer cellen zoals beschreven in 1.1.2. Naar 1.1.6.
      2. Laat cellen uit nocodazol los en plaats ze opnieuw zoals beschreven in 1.1.7. Incubeer hen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende 3 uur om ze te laten vallen voor het toevoegen van een middel (de benodigde incubatieperiode kan variëren afhankelijk van de cellijn).
      3. Voeg agent toe en verzamel monsters zoals eerder beschreven in 1.1.8.
    2. Analyse van het effect van genotoxische stoffen in SG2 fasen of M-ingang
      1. Synchroniseer cellen zoals beschreven in 1.2.2. Naar 1.2.5.
      2. Laat cellen uit HU vrij, zoals beschreven in 1.2.6. En voeg onmiddellijk een agent toe.
      3. Verzamel monsters zoals eerder beschreven in 1.8.
  4. Monitoring van celsynchronisatie en progressie door de celcyclus door propidiumjodide (PI) kleuring en FACS analyse
    OPMERKING: Monsters die op alle tijdstippen zijn verzameld, samen met die welke nodig zijn om FACS-instellingen te definiëren, kunnen bij 4 ° C worden opgeslagen nadat ze zijn vastgesteld (zoals vermeld in 1.1.8.2). Vervolg met PI-oplossing, gevolgd door FACS-analyse voor alle monsters van het experiment gelijktijdig. PI intercalateert in de hoofdgroef van dubbelstrengs DNA, dat een zeer fluorescerend signaal produceert wanneer het op 535 nm wordt opgewekt met een brede emissiepiek rond 600 nm. Aangezien PI ook kan binden aan dubbelstrengs RNA, is het nodig om de cellen te behandelen met RNase voor optimale DNA-resolutie.
    1. Bereid vers bereide PI-kleuring op. Een PI-voorraadoplossing kan worden bereid door PI-poeder in PBS op te lossen ( bijv. 5 mg / ml). Bewaar de voorraadoplossing bij 4 ° C (in het donker). Vlekoplossing bestaat uit PI (140 μM), natriumcitraat (38 mM) en Triton X-100 (0,01% v / v).
    2. Maak een geschikt oppervlak ( bijv. Oven) op tot 37 ° C.
    3. Centrifugeer vaste cellen (450 x g, 5 min, RT), dekante supernatant (ethanol) en wrijf eenmaal met 1x PBS.
    4. Centrifugeer cellen opnieuw, verwijder PBS en voeg 300 μL PI-kleurseloplossing per monster toe (behalve op een van de monsters voor FACS-instellingen, voeg PBS toe aan dit monster in plaats daarvan).
    5. Overdracht cellen naar FACS Tubes (5 ml ronde bodem polystyreen buizen).
    6. Voeg 1 μL RNase A toe aan elk monster, meng en incubeer de monsters gedurende 30 minuten in de duisternis bij 37 ° C. Monsters kunnen voor maximaal 2 tot 3 dagen beschermd worden tegen licht bij 4 ° C.
    7. Analyseer DNA-gehalte in de monsters door de stroomcytometrie. Definieer FACS analyse compensatie instellingen met PI-gekleurde asynchrone steekproef. Gebruik blanco monster (zonder PI-vlekoplossing) om te controleren op autofluorescentie. Basis van PI-kleuring gemedieerde analyse van DNA-inhoud door flowcytometrie is eerder beschreven 9 .
  5. Bepaling van de mitotische index door dubbel fosfo-H3 (Ser 10) / PI-kleuring
    OPMERKING: Cellen die mitose ondergaan kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door flowcytometrie met antilichamen die specifiek zijn voor fosforhiston H3 in serine 10 (pH3). Een gelijktijdige PI-kleuring is handig om vast te stellen op basis van DNA-inhoud op basis van de celpopulatie. Er zijn 5 monsters nodig voor de optimale configuraties van FACS-instellingen: blanco, alleen PI, alleen pH3, alleen secundaire antilichaam en dubbele kleuring.
    1. Centrifugeer vaste cellen (450 xg, 5 min, 4 ° C) en verwijder supernatant. De volgende stappen worden beschreven om vlekken in 15 ml buizen uit te voeren.
    2. Wascellen door 1 toe te voegenMl PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) aan de pellet en centrifuge (450 xg, 5 min, 4 ° C). Verwijder supernatant.
    3. Voeg anti-pH3 antilichaam verdund (1: 500) in 100-200 μL PBS-T + 3% BSA toe en incubeer met 2 uur schudden bij RT (of O / N bij 4 ° C).
    4. Voeg 2 ml PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) en centrifuge (450 xg, 5 min, 4 ° C) toe. Verwijder supernatant.
    5. Wassen nogmaals door 2 ml PBS-T aan de pellet toe te voegen, centrifugeer en weggooien supernatant.
    6. Voeg secundair antilichaam (anti-konijn AlexaFluor 488 toe in het geval van geselecteerd pH3-antilichaam) verdund (1: 500) in 100-200 μl PBS-T + 3% BSA en incubeer met 1 uur schudden bij RT (of O / N Bij 4 ° C). Bescherm monsters tegen licht.
    7. Was tweemaal met PBS-T (2 ml) door centrifugeren zoals beschreven in stap 1.5.4.
    8. Voer PI-kleuring uit zoals beschreven (stappen 1.4.1 tot 1.4.6).

2. Sample Collection en Processsing voor Gene Expression Analysis

  1. Nemen1,5 ml microcentrifuge monsters in het RNA isolatie reagens uit de vriezer en laten ze bij RT in een veiligheidskast voor chemicaliën ontdooien.
  2. Voeg 400 μl chloroform aan elk monster toe en schud krachtig (maar niet vortex) tot volledig mengen. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij RT.
  3. Centrifugeerbuizen gedurende 15 minuten (≥8000 xg, 4 ° C) in een micro-centrifugebuisje.
  4. Breng de waterige (bovenste) fase over naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en registreer het overgebrachte volume (om de procedure te vereenvoudigen, wordt aanbevolen om gelijke volumes in alle monsters van het experiment te verzamelen).
  5. Voeg 1 volume 100% ethanol langzaam (druppel per druppel) toe aan de waterfase tijdens het mengen. Centrifugeer niet.
  6. Voer de volgende stappen uit met de commerciële RNA mini prep kit. Pipet tot 700 μL van elk monster, met inbegrip van eventuele neerslag dat kan hebben gevormd, in een spin kolom in een 2 ml collectibuis (verstrekt door de fabrikant).
  7. Sluit deDeksel en centrifuge (≥ 8000 g, RT) gedurende 15 s. Weggooi de doorstroom. Herhaal de vorige stap met het resterende monster (indien aanwezig).
  8. Volg de instructies van de fabrikanten voor RNA-wassen en elueren (eluteer elk monster in 30-40 μl nuclease-vrij H 2 O om een ​​geschikte RNA-concentratie voor de volgende stap te bereiken).
  9. Bepaal RNA-concentratie en zuiverheid van monsters door absorptiemetingen (een A 260/280 verhouding van 2,0-2,1 duidt op een goede zuiverheid van het RNA-monster). Bewaar RNA-monsters bij -80 ° C tot gebruik voor RT-qPCR analyse.
  10. Voor RNA conversie in cDNA en daaropvolgende kwantitatieve PCR, neem 1 μg RNA per monster en berei retrotranscriptase reactie volgens de instructies van de fabrikanten. De verkregen cDNA-monsters kunnen bij een temperatuur van 4 ° C (gedurende een paar dagen) of bij -20 ° C (gedurende langere tijd) worden opgeslagen.
    OPMERKING: Voorbeeldbereiding, primerontwerp en andere overwegingen voor real-time-PCR zijn exStevig beschreven in de literatuur 22 , 23 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematische weergave van Thy-Noc en HU-gebaseerde protocollen voor celsynchronisatie.

Figuur 1 geeft een samenvatting van de stappen die nodig zijn voor de U2OS-celsynchronisatie en de daaropvolgende monsterversameling om verificatie door de celcyclus te verifiëren en genuitdrukkingsanalyses uit te voeren.

Phospho-H3 en PI-kleuring zijn goede evaluatiepa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse van fine-tuned gereguleerde genen die betrokken zijn bij transiënte en specifieke rollen in de celcyclus vereist een uniforme celpopulatie. Veel onderzoekers gebruiken hiervoor langdurige tumorcellijnen voor deze doeleinden, en een verscheidenheid aan methoden zijn ontwikkeld om synchrone (of gedeeltelijk synchrone) celpopulaties te verkrijgen, met het doel om zoveel mogelijk cellen op te bouwen in gedefinieerde celcyclusfasen. Bovendien zijn er veel inspanningen geleverd om de gevestigde synchronisatiebenaderin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de leden van de Zubiaga en de Altmeyer laboratoria voor hulpvaardige discussies en voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Spaanse ministerie (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), de Baskische regering (IT634-13 en KK-2015/89) en de Universiteit van Baskenland UPV / EHU UFI11 / 20).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, high glucose, GutaMAX supplementThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, gekwalificeerd, E.U.-goedgekeurd, Zuid-Amerikaanse oorsprongThermo Fisher Scientific10270-106
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0,25% Trypsine-EDTA (1x), fenol roodThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidineSIGMAT1895-5GVers bereid. Lichte verwarming kan helpen thymidine op te lossen.
NocodazoleSIGMAM-1404Staoplossing in DMSO bewaard bij -20 ºC in kleine aliquoten
HydroxyureumSIGMAH8627Vers bereid
Mitomycin C uit Streptomyces caespitosusSIGMAM42871,5 mM staoplossing in steriel H2O beschermd tegen licht en bewaard bij 4 ºC
DimethylsulfoxideSIGMAD2650
PropidiumjodideSIGMAP4170Staoplossing in steriel PBS bij 5 mg/ml, bewaard bij 4 ºC beschermd tegen licht.
PBS pH 7.6Zelfgemaakt
EthanolPANREACA3678,2500
ChloroformSIGMAC2432
NatriumcitraatPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAse AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReagentLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcriptase KitThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 antilichaamCell Signaling41291:1000 verdunning in 5% melk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antilichaamCell Signaling41351:1000 verdunning in 5% melk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actineSIGMAA-54411:3000 verdunning in 5% melk, 1 uur, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antilichaamMillipore06-570Gespecificeerd in het protocol
Secundair anti-konijn AlexaFluor 488 antilichaamInvitrogenR37116Gespecificeerd in het protocol
Secundair anti-muis-HRP antilichaamSanta Cruz Biotechnologysc-36971:3000 verdunning in 5% melk, 1 uur, RT
Forward E2F1 antilichaam (mens)                    TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antilichaam (mens)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antilichaam (mens)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antilichaam (mens)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antilichaam (mens)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antilichaam (mens)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antilichaam (mens) referentiegen                    BiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antilichaam (mens)                    BiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antilichaam (mens) referentiegen    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                   BiolegioOntworpen door PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antilichaam (mens)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG   

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
  4. Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
  5. Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
  6. Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
  7. McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
  8. Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
  9. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
  10. Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
  11. Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
  12. Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
  13. Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
  14. Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
  15. Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
  16. Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
  17. Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
  18. Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
  19. Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
  20. Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
  21. Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
  22. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  23. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
  24. Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
  25. Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
  26. Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
  27. Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
  28. Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
  29. Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
  30. Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
  31. Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
  32. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  33. Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
  34. Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
  35. Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
  36. Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
  37. Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
  38. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  39. St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
  40. Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles