Method Article

Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We rapporteren twee celsynchronisatieprotocollen die een context bieden voor het bestuderen van gebeurtenissen die verband houden met specifieke fasen van de celcyclus. We tonen aan dat deze aanpak nuttig is voor het analyseren van de regulering van specifieke genen in een ongeblokkeerde celcyclus of bij blootstelling aan agens die de celcyclus beïnvloeden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het genuitdrukkingsprogramma van de celcyclus is een kritische stap voor het begrijpen van celcyclusafhankelijke processen en hun rol in ziekten zoals kanker. Celcyclus-gereguleerde genexpressie analyse hangt van celsynchronisatie in specifieke fasen af. Hier beschrijven we een methode die gebruik maakt van twee complementaire synchronisatieprotocollen die vaak gebruikt worden voor het bestuderen van periodieke variatie van genuitdrukking tijdens de celcyclus. Beide procedures zijn gebaseerd op het voorbijgaande blokkeren van de celcyclus in een bepaald punt. Het synchronisatieprotocol door hydroxyurea (HU) -behandeling leidt tot cellulaire arrestatie in de late G1 / early S-fase, en vrijlating van HU-gemedieerde arrestatie zorgt ervoor dat een cellulaire populatie uniform door S en G2 / M vordert. Het synchronisatieprotocol door thymidine en nocodazol (Thy-Noc) behandeling blokkeert cellen in de vroege mitose, en vrijlating uit Thy-Noc gemedieerde arrestatie levert een gesynchroniseerde cellulaire populatie geschikt voor G1 fase en S fase-enProbeer studies. Toepassing van beide procedures vereist het controleren van de celcyclusverdelingsprofielen, die typisch worden uitgevoerd na propidiumjodide (PI) kleuring van de cellen en flowcytometrie gemedieerde analyse van DNA-inhoud. We laten zien dat het gecombineerde gebruik van twee synchronisatieprotocollen een robuuste aanpak is om de transcriptieprofielen van genen die in de celcyclus anders gereguleerd zijn, duidelijk te bepalen ( dwz E2F1 en E2F7) en dus beter inzicht te krijgen in hun rol in celcyclus processen. Verder tonen wij aan dat deze aanpak nuttig is voor het bestuderen van mechanismen die gebaseerd zijn op geneesmiddelen gebaseerde therapieën ( dwz mitomycine C, een anticancer agent), omdat het het mogelijk maakt genen die reageren op het genotoxische middel te discrimineren van diegenen die alleen door celcyclusverstoringen worden beïnvloed Opgelegd door de agent.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overgang door alle fasen van de celcyclus wordt gekoppeld aan een strak gereguleerd genuitdrukkingsprogramma. Deze gecoördineerde "aan en uit" van gentranscriptie gedurende de celcyclus wordt geacht onder controle te zijn van complexe transcriptie regulerende systemen, die niet alleen de timing reguleren, maar ook de niveaus van genuitdrukking. Deregulatie van belangrijke celcycluscomponenten is bekend om bij te dragen tot de ontwikkeling van verschillende aandoeningen en is een goed gevestigd kenmerk van tumorigenese 1 , 2 . Genoom-brede transcriptomische analyses uitgevoerd in gist- en zoogdiercellen hebben....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cellulaire synchronisatie, vrijlating en bewaking van de celcyclusprogressie

  1. Thymidine- en nocodazol-gebaseerde (Thy-Noc) synchronisatie en afgifte van U2OS-cellen uit Mitosis
    1. Bereid het vereiste celcultuurmedium op. U2OS-cellen worden routinematig gegroeid in DMEM-Glutamine-medium aangevuld met 10% (vol / vol) FBS (optioneel: 1% penicilline / streptomycine). Voer alle medium voorbereiding en manipulatie onder steriele omstandigheden en opgewarmd aangevuld medium (vanaf nu wel aangeduid als "compleet medium") tot 37 ° C voor gebruik.
    2. Zaad 2 x 10 6 U2OS cellen per 100 mm schotel in 10 ml compleet kweekmedium....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematische weergave van Thy-Noc en HU-gebaseerde protocollen voor celsynchronisatie.

Figuur 1 geeft een samenvatting van de stappen die nodig zijn voor de U2OS-celsynchronisatie en de daaropvolgende monsterversameling om verificatie door de celcyclus te verifiëren en genuitdrukkingsanalyses uit te voeren.

Phospho-H3 en PI-kleuring zijn goede evaluatiepa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse van fine-tuned gereguleerde genen die betrokken zijn bij transiënte en specifieke rollen in de celcyclus vereist een uniforme celpopulatie. Veel onderzoekers gebruiken hiervoor langdurige tumorcellijnen voor deze doeleinden, en een verscheidenheid aan methoden zijn ontwikkeld om synchrone (of gedeeltelijk synchrone) celpopulaties te verkrijgen, met het doel om zoveel mogelijk cellen op te bouwen in gedefinieerde celcyclusfasen. Bovendien zijn er veel inspanningen geleverd om de gevestigde synchronisatiebenaderin.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de leden van de Zubiaga en de Altmeyer laboratoria voor hulpvaardige discussies en voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Spaanse ministerie (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), de Baskische regering (IT634-13 en KK-2015/89) en de Universiteit van Baskenland UPV / EHU UFI11 / 20).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, high glucose, GutaMAX supplementThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America originThermo Fisher Scientific10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol redThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidineSIGMAT1895-5GFreshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
NocodazoleSIGMAM-1404Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
HydroxyureaSIGMAH8627Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosusSIGMAM42871.5 mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4 ºC
Dimethyl sulfoxideSIGMAD2650
Propidium iodideSIGMAP4170Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4 º C protected from light.
PBS pH 7.6Home made
EthanolPANREACA3678,2500
ChloroformSIGMAC2432
Sodium CitratePANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAse AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReagentLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 antibodyCell Signaling41291:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibodyCell Signaling41351:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actinSIGMAA-54411:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibodyInvitrogenR37116Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibodySanta Cruz Biotechnologysc-36971:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene                    BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)                    BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC-Treated Culture DishCorning
Corning Costar cell culture plates 6 wellCorning3506
Refrigerated Bench-Top MicrocentrifugeEppendorf5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite SpectrophotometerThermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow CytometerBD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA28567

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles